橙皮苷衍生物的制備鑒定及抗氧化活性研究

段志芳,劉文華,馬延紅

(1.肇慶學(xué)院食品與制藥工程學(xué)院,廣東肇慶 526061;2.肇慶學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院,廣東肇慶 526061)

氧化不僅會影響食品的風(fēng)味、色澤,降低其營養(yǎng)品質(zhì),而且所產(chǎn)生的氧化產(chǎn)物會對機(jī)體造成破壞,危害人體健康。在食品中添加抗氧化劑是防止其氧化的有效方法,目前食品工業(yè)主要使用的人工合成抗氧化劑存在一定的安全性問題,而天然抗氧化劑安全性高、種類繁多,受到了人們的重視和歡迎[1]。目前天然抗氧化劑多為中草藥、香辛料等植物的提取物,國內(nèi)外學(xué)者對其提取、抗氧化性能和機(jī)理進(jìn)行了大量的試驗研究,為開發(fā)天然抗氧化劑奠定了堅實的基礎(chǔ),應(yīng)用前景非常廣闊[2]。

黃酮類化合物是一類廣泛存在于自然界中的具有2-苯基色原酮結(jié)構(gòu)的化合物,其中二氫黃酮類分布較普遍,尤其在被子植物的薔薇科、蕓香科、姜科、菊科、杜鵑花科和豆科中分布較多[3]。黃酮類物質(zhì)生物活性和藥理作用廣泛,大多數(shù)黃酮類化合物具有較強(qiáng)的抗氧化作用,無毒副作用,且許多黃酮類的抗氧化活性遠(yuǎn)高于維生素C,是目前研究黃酮類最多的領(lǐng)域,屬于最有希望工業(yè)化應(yīng)用的天然食品抗氧化劑[4]。

橙皮苷是普遍存在于柑桔屬植物中的二氫黃酮類化合物,其來源豐富,提取工藝成熟,具有抗菌、抗氧化、抗炎、抗過敏、抗腫瘤和抗衰老等作用[5],但鄭美瑜等[6]對橙皮苷的生物利用率方面的研究作了綜述,表明橙皮苷由于水溶性和脂溶性均較差,影響其在體內(nèi)的代謝吸收,其生物利用率并不高,因而有必要對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾。盛雪飛等[7]對橙皮苷改性技術(shù)研究進(jìn)行了綜述,發(fā)現(xiàn)其結(jié)構(gòu)經(jīng)修飾后生物活性增強(qiáng),在醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域具有開發(fā)應(yīng)用價值,如橙皮苷的衍生物甲基橙皮苷,具有維生素P活性作用,可作為強(qiáng)化食品的添加劑,由橙皮苷所得到的葡萄糖橙皮素二氫查耳酮,甜度是蔗糖的1000倍,可作為甜味劑使用。

本論文以藥食兩用植物資源陳皮為原料,提取分離得到橙皮苷,以其為先導(dǎo)化合物,通過不同類型的化學(xué)反應(yīng)分別得到8個衍生物,比較測定它們的抗氧化活性,以期為天然黃酮類化合物橙皮苷的進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

陳皮 肇慶邦健大藥房;豬油 市售豬板油新鮮煉制而成;大豆油 山東魯花集團(tuán)有限公司生產(chǎn);GF254薄層層析用硅膠 青島海洋化工有限公司生產(chǎn);2,2-二苯基-1-苦味酰基自由基(DPPH) 德國Meker公司;鐵氰化鉀(K3[Fe(CN)6])、三氯乙酸(TCA)、三氯化鐵(FeCl3)、碳酸鉀(K2CO3)、碘化鉀(KI)、硫酸亞鐵(FeSO4)、氫氧化鈉(NaOH)、濃鹽酸 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;溴乙酸乙酯、亞油酸、卵磷脂、維生素C(VC)、2,6-二叔丁基對甲苯酚(BHT)、硫氰酸銨(NH4SCN)、氯化亞鐵(FeCl2)、硫代巴比妥酸(TBA)、磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)、磷酸二氫鈉(NaH2PO4·2H2O)、硫代硫酸鈉(Na2S2O3·5H2O) 上海阿拉丁生化科技股份有限公司;其它試劑 均為國產(chǎn)分析純。

JA2603B電子天平 上海精科天美科學(xué)儀器有限公司;SGWX-4B型顯微熔點測定儀 上海儀電物理光學(xué)儀器有限公司;SHZ-DIII型循環(huán)水真空泵 鄭州亞榮儀器有限公司;DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鞏義予華儀器有限公司;RE-52AAA旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器 上海嘉鵬科技有限公司;Avance AV 500 MHz超導(dǎo)核磁共振儀 德國Bruker公司;Waters Quattro Premier液質(zhì)聯(lián)用儀、Waters UPLC-SQD單四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀 美國Waters公司;2550型UV-VIS分光光度計 日本島津公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 橙皮苷及其衍生物的制備 橙皮苷從中藥陳皮中提取分離得到,8個橙皮苷衍生物的合成路線如圖1所示。

圖1 8個橙皮苷衍生物的合成路線

1.2.1.1 橙皮苷(化合物1)的制備 參考文獻(xiàn)[8]方法:將陳皮干燥后粉碎,加6倍量蒸餾水浸泡約0.5 h,加入10%量的石灰使pH達(dá)11.5～12.0,浸泡2 h后抽濾,濾渣再同法提取2次,濾液合并,稀鹽酸調(diào)pH=5,靜置2 d,收集沉淀,水洗至中性,得粗品,粗品用1%氫氧化鈉的50%乙醇溶液溶解,過濾,濾液用稀鹽酸調(diào)pH至5,靜置,收集沉淀物,先用50%乙醇洗滌1次,再用水洗至中性,干燥得產(chǎn)品。

1.2.1.2 香葉木苷(化合物2)的制備 參考文獻(xiàn)[9]方法:18.3 g橙皮苷加入到100 mL吡啶中,微熱溶解后加入7.8 g碘粒,95 ℃攪拌反應(yīng) 10 h,加入150 mL蒸餾水,抽濾,濾餅用蒸餾水洗至中性,得粗品,乙醇/水重結(jié)晶得到產(chǎn)品。

1.2.1.3 香葉木素(化合物3)的制備 參考文獻(xiàn)[9]方法:17.1 g香葉木苷加入400 mL乙醇和20 mL濃硫酸,回流反應(yīng)4 h,減壓蒸餾,剩余物傾入冰水中,析出固體抽濾,水洗至中性,得粗品,用乙醇/水重結(jié)晶得到產(chǎn)品。

1.2.1.4 橙皮素(化合物6)的制備 參考文獻(xiàn)[9]方法:5 g橙皮苷中加入180 mL無水乙醇和6 mL濃硫酸,回流8 h,冷卻后減壓蒸餾,剩余物倒入蒸餾水中攪拌,有固體析出,靜置,抽濾,水洗至中性,乙醇/水重結(jié)晶得到產(chǎn)品。

1.2.1.5 7-O-乙氧羰亞甲基-香葉木素(化合物4)的制備 將10 mmol香葉木素、10 mmol無水K2CO3和50 mL丙酮攪拌回流反應(yīng)1 h后,緩慢滴加10 mmol溴乙酸乙酯及催化量的碘化鉀,繼續(xù)反應(yīng),薄層色譜(TLC)監(jiān)測進(jìn)程,反應(yīng)完成后抽濾,減壓蒸除丙酮后加入無水乙醇重結(jié)晶得到產(chǎn)品。

1.2.1.6 7-O-羧亞甲基-香葉木素(化合物5)的制備 將2.7 mmol 7-O-乙氧羰亞甲基-香葉木素和15 mL無水乙醇攪拌,加入5% NaOH溶液2 mL,回流反應(yīng)2 h,用6 mol·L-1鹽酸調(diào)pH至1～2,過濾,濾餅用冷水洗滌,無水乙醇/二甲亞砜重結(jié)晶得到產(chǎn)品。

1.2.1.7 3′,7-O-二乙氧羰亞甲基-橙皮素(化合物7)的制備 將10 mmol橙皮素、40 mmol碳酸鉀和50.00 mL丙酮攪拌均勻,緩慢滴加20 mmol溴乙酸乙酯,加熱回流,TLC跟蹤反應(yīng)完全,抽濾,濾液減壓蒸餾除去丙酮,剩余物用無水乙醇重結(jié)晶得到產(chǎn)品。

1.2.1.8 7-O-乙氧羰亞甲基-橙皮素(化合物8)的制備 將10 mmol橙皮素、10 mmol無水碳酸鉀和50 mL丙酮攪拌均勻,緩慢滴入10 mmol溴乙酸乙酯,加熱回流,TLC跟蹤,待反應(yīng)完全抽濾,濾液減壓蒸餾,剩余物用無水乙醇重結(jié)晶得到產(chǎn)品。

1.2.1.9 7-O-羧亞甲基-橙皮素(化合物9)的制備 2.7 mmol 7-O-乙氧羰亞甲基-橙皮素和15 mL無水乙醇中加入5% NaOH溶液2 mL,回流2 h,用6 mol·L-1鹽酸調(diào)pH至1～2,過濾,濾餅用冷水洗滌,無水乙醇/二甲亞砜重結(jié)晶得到產(chǎn)品。

1.2.2 橙皮苷及其衍生物的鑒定 通過物化性質(zhì)檢測、薄層層析比較、核磁共振譜和質(zhì)譜確定化合物的結(jié)構(gòu)。

1.2.2.1 物化性質(zhì)檢測 觀察所得化合物的顏色外觀,稱重并計算產(chǎn)率,產(chǎn)率(%)=實際得到的量/理論應(yīng)得的量×100;顯微熔點測定儀測定熔點;將各化合物分別放少量到試管中,檢測它們在脂溶性溶劑乙醚、氯仿、苯、乙酸乙酯或水溶性溶劑丙酮、乙醇、吡啶、二甲亞砜、二甲基甲酰胺中的溶解性。

1.2.2.2 薄層層析 比較所用固定相為GF254薄層層析用硅膠,流動相為石油醚/乙酸乙酯混合溶劑。將硅膠與0.5%羧甲基纖維素鈉水溶液(1∶3)混合均勻鋪在玻璃板上,室溫干燥后105 ℃活化,毛細(xì)管點樣,石油醚/乙酸乙酯展開,碘蒸氣顯色觀察。

1.2.2.3 核磁共振譜測定 采用Avance AV 500 MHz全數(shù)字化超導(dǎo)核磁共振儀測定核磁共振譜,以氘代二甲亞砜(DMSO-d6)為溶劑、四甲基硅烷(TMS)為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。氫譜法確定已有文獻(xiàn)報道的化合物的結(jié)構(gòu),氫譜、碳譜法鑒定未見文獻(xiàn)報道的化合物的結(jié)構(gòu)。

1.2.2.4 質(zhì)譜測定 采用Waters Quattro Premier液質(zhì)聯(lián)用儀、Z-spray ESI 離子源測定低分辨質(zhì)譜,色譜柱為ODS(C18)柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),柱溫為常溫,甲醇為流動相;采用Waters UPLC-SQD單四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀、ESI離子源測定高分辨質(zhì)譜,色譜柱為ODS(C18)柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),柱溫為常溫,甲醇為流動相。

1.2.3 橙皮苷及其衍生物體外抗氧化作用 樣品溶液的配制:橙皮苷、香葉木苷、7-O-羧亞甲基-香葉木素和7-O-羧亞甲基-橙皮素用少量二甲亞砜溶解后再用乙醇定容,其它化合物直接用無水乙醇溶解配制,空白為相應(yīng)的溶劑。

1.2.3.1 總抗氧化能力測定 采用鐵氰化鉀法測定橙皮苷及其8個衍生物的總還原能力,吸光度越大,表示試樣的還原能力越強(qiáng),即總抗氧化能力越強(qiáng)。具體方法參考文獻(xiàn)[10]:分別取樣品溶液各1 mL,加入2.5 mL的pH為6.6磷酸緩沖液,2.5 mL的1%鐵氰化鉀,混合均勻后于50 ℃放置20 min,冰浴冷卻,加入2.5 mL的10%三氯乙酸,搖勻后于3000 r/min 離心10 min,取上清液 2.5 mL,加入 2.5 mL 去離子水和0.5 mL的0.1%三氯化鐵溶液,搖勻反應(yīng)30 min于700 nm下測吸光度A樣品,同時測得A空白,各樣品的總抗氧化能力=A樣品-A空白。

1.2.3.2 清除自由基活性測定 采用DPPH法測定體外清除自由基能力,具體方法參考文獻(xiàn)[11]:分別取各樣品溶液0.1 mL,加入2.0 mL乙醇和0.25 mL的1 mmol/L的DPPH溶液,混勻后室溫避光放置30 min,測定517 nm處的吸光度值A(chǔ)樣品,同時測得A空白(同體積蒸餾水替換樣品溶液),DPPH自由基清除率(%)=(A空白-A樣品)/A空白×100。

1.2.3.3 抗亞油酸自氧化活性測定 采用硫氰酸鐵法測定抗亞油酸自氧化能力,抑制率越大,說明效果越好。具體方法參考文獻(xiàn)[12]:分別取0.5 mL樣品溶液、1 mL的50 mmol/L亞油酸和1 mL的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液混勻,密封后于60 ℃避光保溫8 d,各取出0.1 mL反應(yīng)液,依次加入4.7 mL的75%乙醇、0.1 mL的30%硫氰酸銨溶液和0.1 mL的20 mmol/L氯化亞鐵溶液,混勻,3 min后測定486 nm處吸光度值A(chǔ)樣品,同時測得A空白(同體積蒸餾水替換樣品溶液),抑制率(%)=(A空白-A樣品)/A空白×100。

1.2.3.4 抗脂質(zhì)過氧化活性測定 采用脂質(zhì)體氧化法測定對卵磷脂過氧化的抑制作用,抑制率越大,說明效果越好。具體方法參考文獻(xiàn)[13]:分別取0.5 mL樣品溶液、0.5 mL卵磷脂溶液、0.5 mL的0.4 mmol/L FeSO4溶液、0.5 mL的0.4 mmol/L VC溶液,混勻避光于37 ℃水浴60 min后加入1 mL TCA-TBA-HCl混合液,95 ℃水浴15 min,迅速冷卻,3000 r/min離心10 min,取上清液于535 nm處測定吸光值A(chǔ)樣品,同時測得A空白(同體積蒸餾水替換樣品溶液),抑制率(%)=(A空白-A樣品)/A空白×100。

1.2.4 橙皮苷及其衍生物抗油脂氧化能力 抗油脂氧化參考文獻(xiàn)[14-16]方法進(jìn)行:動物油為新煉制的豬油,植物油為大豆油。以橙皮苷和食品添加劑BHT為參照,將它們和7-O-乙氧羰亞甲基-香葉木素分別配制為0.0125、0.0250、0.0500、0.1000、0.2000 mg/mL,作為待測樣品。將2 g豬油和1 mL各待測樣品混合均勻,Schaal烘箱法60 ℃誘導(dǎo)氧化,12 d后取樣采用GBT 5009.37比色法測定其過氧化值POV樣品,同時測得POV空白(同體積蒸餾水替換樣品溶液),抑制率(%)=(POV空白-POV樣品)/POV空白×100。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與分析

2.1 橙皮苷及其衍生物的鑒定結(jié)果

橙皮苷(化合物1):灰白色粉末,產(chǎn)率2.3%,熔點253～255 ℃,不溶于乙醚、氯仿、苯、乙酸乙酯、乙醇、水等溶劑,溶于吡啶、二甲亞砜、二甲基甲酰胺,ESI-MS:611[M+H]+。

香葉木苷(化合物2):淡黃色固體,產(chǎn)率61.7%,熔點276～278 ℃,不溶于乙醚、氯仿、苯、乙酸乙酯、乙醇、水等溶劑,溶于吡啶、二甲亞砜、二甲基甲酰胺,ESI-MS:609[M+H]+。

香葉木素(化合物3):黃色粉末,產(chǎn)率76.9%,熔點256～258 ℃,不溶于水,溶于乙醚、氯仿、苯、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、吡啶、二甲亞砜、二甲基甲酰胺等溶劑。1H-NMR(500 MHz,DMSO-d6)δppm3.87(s,3H,OCH3),6.21(d,J=2.0 Hz,1H,6-H),6.48(d,J=2.0 Hz,1H,8-H),6.77(s,1H,3-H),7.10(d,J=8.8 Hz,1H,5-H),7.43(d,J=2.0 Hz,1H,2-H),7.54(dd,J=8.8,2.0 Hz,1H,6′-H),9.51(s,1H,3′-OH),10.90(s,1H,7-OH),12.95(s,1H,5-OH)。

7-O-乙氧羰亞甲基-香葉木素(化合物4):淡黃色粉末,產(chǎn)率66.8%,熔點128～130 ℃,不溶于水,溶于乙醚、氯仿、苯、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、吡啶、二甲亞砜、二甲基甲酰胺等溶劑。1H-NMR(500 MHz,DMSO-d6)δppm1.24(t,J=7.1 Hz,3H,-CH3),3.88(s,3H,-OCH3),4.20(q,J=7.1 Hz,2H,-OCH2-),4.96(s,2H,-OCH2CO-),6.41(s,1H,6-H),6.80(s,1H,3-H),6.85(s,1H,8-H),7.11(d,J=8.7 Hz,1H,5′-H),7.47(s,1H,2′-H),7.59(d,J=8.7 Hz,1H,6′-H),9.51(s,1H,3′-OH),12.95(s,1H,5-OH)。

7-O-羧亞甲基-香葉木素(化合物5):白色粉末,產(chǎn)率82.2%,熔點227～229 ℃,不溶于乙醚、氯仿、苯、乙酸乙酯、丙酮、乙醇等溶劑,溶于水、吡啶、二甲亞砜、二甲基甲酰胺。1H-NMR(500 MHz,DMSO-d6)δppm3.87(s,3H,-OCH3),4.86(s,2H,-OCH2-),6.38(s,1H,6-H),6.76(s,1H,3-H),6.83(d,J=8.4 Hz,1H,8-H),7.10(d,J=8.1 Hz,1H,5′-H),7.47(s,1H,2′-H),7.58(d,J=6.2 Hz,1H,6′-H),9.50(s,1H,3′-OH),12.93(s,1H,5-OH),13.11(s,1H,-COOH)。

橙皮素(化合物6):淡黃色固體,產(chǎn)率72.1%,熔點226～228 ℃,不溶于水,溶于乙醚、氯仿、苯、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、二甲亞砜和二甲基甲酰胺。1H-NMR(500 MHz,DMSO-d6)δppm 2.20(dd,J=16.8,4.8 Hz,1H,3-H),3.20(dd,J=16.8,12.4 Hz,1H,3-H),3.77(s,3H,OCH3),5.43(dd,J=12.4,4.7 Hz,1H,2-H),5.88～6.95(m,5H,ArH),9.48(s,1H,3′-OH),10.81(s,1H,7-OH),12.10(s,1H,5-OH)。

3′,7-O-二乙氧羰甲基-橙皮素(化合物7):淡黃色粉末,產(chǎn)率59.4%,熔點88～90 ℃,不溶于水,溶于乙醚、氯仿、苯、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、二甲亞砜和二甲基甲酰胺。Rf=0.52(V石油醚/V乙酸乙酯=2∶1)。1H-NMR(500 MHz,DMSO-d6)δppm 1.22(t,J=7.25 Hz,6H,2CH3),2.76(dd,J=3.0,14.0 Hz,1H,3-H cis),3.37(dd,J=12.5,13.0 Hz,1H,3-H trans),3.80(s,3H,4′-OCH3),4.18(q,J=7.50 Hz,4H,2CH2),4.78(s,2H,CH2),4.88(s,2H,CH2),5.54(dd,J=2.5,10.0 Hz,1H,2-H),6.10～6.11(m,2H,6,8-H),7.04(d,J=9.0 Hz,1H,6′-H),7.09～7.10(m,2H,2′,5′-H),12.07(s,1H,5-OH);13C NMR(125 MHz,DMSO-d6)δ ppm 14.48(CH3),14.52(CH3),42.55(C-3),56.22(OCH3),61.03(CH2),61.30(CH2),65.28(CH2),65.98(CH2),78.93(C-2),94.77(C-8),95.73(C-6),103.45(C-9),112.73(C-5′),113.11(C-2′),120.91(C-6′),131.14(C-1′),147.47(C-3′),149.82(C-4′),163.13(C-10),163.55(C-5),166.12(C-7),168.45(CO),169.10(CO),197.31(C-4)。ESI-MS C24H26O10(m/z,%):475.07([M+H]+,50.2%),274.28(100%)。

7-O-乙氧羰甲基-橙皮素(化合物8):淡黃色粉末,產(chǎn)率67.8%,熔點120～122 ℃,不溶于水,溶于乙醚、氯仿、苯、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、二甲亞砜和二甲基甲酰胺。Rf=0.7(V石油醚/V乙酸乙酯=1∶1)。1H-NMR(500 MHz,DMSO-d6)δppm 1.25(t,J=8.88 Hz,3H,CH3),2.85(dd,J=3.65,18.1 Hz,1H,3-H cis),3.17(dd,J=15.8,17.2 Hz,1H,3-H trans),3.86(s,3H,4′-OCH3),4.22(q,J=8.85 Hz,2H,CH2),4.79(s,2H,CH2),5.47(dd,J=2.85,12.80 Hz,1H,2-H),6.04-6.07(m,2H,6,8-H),6.97(s,2H,5′,6′-H),7.05(s,1H,2′-H),7.68(s,1H,3′-OH),12.10(s,1H,5-OH);13C NMR(125 MHz,DMSO-d6)δ ppm 14.43(CH3),43.48(C-3),56.35(OCH3),61.74(CH2),65.74(CH2),79.94(C-2),95.12(C-8),96.06(C-6),101.17(C-9),112.29(C-5′),114.39(C-2′),118.83(C-6′),132.58(C-1′),147.56(C-3′),148.71(C-4′),164.04(C-10),164.85(C-5),167.03(C-7),168.60(CO),197.64(C-4)。HR-MS C20H20O8(m/z,%):389.1227([M+H]+,100%)。

7-O-羧亞甲基-橙皮素(化合物9):白色粉末,產(chǎn)率78.1%,熔點216～218 ℃,不溶于乙醚、氯仿、苯、乙酸乙酯、丙酮、乙醇等溶劑,溶于水、吡啶、二甲亞砜、二甲基甲酰胺。1H-NMR(500 MHz,DMSO-d6)δppm2.75(dd,J=17.1,2.8 Hz,1H,3-H),3.26(dd,J=17.2,12.0 Hz,1H,3-H),4.36(s,2H,CH2O),5.49(dd,J=12.2,2.5 Hz,1H,2-H),6.13(d,J=2.1 Hz,1H,6-H),6.15(d,J=2.1 Hz,1H,8-H),6.90(dt,J=9.6,4.7 Hz,3H,Ar-H),9.11(s,1H,3′-OH),12.10(s,1H,5-OH),12.48(s,1H,COOH)。

從上述結(jié)果可以看出,化合物1和化合物2的水溶性和脂溶性均較差,不溶于乙醚、氯仿、苯、乙酸乙酯、乙醇、水等溶劑,化合物3、4、6、7、8的脂溶性增強(qiáng),溶于乙醚、氯仿、苯、乙酸乙酯等溶劑,化合物5和化合物9的水溶性增強(qiáng),能溶于水。化合物1、2、3、6的物化數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9]相吻合,化合物4、5的分析數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17]相吻合,化合物9的的分析數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[18]相吻合,化合物7、8的分析數(shù)據(jù)未見文獻(xiàn)報道,本文用核磁共振氫譜、碳譜和高分辨質(zhì)譜進(jìn)行了鑒定,與結(jié)構(gòu)相吻合。

2.2 橙皮苷及其衍生物體外抗氧化活性

在選擇樣品的測試濃度時,各樣品先用無水乙醇配制成飽和濃度,然后采用二倍稀釋法配成不同濃度進(jìn)行抗氧化實驗,發(fā)現(xiàn)濃度小時,實驗數(shù)據(jù)較小,濃度大時,在測試體系中會析出沉淀。為了便于比較,將各樣品統(tǒng)一配制為0.2 mg/mL,實驗結(jié)果見表1。

表1 橙皮苷及其衍生物體外抗氧化活性Table 1 Anti-oxidative activities of hesperidinand its derivatives in vitro

從表1可以看出,在0.2 mg/mL濃度時,各化合物總抗氧化能力大小順序為:化合物4>化合物5>化合物3>化合物7>化合物9>化合物8>化合物6>化合物2>化合物1,其中7-O-乙氧羰亞甲基-香葉木素(化合物4)總還原能力較強(qiáng),是原料橙皮苷的2.18倍;各化合物清除DPPH自由基能力大小順序為:化合物8>化合物4>化合物3>化合物7>化合物5>化合物9>化合物2>化合物6>化合物1,其中7-O-乙氧羰甲基-橙皮素(化合物8)清除DPPH自由基能力較強(qiáng),是橙皮苷的1.44倍;各化合物抗亞油酸自氧化能力大小順序為:化合物4>化合物2>化合物7>化合物8>化合物5>化合物3>化合物6>化合物9>化合物1,其中7-O-乙氧羰亞甲基-香葉木素(化合物4)對亞油酸自氧化抑制作用較強(qiáng),是橙皮苷的2.15倍;各化合物抗卵磷脂過氧化能力大小順序為:化合物4>化合物7>化合物2>化合物3>化合物6>化合物5>化合物8>化合物1>化合物9,其中7-O-乙氧羰亞甲基-香葉木素(化合物4)對卵磷脂過氧化抑制作用較強(qiáng),是橙皮苷的1.92倍。數(shù)據(jù)結(jié)果表明多數(shù)衍生物具有比原料橙皮苷較強(qiáng)的抗氧化活性,其中7-O-乙氧羰亞甲基-香葉木素(化合物4)在多種體外抗氧化模型下均顯示較強(qiáng)的作用,選擇其作為食品抗氧化劑進(jìn)一步研究。

2.3 橙皮苷及其衍生物抗油脂氧化結(jié)果與分析

由上述2.1和2.2的結(jié)果可以看出,7-O-乙氧羰亞甲基-香葉木素(化合物4)的體外抗氧化活性比原料橙皮苷的體外抗氧化活性增強(qiáng)較明顯,且能溶于乙醚、氯仿、苯、乙酸乙酯等溶劑,其脂溶性比橙皮苷增強(qiáng),為了進(jìn)一步研究其在食品中的抗氧化能力,本文以橙皮苷和工業(yè)食品添加劑BHT為參照,測試其抗油脂氧化活性。實驗中將橙皮苷、BHT和7-O-乙氧羰亞甲基-香葉木素配制成不同濃度,分別測試它們對豬油和大豆油氧化的抑制作用,實驗結(jié)果見圖2。

圖2 抗油脂氧化作用

由圖2可以看出,在豬油和大豆油中分別添加不同濃度的7-O-乙氧羰亞甲基-香葉木素、橙皮苷和BHT后,它們對油脂的氧化均表現(xiàn)出抑制作用,對豬油和大豆油的抗氧化作用大小基本為:BHT>7-O-乙氧羰亞甲基-香葉木素>橙皮苷,多數(shù)濃度下7-O-乙氧羰亞甲基-香葉木素抑制豬油和大豆油氧化作用強(qiáng)于原料橙皮苷,但弱于BHT,并且抑制率隨著濃度升高而增大,呈現(xiàn)出較好的量效關(guān)系。在同濃度下,7-O-乙氧羰亞甲基-香葉木素抗豬油氧化作用強(qiáng)于抗大豆油氧化作用,如在濃度為0.2 mg/mL時,對豬油氧化的抑制率為52.17%,對大豆油氧化的抑制率為49.78%。

3 結(jié)論

以陳皮中有效成分橙皮苷為先導(dǎo)化合物,通過氧化、水解、縮合等不同類型化學(xué)反應(yīng)分別得到8個衍生物,其結(jié)構(gòu)經(jīng)與文獻(xiàn)比對或核磁、質(zhì)譜方法確定,化合物3、4、6、7、8的脂溶性增強(qiáng),化合物5和化合物9的水溶性增強(qiáng)。體外抗氧化實驗結(jié)果表明在濃度為0.2 mg/mL時,多數(shù)衍生物具有比先導(dǎo)化合物橙皮苷強(qiáng)的作用,其中7-O-乙氧羰甲基-橙皮素(化合物8)清除DPPH自由基能力較強(qiáng),為橙皮苷的1.44倍;7-O-乙氧羰亞甲基-香葉木素(化合物4)總還原能力較強(qiáng),為橙皮苷的2.18倍,對亞油酸自氧化和卵磷脂過氧化的抑制作用也較強(qiáng),分別為橙皮苷的2.15倍和1.92倍。抗油脂氧化實驗結(jié)果表明化合物4在不同濃度下對豬油和大豆油氧化的抑制作用較橙皮苷明顯,并且與濃度呈量效關(guān)系,對豬油的抗氧化作用強(qiáng)于對大豆油的抗氧化作用。7-O-乙氧羰亞甲基-香葉木素在體外抗氧化模型和油脂氧化中均表現(xiàn)出比原料橙皮苷增強(qiáng)的抗氧化作用,有望作為一種新型食品抗氧化劑進(jìn)一步研究。