豌豆蛋白對豬肉鹽溶蛋白理化性質的影響

計紅芳,李莎莎,張令文,王雪菲,陳復生,馬漢軍,*

(1.河南科技學院食品學院,河南新鄉 453003;2.河南工業大學食品科學與工程博士后流動站,河南鄭州 450001)

鹽溶蛋白是動物肌肉中的主要蛋白質,包括肌原纖維蛋白和肌漿蛋白等,約占蛋白總量的50%～55%[1]。在肉類食品加工中,鹽溶蛋白具有吸水、吸油、乳化、膠凝、溶解等多種功能[2-3],而這些功能的發揮,與蛋白分子的結構與組成,以及離子強度、溫度、pH等外在因素有關[4]。肌肉鹽溶蛋白形成熱誘導凝膠的能力是生產和開發新的肉制品的關鍵[5]。通常可加入非肉成分,如膳食纖維、大豆分離蛋白、植物淀粉、魔芋粉等,以改善肉類凝膠制品的風味及品質特性。張巍[6]研究表明,與未改性的大豆分離蛋白相比,熱改性后的大豆分離蛋白可以顯著提高豬肉鹽溶蛋白的硬度、彈性與保水性。栗俊廣等[7]研究發現,當蒜粉添加量為3%時,能夠增強豬肉鹽溶蛋白凝膠疏水相互作用,提高凝膠強度與保水性;當木薯淀粉添加量為1.5%時,可以改善豬肉鹽溶蛋白凝膠質構與保水性,組織結構更加緊密有序[8]。馮云等[9]研究表明,添加0.9 g/100 mL牛血漿蛋白的豬肉鹽溶蛋白凝膠品質最好,與添加0.125 g/100 mL 轉谷氨酰胺酶效果相當。Fernández-Martí等[10]研究指出,添加海藻酸鹽可以增強豬肉肉糜凝膠的保水保油性、硬度與彈性。Chou等[11]研究認為,添加低聚木糖可以增加豬肉肌原纖維蛋白凝膠的保水性與質構特性。Gao等[12]研究發現,卡拉膠、大豆分離蛋白與豬肉鹽溶性蛋白發生了相互作用,可以增加凝膠的強度。但這些非肉成分是如何影響豬肉鹽溶蛋白的理化性質,進而影響到凝膠品質鮮見報道。

豌豆(PisumsativumLinn.)屬豆科植物,富含碳水化合物、蛋白質、維生素、纖維素、常量和微量元素等,其中蛋白質含量為23%～25%。豌豆蛋白是從豌豆中提取的最有價值的成分之一,必需氨基酸比例協調,且具有良好的溶解性、凝膠性、起泡性和乳化性,是一種比較理想的蛋白資源[13-15]。有關豌豆蛋白的研究主要集中在提取制備、生物酶法改性、酶解工藝,以及在酸奶、植脂奶油、糕點、饅頭等方面的應用,與大豆分離蛋白等相比,在食品行業中的應用有限[16-17]。本課題組前期研究表明,添加4%的豌豆蛋白可顯著改善豬肉鹽溶蛋白凝膠品質。因此,本文研究了添加不同量豌豆蛋白對豬肉鹽溶蛋白理化特性的影響,為豌豆蛋白在肉類凝膠制品中應用提供理論指導,以拓寬豌豆蛋白在食品領域中的應用范圍。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

豬背最長肌 新鄉洪門菜市場;大豆油(食品級) 新鄉市易購世紀華聯超市;豌豆蛋白(蛋白含量80%) 煙臺東方蛋白科技有限公司;牛血清蛋白 上海金穗生物科技有限公司;標準蛋白(5～250 kDa) 美國飛世爾;異硫氰酸胍、甘氨酸、十二烷基硫酸鈉、溴酚藍(Bromophenol blue,BPB)、EDTA、5,5′-二硫雙(2-硝基苯甲酸,DTNB)、尿素等 均為分析純。

BP221S型電子天平 德國Sartorius公司;臺式高速冷凍離心機 德國Thermo Fisher Scientific;AD200L-P型分散均質機 上海昂尼儀器儀表有限公司;TGL-15B高速離心機 上海安亭科學儀器廠;FE28型pH計 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;DZKW-4恒溫水浴鍋 北京中興偉業儀器有限公司;WFJ7200型紫外可見分光光度計 上海尤尼柯儀器有限公司;DYCZ-24DN型電泳儀 北京六一生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 鹽溶蛋白的提取 參考Chen等[18]及孔鵬等[19]的方法并稍作修改。取50 g新鮮豬背最長肌剔除脂肪和結締組織,切塊,用絞肉機絞成肉糜,加入200 mL 0.6 mol/L NaCl溶液,勻漿,調pH7.0,4 ℃放置24 h,10000 r/min離心10 min,上清液即鹽溶性蛋白。

1.2.2 蛋白混合液制備 將豌豆蛋白0、0.6、1.2、1.8、2.4、3 g(質量體積比分別為0、2、4、6、8、10 g/mL)分別添加到30 mL 50 mg/mL的鹽溶蛋白溶液中,均質,4 ℃靜置12 h,使豌豆蛋白與鹽溶蛋白溶液充分結合,以未添加豌豆蛋白的鹽溶蛋白溶液為對照。牛血清蛋白為標準蛋白,采用雙縮脲法測混合液的蛋白濃度。以蛋白濃度為橫坐標,吸光度為縱坐標所得的標準曲線為Y=0.0998X-0.0044,相關系數r=0.9994,測得蛋白濃度范圍為1～10 mg/mL。

1.2.3 蛋白混合液SDS-PAGE電泳 參考Laemmli[20]的方法,分別以鹽溶蛋白與豌豆蛋白溶液為對照,對蛋白混合液進行SDS-PAGE電泳,樣品蛋白濃度均為1 mg/mL,上樣量為10 μL。

1.2.4 表面疏水性的測定 參考劉丹等[21]和Chelh等[22]的方法并稍作修改。將蛋白混合液用0.1 mol/L磷酸緩沖溶液(pH7.0)稀釋至5 mg/mL,取1 mL蛋白溶液加入200 μL 1 mg/mL溴酚藍(BPB)劇烈震蕩,使其充分混合,7000 r/min的條件下離心15 min,取上清夜300 μL,用磷酸緩沖溶液稀釋10倍,595 nm波長下測其吸光度A樣品,以未加蛋白溶液的磷酸緩沖溶液作為對照,測得的吸光值為A對照。表面疏水性大小用溴酚藍結合量表示，按以下公式計算:

1.2.5 二硫鍵含量的測定 取0.5 mL濃度為4 mg/mL蛋白混合液,加入3 mL pH9.5的新配NTSB檢測溶液,攪拌均勻,暗處反應25 min,412 nm處測吸光值[23]。計算公式如下:

二硫鍵含量(mol/mg)=(A412×D)/(13900×103×C蛋白)

式中:D表示稀釋倍數,此處為2.29;C表示蛋白質溶液濃度,mg/mL;13900×103為摩爾消光系數ε,mL/(mol·cm)。

1.2.6 巰基含量的測定 參考曾憲明等[24]的方法并稍作修改。取0.5 mL 4 mg/mL蛋白混合液于離心管中,加入4.5 mL緩沖液(10 mmol/L K2HPO4/KH2PO4,10 mmol/L EDTA,0.6 mol/L KCl,pH7.0),再加入0.5 mL 0.1% 的DTNB溶液,混勻后在4 ℃條件下避光保存1 h,10000×g離心15 min,于412 nm處比色,測吸光值。以0.5 mL蒸餾水加4.5 mL緩沖液,再加0.5 mL DTNB溶液作為空白。巰基含量計算公式如下:

巰基含量(mol/mg)=(A412×D)/(13600×103×C蛋白)

式中:D表示稀釋倍數,此處為2.29;C蛋白表示蛋白質溶液濃度,mg/mL;13600為摩爾消光系數ε,mL/(mol·cm)。

1.2.7 濁度和溶解度的測定 取20 mL 0.5 mg/mL的蛋白混合液于離心管中,25 ℃水浴20 min取出,340 nm處測其吸光度值,即為濁度[25]。將蛋白混合液稀釋至4 mg/mL,3500×g、4 ℃條件下離心15 min,測其上清液蛋白濃度。溶解度計算公式[26]:

S(%)=CX/CY×100

式中:S為溶解度(%);CX為離心后上清液中的蛋白濃度(mg/mL);CY離心前的蛋白濃度(mg/mL)。

1.2.8 乳化穩定性指數(ESI)和乳化活性指數(EAI)的測定 采用Pearce等[27]的方法并稍作調整。取28 mL 5 mg/mL的蛋白混合液于燒杯中,加入7 mL的大豆油,勻漿制成乳液狀。從新制的乳液底部迅速吸取60 μL,并迅速用1 mg/mL SDS溶液稀釋500倍,立即在500 nm下測其吸光度A0。將乳液靜置5 min,采用同樣的方法測定樣品的吸光度A5。計算公式為:

ESI(min)=5A0/(A0-A5)

EAI(m2/g)=[2×2.303/(C×Φ×104)]×500×A0

式中:C為乳化前鹽溶性蛋白質量濃度(mg/mL);Φ為乳狀液中大豆油所占的體積比例(%)。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 豬肉鹽溶蛋白溶液SDS-PAGE電泳

根據Xiong等[28]、周光宏[29]研究報道,肌原纖維蛋白的分子量為:肌球蛋白重鏈約200 kDa,C-蛋白約135～150 kDa,α-肌動素約95 kDa,肌動蛋白41～61 kDa,肌鈣蛋白T 30～37 kDa,肌球蛋白輕鏈30 kDa。彭偉偉[30]、O’Kane等[31]研究發現,未加熱豌豆蛋白由較多的肽段組成,主要包含豌豆球蛋白(legumin 11S)和豌豆球蛋白(vicilin 7S),vicilin包括50 kDa、31～34 kDa和10～12 kDa的亞基,legumin有酸性多肽(legA 38 kDa)和堿性多肽(legB 15 kDa),Aguilar-Vázquez等[32]發現在非還原條件下豌豆蛋白對應條帶為脂氧合酶(lipoxygenase 97 kDa),conviciline(70 kDa)和legumin(50 kDa)。

由圖1所示,根據分子量范圍可以得知鹽溶蛋白A泳道對應的條帶分別為肌球蛋白重鏈、C-蛋白、α-肌動素、肌動蛋白、肌鈣蛋白T和肌球蛋白輕鏈,與Gao等[12]、Wu等[33]得到的豬鹽溶蛋白凝膠電泳條帶類似;豌豆蛋白G泳道中對應的條帶分別為vicilin亞基、legA、legB、ipoxygenase和conviciline,有研究者認為conviciline屬于vicilin的亞基,因為它與vicilin有高度的同源性[31],這一結果與彭偉偉[30]、Aguilar-Vázquez等[32]、Xiong等[34]研究的豌豆蛋白電泳結果基本一致。

如圖1,隨豌豆蛋白添加量的增加,肌球蛋白重鏈、C-蛋白、α-肌動素、肌球蛋白輕鏈條帶逐漸變窄且顏色變淺,lipoxygenase、conviciline、legB、vicilin亞基條帶逐漸變粗且顏色加深。鹽溶蛋白A中的肌動蛋白與豌豆蛋白G中的vicilin(7S)亞基,鹽溶蛋白A的肌鈣蛋白T與豌豆蛋白G中legA,分子量相近,在此位置的條帶逐漸變粗且加深。豌豆蛋白與鹽溶蛋白的相互作用,將有利于豌豆蛋白-鹽溶蛋白凝膠三維網絡結構的形成。Gao等[12]研究發現,將5%的大豆分離蛋白添加到豬鹽溶蛋白中,僅出現了94和20 kDa兩條條帶。Choi等[35]將0.1%、0.5%、1%、2%的米糠纖維加入豬鹽溶蛋白中,SDS凝膠電泳結果顯示,無論其添加量如何改變,蛋白條帶均無明顯變化。

圖1 豌豆蛋白添加到鹽溶蛋白溶液中SDS-PAGE電泳圖譜

2.2 豌豆蛋白添加量對鹽溶蛋白表面疏水性的影響

蛋白表面疏水性能反應其表面疏水性氨基酸的相對含量,也能反映蛋白結構展開程度。Li等[36]研究發現,蛋白聚集或交聯會使其表面疏水性降低,蛋白結構伸展則會使其表面疏水性增強。由圖2可知,隨著豌豆蛋白添加量(2%～6%)的增加,表面疏水性呈上升趨勢,6%之后,差異不顯著(p>0.05),豌豆蛋白添加量在2%～6%之間時,對鹽溶蛋白表面疏水性影響較為顯著(p<0.05)。可能是在鹽溶蛋白加入豌豆蛋白后,在處理過程中經過反復均質,劇烈震蕩使蛋白質結構展開,氨基酸殘基暴露,且大多數都能與具有結合疏水基團作用的溴酚藍結合[37]。因此,隨著豌豆蛋白添加量逐漸增多,溴酚藍與暴露出的疏水性氨基酸殘基的結合量增加,從而使表面疏水性升高。袁程程等[38]研究發現,添加0.4%～0.6%的沙蒿膠可以顯著提高蝦蛄肌原纖維蛋白的表面疏水性。低添加量香辛料提取物使埋藏在蛋白分子內部的疏水性氨基酸殘基暴露,表面疏水性升高[21],本試驗研究結果與上述報道一致。

圖2 豌豆蛋白添加量對鹽溶蛋白表面疏水性的影響

2.3 豌豆蛋白添加量對鹽溶蛋白二硫鍵及巰基含量的影響

總巰基包括隱藏的巰基和表面活性巰基。半胱氨酸等的巰基與巰基間易發生氧化交聯,可生成分子內或分子間二硫鍵,二硫鍵是維持蛋白質空間構象的主要作用力之一[39]。如圖3,二硫鍵含量逐漸上升,豌豆蛋白添加量為10%時達到最大值,但與8%的二硫鍵含量相比,差異不顯著(p>0.05),但比對照增加了46.2%。鹽溶蛋白在處理過程中,蛋白分子內部結構發生改變,使隱藏的自由巰基暴露,混合體系之間的巰基通過交聯作用形成二硫鍵。隨豌豆蛋白添加量的增加,巰基含量下降,總巰基由對照的5.483 mol/105g下降到添加量為10%的2.703 mol/105g(圖4),差異顯著(p<0.05)。表面活性巰基含量下降,間接導致了總巰基含量的下降。劉丹等[21]研究發現,迷迭香、丁香和肉桂提取物添加量的增加可以顯著降低豬肉肌原纖維蛋白總巰基含量;Jongberg等[40]研究表明,高濃度的綠茶提取物能降低豬肉肌原纖維蛋白巰基的含量。

圖3 豌豆蛋白添加量對鹽溶蛋白二硫鍵含量的影響

圖4 豌豆蛋白添加量對鹽溶蛋白巰基含量的影響

2.4 豌豆蛋白添加量對鹽溶蛋白濁度和溶解度的影響

濁度能夠間接反映蛋白分子間的交聯程度,當蛋白質間發生交聯作用時,會增加蛋白液的光學密度[41]。蛋白質的溶解性主要取決于蛋白分子表面親水性及疏水性的平衡。由圖5可知,隨豌豆蛋白添加量的增加,濁度始終呈上升趨勢,可能是因為蛋白分子間交聯程度逐漸增加,懸浮顆粒直徑增大,因此濁度逐漸升高。

圖5 豌豆蛋白添加量對鹽溶蛋白濁度的影響

由圖6可知,鹽溶蛋白的溶解度在豌豆蛋白添加量為2%～4%呈上升趨勢,4%時,溶解度最大,為42.88%,之后溶解度下降。低添加量引起的溶解度上升,可能是因為鹽溶蛋白中含有少量的氯化鈉,發生了鹽溶現象。隨豌豆蛋白添加量的進一步增加,樣品在均質、劇烈震蕩過程中,蛋白分子內部的疏水性基團進一步暴露,使分散在蛋白液中的蛋白通過分子間疏水相互作用發生聚集,致使溶解度下降。另外,巰基含量的下降與二硫鍵含量的上升,使蛋白分子易于凝聚和沉淀,也會顯著降低其溶解度。

圖6 豌豆蛋白添加量對鹽溶蛋白溶解度的影響

2.5 豌豆蛋白添加量對鹽溶性蛋白ESI和EAI的影響

豌豆蛋白具有乳化劑的特征結構,即兩親結構,在蛋白分子中同時具有親水和疏水基團,親水基團與水分子結合,疏水基團結合于脂肪球表面,然后懸浮在水溶液中,形成乳濁液[42]。由圖7可知,隨著豌豆蛋白添加量的增加,EAI呈現先明顯上升后趨于平緩的趨勢,在添加量6%之后,變化不顯著(p>0.05)。鹽溶蛋白的ESI,隨著豌豆蛋白添加量的增加持續上升,添加量為8%與10%時,差異不顯著(p>0.05)。可能是由于豌豆蛋白的添加降低了鹽溶蛋白溶液的界面張力,形成更加穩定的乳化狀態,當豌豆蛋白添加過量,蛋白分子聚集,使蛋白的ESI增加不顯著。鹽溶蛋白乳化性的整體提高,可能是由于疏水基團的暴露,使蛋白更易于吸附至油水界面上并進一步展開,從而提高了乳化性。劉英麗等[43]研究表明,隨小麥麩膳食纖維添加量的增加,豬肉肌原纖維蛋白乳化活性略有升高,可能是由于該膳食纖維具有很多親水基團,同時對油脂有一定的吸附能力所致。

圖7 豌豆蛋白添加量對鹽溶蛋白EAI和ESI的影響

3 結論

在試驗范圍內,隨豌豆蛋白添加量的增加,豬肉鹽溶蛋白的肌球蛋白重鏈、C-蛋白、α-肌動素、肌球蛋白輕鏈條帶逐漸變窄且顏色變淺;鹽溶蛋白中的肌動蛋白與豌豆蛋白中的vicilin(7S)亞基,鹽溶蛋白中的肌鈣蛋白T與豌豆蛋白中legA,分子量相近,其條帶逐漸變粗且顏色加深。隨豌豆蛋白添加量的增加,鹽溶蛋白的表面疏水性、二硫鍵含量、濁度、EAI、ESI均升高,溶解度先增加后降低,而總巰基與自由巰基含量均呈減少趨勢。綜上,添加4%～6%的豌豆蛋白對豬肉鹽溶蛋白的表面疏水性、濁度、乳化性、巰基含量等理化性質均有顯著影響(p<0.05)。