常見熱殺菌方式對關中羊乳品質的影響

張 穎,閆慧明,彭德舉,何亮亮,曹 煒,*

(1.西北大學食品科學與工程學院,陜西西安 710069;2.寶雞眾羊生態牧業有限公司,陜西寶雞 722400)

羊乳營養價值高、易于消化吸收且具有諸多保健功能,是公認比牛乳更接近人乳的營養佳品。我國是羊乳生產大國,2010年羊乳年產量達27.75萬噸,世界排名第13位(FAO統計數據)。關中奶山羊作為我國特有奶山羊品種,主要集中在陜西關中地區,占據了我國羊乳90%以上產量,羊乳產業已成為陜西第二大優勢和特色產業[1]。但目前市場上羊乳制品品類單一,主要以羊乳粉為主,在產品開發和基礎研究方面極其落后,嚴重制約了羊乳產業的快速發展。

乳在加熱時會發生一系列物理化學變化,如風味變化、營養物質損失、褐變、蛋白質變性、酸度、粘度、脂肪球大小等,從而對乳制品感官品質和穩定性產生影響[2-3]。與牛乳相比,羊乳對加熱更加敏感,穩定性差,在熱加工過程中尤其高溫處理下更容易出現變性、沉淀,成為制約液體羊乳尤其常溫長保質期液態羊乳生產的關鍵技術難題[4-6]。國內外學者對羊乳加熱過程已進行一定研究,張富新等[5]探究了不同因素對羊乳酪蛋白熱凝固時間的影響;趙麗麗[6]比較了65～137 ℃/7 s六種短時熱處理后羊乳酸度、粘度、乳清蛋白變性度、沉淀量和穩定性指數的差異;Pesic 等[7]分析了90 ℃/10 min加熱后羊乳中的熱誘導蛋白聚合物。然而,目前相關研究局限于幾種溫度工藝下的熱處理,羊乳在乳制品實際加工中常用熱殺菌條件處理下品質的變化規律尚未見系統比較。

因此,本研究采用乳品工業中5種常見熱殺菌方式,即低溫長時巴氏殺菌(65 ℃/30 min)、高溫短時巴氏殺菌(72 ℃/15 s)、超巴氏殺菌(95 ℃/5 min)、超高溫瞬時滅菌(137 ℃/7 s)和高溫高壓滅菌(121 ℃/20 min)處理關中羊乳,在測定羊乳蛋白沉淀率、酒精穩定性、pH、紅度值、粘度和脂肪球變化的基礎上,結合內源熒光光譜和聚丙烯酰胺凝膠電泳分析,探究熱加工對關中羊乳品質的影響,以期為液態羊乳加工技術研究和產品開發提供理論依據和技術指導。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

生鮮羊乳 寶雞眾羊生態牧業有限公司;低分子量蛋白質Marker(14.4～97.4 kDa) 北京索萊寶科技有限公司;丙烯酰胺、N,N-亞甲叉雙丙烯酰胺、十二烷基硫酸鈉、三羥甲基甲烷、甘氨酸、硝酸銀、無水碳酸鈉、乙二胺四乙酸二鈉等 均為國產分析純。

HH-S4電熱恒溫水浴鍋 北京科偉永興儀器有限公司;GYB60-6s高壓均質機 上海東華高壓均質機廠;HWCL-3油浴鍋 鄭州長城科工貿有限公司;DSX-280KB24高壓殺菌鍋 上海申安醫療器械廠;Five Easy Plus pH計 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;DYCZ-24雙垂直蛋白電泳儀 北京六一儀器廠;BK-FL2熒光顯微鏡 奧特光學有限公司;NDJ-5S旋轉粘度計 上海昌吉地質儀器有限公司;Infinite M200PRO酶標儀 瑞士TECAN公司;NS800分光測色計 深圳三恩馳科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 羊乳的預處理及熱殺菌處理 生鮮羊乳驗收合格后(符合國標GB19301-2010,其中蛋白含量3.05%,脂肪含量3.27%),對其進行真空冷凍干燥成粉末,于-18 ℃保存待用。實驗前稱取一定量羊乳凍干粉,與蒸餾水1∶7 (w/w)比例混合,40 ℃水浴30 min使之充分復原,然后進行高壓均質(均質溫度50～60 ℃;均質壓力一級20 MPa,二級5 MPa),再分別采用65 ℃/30 min、72 ℃/15 s、95 ℃/5 min、121 ℃/20 min和137 ℃/7 s 5種不同熱殺菌方式處理羊乳,殺菌結束后立即采用流動冷水將其冷卻至室溫,以未經殺菌處理的羊乳作為對照,待分析。

1.2.2 熱殺菌處理后羊乳蛋白沉淀率、酒精穩定性、pH、紅度值和粘度的測定

1.2.2.1 蛋白沉淀率的測定 參考趙麗麗[6]的方法測定羊乳蛋白沉淀率。空離心管質量記為m0,向離心管中加入10 mL熱殺菌處理后的羊乳樣品,稱其總質量,記為m1。于4 ℃下4000 r/min離心20 min,除去上層脂肪,吸出脫脂乳備用,倒置5～10 min后,再次稱其質量記為m2。羊乳離心沉淀率計算公式如下:

離心沉淀率(%)=(m2-m0)/(m1-m0)×100

式中:m0為空離心管質量,g;m1為離心管加乳樣質量,g;m2為離心管加底層沉淀質量,g。

1.2.2.2 酒精穩定性的測定 參考趙麗麗[6]的方法測定熱殺菌處理后羊乳的酒精穩定性。取1 mL羊乳樣品與1 mL不同濃度酒精(60%、68%和72%)混勻,室溫下在玻璃皿中觀察是否有絮凝沉淀。

1.2.2.3 pH的測定 在25 ℃下用pH計測定熱殺菌處理后的羊乳樣品的pH。

1.2.2.4 粘度的測定 取30 mL熱殺菌處理后的羊乳樣品放于測量杯中,選用粘度計0 # 轉子,在室溫(25 ℃)和剪切速率(60 r/min)下,測定樣品粘度,測量一次完畢后,旋轉30 °左右再進行第二次測量,共測定8次,取平均值為樣品粘度。

1.2.2.5 紅度值的測定 采用全自動測色儀測定熱殺菌處理后羊乳樣品的紅度值a*,使用前首先進行黑白校正,然后取10 mL樣品放于測量杯中進行測定,每次測定時羊乳樣品加入量保持一致。

1.2.3 羊乳脂肪球的顯微鏡觀察 參考孫琦[8]方法觀察羊乳脂肪球。取少許羊乳樣品于潔凈載玻片中央,蓋上蓋玻片,滴適量香柏油,置于1000×光學顯微鏡下觀察羊乳脂肪球大小和形態。

1.2.4 羊乳蛋白內源熒光光譜分析 參考李子超等[9]的方法,并進行適當修改,分析羊乳蛋白的內源熒光光譜。羊乳樣品脫脂后用pH7.0的磷酸鹽緩沖溶液稀釋20倍,然后取200 μL稀釋后的樣品,點樣在酶標儀熒光專用96孔黑板上,選取激發波長λex271 nm,手動增益值45,閃光數5次,步寬2 m,測定樣品在300～500 nm范圍的熒光發射光譜。

1.2.5 聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析 參考Chevallet等[10]方法進行羊乳蛋白SDS-PAGE分析。采用4%濃縮膠和12%分離膠,將不同熱殺菌羊乳脫脂后用蒸餾水稀釋15倍,與樣品緩沖液1∶1混合,沸水加熱3～5 min后,上樣8 μL。凝膠電泳電壓開始設定為80 V,待進入分離膠后調整為120 V。電泳結束后進行銀氨染色,終止顯色后拍照,并采用Qutity one軟件進行蛋白條帶光密度分析。

1.3 數據處理

試驗重復三次,采用SPSS 19.0軟件進行統計學顯著性分析,數據以平均值±標準偏差表示,且p<0.05認為存在差異顯著。

2 結果與分析

2.1 5種常見熱殺菌方式對羊乳蛋白沉淀率、酒精穩定性、pH、紅度值和粘度的影響

熱殺菌是乳品加工中不可或缺的關鍵環節,適宜的熱處理是保證乳制品流通中質量穩定和符合衛生標準的必要條件[3]。根據熱處理工藝參數不同,常見乳殺菌方式有低溫長時巴氏殺菌(65 ℃/30 min)、高溫短時巴氏殺菌(72～75 ℃/15 s)超巴氏殺菌(80～95 ℃/5～10 min)、高溫高壓滅菌(121 ℃/20 min)和超高溫瞬時滅菌(137～140 ℃/4～10 s)。

2.1.1 5種常見熱殺菌方式對羊乳蛋白沉淀率的影響 5種熱殺菌對羊乳蛋白沉淀率影響程度存在明顯差異,如表1所示。其中高溫短時巴氏殺菌(72 ℃/15 s)影響最小,蛋白沉淀率與未加熱相比增加不顯著(p>0.05);其次為低溫長時巴氏殺菌(65 ℃/30 min)、超巴氏殺菌(95 ℃/5 min)和超高溫瞬時滅菌(137 ℃/7 s),蛋白沉淀率與未加熱相比均顯著增加,但三者之間差異不顯著(p<0.05);而高溫高壓滅菌(121 ℃/20 min)則導致蛋白沉淀率最高。這表明熱處理強度越大,羊乳蛋白沉淀率越高,熱穩定性越低。Raynal-Ljutovac等[11]認為,加熱會引起羊乳酪蛋白膠束表面疏水性變化,這是改變羊乳熱穩定性的關鍵因素。另外,羊乳缺乏αs1-酪蛋白,使乳清中自由鈣離子含量較高,且羊乳蛋白粒度明顯大于牛乳,這些均導致羊乳蛋白比牛乳對熱更加敏感,經熱處理后沉淀率較高[4,6]。

表1 常見熱殺菌方式對羊乳蛋白沉淀率、酒精穩定性、pH、紅度值和粘度的影響Table 1 Effect of common thermal sterilization methods on centrifugal precipitation rate, alcohol stability,pH,color value and viscosity of goat milk

2.1.2 5種常見熱殺菌方式對羊乳酒精穩定性的影響 由表1可知,在60%酒精濃度下,酒精穩定性試驗均呈陰性,說明5種熱殺菌羊乳在60%酒精濃度下均穩定;在68%酒精濃度下,僅高溫高壓滅菌(121 ℃/20 min)沉淀明顯,說明高溫高壓滅菌羊乳在68%酒精濃度下不穩定;而在72%酒精濃度下,酒精穩定性均呈陽性,說明5種熱殺菌羊乳在72%酒精濃度下均不穩定。乳品加工中常用酒精穩定性試驗檢驗乳新鮮度,從而反應乳體系的穩定狀況,一般牛乳采用72%酒精、羊乳采用68%酒精來進行。研究認為,熱處理羊乳的酒精穩定性變化與加熱過程中酪蛋白水化作用和電荷變化有關[12-13]。本研究表明,羊乳的酒精穩定性隨著熱處理強度增大而顯著降低,高溫高壓滅菌對羊乳酒精穩定性破壞最大,蛋白沉淀率也最高,說明高溫高壓滅菌下羊乳內部穩定體系會發生顯著變化,可能預示著高溫高壓滅菌不適合于液態羊乳制品加工。

2.1.3 5種常見熱殺菌方式對羊乳pH、壓紅度值和粘度的影響 由表1也可看出,低溫長時巴氏殺菌(65 ℃/30 min)、低溫短時巴氏殺菌(72 ℃/15 s)、超巴氏殺菌(95 ℃/5 min)和超高溫瞬時滅菌(137 ℃/7 s)對羊乳pH和紅度值影響不顯著,而高溫高壓滅菌(121 ℃/20 min)則導致pH顯著下降、紅度值顯著增加(p<0.05),但5種殺菌工藝對粘度均沒有顯著影響(p>0.05)。加熱時,乳中可溶性鈣磷向膠體性鈣磷轉變、乳糖受熱降解、美拉德反應發生等,均可導致體系pH降低[14]。美拉德反應隨熱處理強度增大而加劇,尤其高溫條件下乳中發生美拉德反應的蛋白質種類以及蛋白質美拉德位點數均會大幅增加,褐變程度加劇,從而導致紅度值升高[15]。pH下降和紅度值增加預示著乳品質的變劣,本研究表明高溫高壓滅菌(121 ℃/20 min)對羊乳品質影響較大。

2.2 5種常見熱殺菌方式對羊乳脂肪球的影響

脂肪球微粒大小對乳的外觀、口感和穩定性有著重要影響[16]。采用光學顯微鏡觀察5種殺菌方式羊乳中脂肪球的差異,如圖1所示。與未加熱相比,低溫長時巴氏殺菌(65 ℃/30 min)、低溫短時巴氏殺菌(72 ℃/15 s)和超巴氏殺菌(95 ℃/5 min)后羊乳脂肪球表觀直徑略微增大,而高溫高壓滅菌(121 ℃/20 min)和超高溫瞬時滅菌(137 ℃/7 s)的高強度殺菌,則導致羊乳脂肪球直徑減小,尤以高溫高壓滅菌減小更加明顯。這與周潔瑾等[17]對牛乳的研究結果相似,巴氏殺菌牛乳脂肪球因聚集而變大,而超高溫滅菌牛乳脂肪球破裂、直徑變小。在加熱過程中,乳脂肪球膜會通過二硫鍵吸附變性乳清蛋白造成脂肪球表觀直徑增大,但在高強熱處理時,發生脂肪球膜破裂和脂肪球變形,導致其直徑減小[16-19]。

2.3 5種常見熱殺菌方式對羊乳蛋白質內源熒光光譜的影響

色氨酸(Trp)殘基是蛋白質中重要的內源熒光來源,Trp中生色團對其所處微環境極性非常敏感,因此利用蛋白質內源熒光光譜的變化可以反映其三級結構的改變[20]。圖2顯示的是5種殺菌方式處理羊乳的內源熒光發射光譜,從圖2可以看出,與未加熱相比,5種熱殺菌方式處理均導致羊乳蛋白內源熒光強度(If)增大,但低溫長時巴氏殺菌(65 ℃/30 min)、低溫短時巴氏殺菌(72 ℃/15 s)、超巴氏殺菌(95 ℃/5 min)和超高溫瞬時滅菌(137 ℃/7 s)僅使If微弱升高,且四種殺菌羊乳內源熒光圖譜非常接近,而高溫高壓滅菌(121 ℃/20 min)則導致羊乳蛋白If劇烈增大。內源熒光強度增加說明5種熱殺菌使羊乳蛋白中Trp所處環境極性減小,Trp分子內猝滅減弱,從而導致體系If增大,并且高溫高壓滅菌對羊乳蛋白結構影響最大,羊乳蛋白中有更多Trp分子暴露于疏水環境[21]。

圖2 常見熱殺菌方式對羊乳蛋白質內源熒光光譜的影響

2.4 5種常見熱殺菌方式對羊乳蛋白質SDS-PAGE圖譜的影響

圖3所示的是5種常見熱殺菌方式羊乳蛋白質經銀氨染色后SDS-PAGE圖譜。與牛乳一樣,羊乳主要含有酪蛋白和乳清蛋白兩類蛋白,其中酪蛋白又分為β-酪蛋白(β-CN)、αs1-酪蛋白(αs1-CN)、αs2-酪蛋白(αs2-CN)和κ-酪蛋白(κ-CN),乳清蛋白則包括β-乳球蛋白(β-LG)、α-乳白蛋白(α-LA),此外,還存在微量的免疫球蛋白(LgG)、乳鐵蛋白(LF)和血清白蛋白(BSA)(圖3)。

圖3 常見熱殺菌方式對羊乳蛋白質SDS-PAGE圖譜的影響

由圖3可以看出,與未加熱相比,低溫長時巴氏殺菌(65 ℃/30 min)、低溫短時巴氏殺菌(72 ℃/15 s)、超巴氏殺菌(95 ℃/5 min)和超高溫瞬時滅菌(137 ℃/7 s)對β-CN條帶影響不明顯,高溫高壓滅菌(121 ℃/20 min)則使其光密度微弱減小;αs1-CN、αs2-CN和κ-CN在巴氏殺菌和超巴氏殺菌處理下變化不大,然而在高溫高壓滅菌和超高溫瞬時滅菌條件下,αs1-CN和αs2-CN發生明顯降解,尤其以高溫高壓滅菌降解程度最大,而κ-CN在超高溫瞬時滅菌下發生聚集,在121 ℃/20 min下則出現更明顯的蛋白聚合和碎片。對于β-LG,低溫短時巴氏殺菌處理時無明顯變化,低溫長時巴氏殺菌和超巴氏殺菌下略有減少,但在高溫高壓滅菌和超高溫瞬時滅菌后則明顯降解,尤其高溫高壓滅菌時降解更多;而對于α-LA,超高溫瞬時滅菌下同樣出現明顯降解,但在高溫高壓滅菌強熱處理時則幾乎完全消失(圖3)。另外,對于高溫高壓滅菌和超高溫瞬時滅菌,50 kDa以上以及14.4～22 kDa區間出現明顯蛋白聚合物或碎片,高溫高壓滅菌更為明顯(圖3)。整體來看,巴氏殺菌對羊乳酪蛋白和乳清蛋白影響均較小,超巴氏殺菌乳清蛋白開始變性、聚集或部分降解,而超高溫瞬時滅菌和高溫高壓滅菌下乳清蛋白明顯降解甚至消失,酪蛋白表現出明顯的聚集和解聚現象,尤其高溫高壓滅菌時變化最為劇烈。

目前,關于羊乳在加熱過程中尤其高溫處理下乳蛋白變化機制研究非常有限,而牛乳相關研究表明,牛乳酪蛋白含有較高比例脯氨酸,其會阻止熱變性凝固所必需氫鍵的形成,因而對熱相對穩定;乳清蛋白對加熱比較敏感,加熱首先使β-LG變性,然后變性β-LG通過二硫鍵等方式與酪蛋白微粒結合,當加熱溫度達到80 ℃以上時,α-LA開始變性與酪蛋白發生結合,且隨加熱溫度升高更多α-LA和β-LG絡合于酪蛋白膠體表面;高熱處理下(120～140 ℃)酪蛋白膠束體系嫡發生改變,氫鍵破壞,疏水性增強,膠束發生聚合或者解聚作用[22-23]。Henry等[24]研究發現,80 ℃/10 min和115 ℃/20 s熱處理下羊乳酪蛋白膠束和β-LG之間會形成三種共價鍵。Pesic等[7]研究90 ℃/10 min加熱牛、羊乳中的熱誘導蛋白聚合物時,發現兩種乳中變性β-LG、a-LA、κ-CN在乳清相和酪蛋白膠束相分布存在明顯差異。這預示著羊乳蛋白雖與牛乳一樣在低強度加熱時發生變性,高強熱處理時出現聚集和解聚,牛、羊乳蛋白質在熱加工過程中的變化存在相似之處,但羊乳蛋白在加熱過程中具體的變性、解聚和聚合機制仍有待深入研究。

3 結論

本文研究了5種乳品工業中常用熱殺菌方式對關中羊乳品質的影響。結果發現:高溫高壓滅菌羊乳蛋白沉淀率最高、酒精穩定性最差、pH明顯下降、紅度值明顯增大。5種殺菌方式對粘度沒有顯著影響(p>0.05);羊乳脂肪球經巴氏殺菌后表觀直徑略微增大,而超高溫瞬時滅菌和高溫高壓滅菌則導致其直徑明顯變小,高溫高壓滅菌更為明顯。熒光光譜表明,羊乳經不同熱殺菌后蛋白空間結構改變存在差異,其中高溫高壓滅菌后內源熒光強度劇烈增大。SDS-PAGE顯示,巴氏殺菌對羊乳酪蛋白和乳清蛋白影響均較小,超巴氏殺菌乳清蛋白開始變性、聚集或部分降解,而超高溫瞬時和高溫高壓滅菌下,則導致乳清蛋白明顯降解甚至消失,酪蛋白出現聚集和解聚,高溫高壓殺菌更為明顯。由此可見,高溫高壓滅菌和超高溫瞬時滅菌,尤其是高溫高壓滅菌對關中羊乳品質影響較大,超巴氏殺菌影響次之,而巴氏殺菌則對其影響較小。