陶瓷膜微濾耦合大孔樹脂處理對羅非魚肉酶解多肽理化性質的影響

賀 倩,楊 萍,蔣雄武,洪鵬志,*,周春霞,陳康健

(1.廣東海洋大學食品科技學院,廣東省水產品加工與安全重點實驗室,廣東省現代農業科技創新中心,廣東湛江 524088;2.廣東省水產品深加工及副產物高值化利用工程技術研究中心,湛江恒興水產科技有限公司,廣東湛江 510300)

我國是羅非魚養殖大國,近十年來產量穩居世界首位,2015年我國羅非魚產量達到177.95萬噸[1]。我國羅非魚在國內市場的銷售較少,出口的加工產品主要是凍羅非魚片和整條凍羅非魚,產品單一、技術含量不高、附加值低。從2014年開始,我國羅非魚出口量出現下滑趨勢,產業出現停滯不前的狀態[1],尋找新的加工方法具有重要的現實意義。隨著生物技術的不斷發展,已有報道魚蛋白通過酶解后可以制備多肽,這些多肽具有多種功能性[2]。研究結果證實羅非魚肉酶解液具有抗氧化[3-4]、降血壓[5-6]等生物活性。酶解法制備的魚蛋白酶解液有苦味重、雜質多、顏色深等缺點,是后續開發應用的瓶頸問題。

陶瓷膜具有機械強度大、耐磨性好、耐高溫、耐酸堿、耐有機溶劑、分離效率高、易清洗等優點,在食品領域的應用日益廣泛,在果汁的澄清[7]、乳蛋白濃縮[8]、酪蛋白與乳清蛋白的分離[9]、醬油除雜[10]等均有報道,但在水產加工方面的應用報道不多。張曉瑜等[11]用200 nm陶瓷膜微濾處理馬氏珠母貝肉蛋白酶解液,發現陶瓷膜微濾可以改善酶解液的色值和澄清度,且使分子量小于5000 u的多肽在透過液中得到了富集。大孔樹脂具有多孔性和較大的比表面積,主要通過物理作用從溶液中有選擇性地吸附有機物質,從而達到分離純化的目的。另外,大孔樹脂具有化學穩定性好,價格便宜,易于工業化等特點[12],因此大孔吸附樹脂分離技術現已大量用于環保、化工、醫藥和食品行業。本實驗室前期采用大孔樹脂AB-8和DA20-C動態吸附羅非魚下腳料蛋白酶解液[13],結果表明經吸附處理后的羅非魚下腳料酶解液,腥味和苦味均變淡變小。

本文采用無機陶瓷膜微濾耦合大孔樹脂動態吸附處理羅非魚肉酶解液,分析陶瓷膜處理和大孔樹脂吸附對酶解中多肽組分的影響,旨在為水產蛋白酶解肽的開發應用提供參考,為酶解羅非魚肉制備多肽的規模化生產積累基礎數據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羅非魚 湛江恒興水產科技有限公司提供;中性蛋白酶(2×105U/g)、木瓜蛋白酶(6.5×105U/g) 南寧龐博生物工程有限公司;陶瓷膜(材料Al2O3,平均孔徑50 nm,面積0.12 m2) 杭州沃騰膜工程有限公司;大孔吸附樹脂AB-8 南開大學化工廠;分子量標準品細胞色素C(12500 Da)、抑菌酶(6500 Da)、桿菌酶(1450 Da)、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸(451 Da)、乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸(189 Da) Sigma公司。

28L電加熱酶解罐 溫州東頂機械制造有限公司;WTM-CM-01陶瓷膜裝 杭州沃騰膜工程有限公司;FDU真空冷凍干燥機 東京理化器械株式會社;S-433D全自動氨基酸分析儀 德國Sykam;AKTA Purifier 100 美國GE醫療保健生物科學公司;Agilent 1200半制備高效液相 美國安捷倫科技公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 羅非魚酶解多肽的制備 取新鮮羅非魚肉均勻攪碎后,取4～5 kg放入酶解罐中,按料液比為1∶2.5 (m/v)的比例加入蒸餾水加熱,待物料達到50 ℃后,同時加入中性蛋白酶(500 U/g)和木瓜蛋白酶(425 U/g),酶解5 h后,升溫至100 ℃滅酶10 min,酶解液冷卻后,5000 r/min 離心15 min,取清液進行50 nm陶瓷膜微濾(循環流量為20 L/min,跨膜壓力差為0.06 MPa),得透過液,混合均勻后取部分進行AB-8大孔樹脂動態吸附(上樣體積為7.5 BV,流速3 BV/h),之后用濃度為60%乙醇進行洗脫(洗脫流速為3 BV/h)。各種處理得到的液體鋪成約為5 mm厚的薄層，再置于-40 ℃低溫下過夜后經冷凍干燥成粉狀(凍干溫度為-58 ℃),酶解離心后的上清液多肽、經過陶瓷膜微濾后的多肽、經過大孔樹脂處理流出的多肽、吸附在大孔樹脂上洗脫下來的多肽分別記為羅非魚肉酶解多肽(A)、陶瓷膜微濾多肽(B)、大孔樹脂流出多肽(C)、大孔樹脂洗脫多肽(D)。

1.2.2 基本成分測定 總氮的測定:參照GB 5009.5-2016食品中蛋白質的測定;灰分的測定:參照GB 5009.4-2016食品中灰分的測定;水分的測定:參照GB 5009.3-2010食品中水分的測定;脂肪的測定:索氏抽提法(GB/T 5009.6-2016)另外，拍照觀察各種多肽粉的顏色。

1.2.3 多肽分子量分布分析 采用AKTA Purifier 100分析酶解液的分子量分布。色譜柱:SuperdexTMPeptide 10/300 GL;流動相:0.02 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH7.5,含0.15 mol/L NaCl),流速0.7 mL/min;檢測波長214 nm;根據標準品分子量大小的對數與保留體積得到標準品回歸方程為lgMw=-0.1874x+6.0058(R2=0.9826),樣品分子量分布根據保留體積與回歸方程求得。

1.2.4 氨基酸組成與含量分析 經陶瓷膜和大孔樹脂處理、凍干后的樣品用6 mol/L HCl水解12 h后,50 mL容量瓶定容,取50 μL上柱分析,采用全自動氨基酸分析儀測定氨基酸。

1.2.5 反相液相分析多肽極性 采用高效液相系統分析陶瓷膜微濾前后、AB-8大孔樹脂吸附流出和洗脫酶解液的極性。稱取0.100 g 1.2.1樣品,再加入2 mL超純水溶解,過0.22 μm微濾膜備用。色譜柱:XTerra R MS C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相:A超純水(0.05%三氟乙酸),B乙腈(100%),流速0.6 mL/min;檢測器:UV波長220 nm;柱溫:25 ℃;上柱量:自動進樣10 μL。流動相梯度:A:95%～40%;B:5%～60%;時間:30 min。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 對羅非魚肉多肽基本成分的影響

由表1可知,B與A相比,蛋白質含量差別不大,灰分減少了9.94%,脂肪增加了113.51%,可見陶瓷膜微濾對灰分有截留作用,且由于微濾過后酶解液蛋白質含量變化不明顯，灰分含量有所減少,而陶瓷膜對脂肪沒有截留作用,所以B與A相比脂肪含量增加;C與B相比,蛋白質含量降低了2.25%,灰分增加了25.17%,脂肪增加145.57%;D與B相比,蛋白質含量降低了3.33%,灰分增加了44.59%,脂肪增加了167.09%。這可能是蛋白質含量的降低,導致灰分與脂肪含量的相對升高。可見,50 nm陶瓷膜微濾處理羅非魚肉酶解液可以降低灰分含量,升高脂肪含量。經AB-8大孔樹脂動態吸附處理后,無論是流出液還是60%乙醇洗脫液灰分含量、脂肪含量均升高;綜上所述:陶瓷膜微濾和大孔樹脂吸附洗脫對酶解液蛋白質含量影響不大,而陶瓷膜對灰分有一定的截留作用。如圖1,微濾多肽粉(B)比酶解多肽粉(A)澄清、顏色白,說明陶瓷膜處理能起到除色作用。大孔樹脂吸附后的多肽粉(C)比酶解多肽粉(A)顏色白,而洗脫多肽粉(D)略呈黃色,可見大孔樹脂吸附也能起到脫色的效果。

表1 處理前后多肽的基本成分(干基計,%)Table 1 Basic ingredients of hydrolysis peptides before and after refining(dry basis,%)

圖1 精制前后多肽粉的色澤變化

2.2 對羅非魚肉多肽分子量分布的影響

酶解多肽、微濾多肽、大孔樹脂吸附流出多肽及洗脫多肽的HPSEC圖見圖2,分子量分布如表2。由表2可知,四種多肽主要由5 ku以下的肽段組成。微濾處理后,酶解多肽中除了<1 ku組分比例增加了4.25%外,1～2、2～3、3～5、5～8 ku組分的比例分別減少了7.29%、17.13%、33.93%和50.0%,說明50 nm微濾處理對多肽有截留作用,分子量越大,截留比例越大;與微濾多肽相比，AB-8大孔樹脂處理后,流出多肽中除了1～2、2～3 ku組分的比例分別增加了9.42%與2.51%外,其余組分的占比均下降；而洗脫多肽中,除了<1 ku組分比例減少了6.01%外,1～2、2～3、3～5、5～8 ku組分的比例分別增加了0.96%、62.01%、81.45%、200%,可見AB-8大孔樹脂對2～8 ku多肽的吸附較敏感。宋雪梅[14]利用凝膠色譜Sephadex G-25分離干酪中的苦味肽，結果表明所有苦味肽組分的分子量在189～5000 u之間。Ney[15]發現,分子量大于6 ku的多肽沒有苦味,蔣雄武等[13]發現用大孔樹脂吸附羅非魚下腳料蛋白酶解液后,分子量在1～5 ku范圍內的短肽含量的降低可能與酶解液的苦味改善有很大關系。劉伯業[16]研究認為，如不考慮其它因素對苦味肽苦味閾值的影響,分子量處于0.5～3 ku區間的多肽比分子量處于0.18～0.5 ku區間的小肽含有更高比例的強苦味肽,解銘等[17]發現鱈魚肉酶解多肽苦味成分主要集中在分子量3～6 ku的多肽中,3 ku以下的多肽也有較明顯的苦味,由此,推測洗脫多肽中富集了苦味肽。

表2 處理前后多肽的分子量分布(%)Table 2 HPSEC chromatogram of hydrolysis peptides before and after refining(%)

圖2 處理前后多肽的分子量分布圖(HPSEC圖)

2.3 對酶解多肽氨基酸組成與含量的影響

表3分析了處理前后的羅非魚肉蛋白酶解多肽中16種游離氨基酸含量(色氨酸沒檢測)。與A相比,B的游離氨基酸總量減少3.96%,C的總量增大了19.06%,D的總量減少65.83%;A中必需氨基酸占總游離氨基酸的52.19%,B、C和D中則分別各占57.40%、53.33%和55.36%;說明微濾、吸附以及洗脫均提高了游離氨基酸中必需氨基酸的比例。

表3 處理前后酶解多肽的游離氨基酸含量(干基計,%)Table 3 Contents of free amino acids in components hydrolysis peptides before and after refining(dry basis,%)

由表4可知,與A比較,B、C、D的氨基酸總量分別減少了1.09%、2.02%和1.94%,四種多肽中必需氨基酸分別占氨基酸總量的41.15%、40.70%、38.98%和45.18%,苦味氨基酸分別占氨基酸總量的26.65%、26.12%、23.10%和34.53%,疏水性氨基酸分別占氨基酸總量的40.67%、39.93%、36.90%和53.35%。與B比較，C的氨基酸總量降低0.94%，必需氨基酸含量降低5.13%，苦味氨基酸與疏水性氨基酸含量分別降低12.35%和8.44%。可見,陶瓷膜微濾對酶解多肽的氨基酸組成影響不大;大孔樹脂吸附使酶解多肽氨基酸總量、必需氨基酸、苦味氨基酸與疏水性氨基酸含量降低;大孔樹脂洗脫則使酶解多肽必需氨基酸、苦味肽與疏水性氨基酸含量提高。這也與魏芳等[18]用大孔樹脂分離阿膠低聚肽,測得分離后的阿膠低聚肽疏水性氨基酸含量比分離前低的結果相一致。

表4 處理前后酶解多肽的總氨基酸含量(干基計,%)Table 4 Contents of total amino acidss in components hydrolysis peptides before and after refining(dry basis,%)

從單個的氨基酸來分析,與酶解多肽相比,流出多肽中苯丙氨酸、脯氨酸和酪氨酸分別增加了107.00%、83.97%和32.63%,大孔樹脂比較易于吸附苯丙氨酸、脯氨酸和酪氨酸;且其對異亮氨酸、亮氨酸和蛋氨酸也有較強吸附作用,即吸附較多的苦味氨基酸。這與趙謀明等[19]研究發現大孔樹脂對氨基酸的吸附具有一定的選擇性的結論相一致。同時,表4中C的前6種氨基酸含量與A、B、D相對偏高,可能是由于氨基酸受自身極性及其他因素的影響,不同的氨基酸被大孔樹脂吸附的量有所不同,而組分中總氨基酸含量的減少導致個別氨基酸含量的變動。

比較A、B、C、D四種多肽的游離氨基酸與總氨基酸總量,可得四種多肽中游離氨基酸的比例分別有8.18%、7.95%、9.94%、2.85%,說明大孔樹脂對肽的吸附能力較強,游離氨基酸吸附較少。

綜上所得,從游離氨基酸結果看,陶瓷膜微濾處理除了富集賴氨酸以外,對酶解多肽的氨基酸組成影響不大;大孔樹脂對肽的吸附能力較強,游離氨基酸吸附較少;大孔樹脂對苦味氨基酸和疏水性氨基酸有較強吸附作用,進一步推測出大孔樹脂吸附處理后的洗脫組分可能富集了苦味肽。

2.4 處理前后酶解多肽的反相液相分析

苦味肽一般由幾個帶有疏水側鏈的氨基酸組成,這些疏水性基團通常隱藏在蛋白質的內部,通過酶解暴露出來后與苦味受體相互作用進而產生苦味[20]。反相液相(RP-HPLC)固相載體有疏水性,它可以根據被分離物質分子疏水性的不同而在反相柱中彼此分離,由此疏水性較弱的分子較快流出,疏水性相對較強的分子在柱內保留時間相對較長,出峰時間晚些。研究認為苦味肽的苦味強度與疏水性氨基酸含量有關[14],Cliffe等[21]證實在RPLC上保留時間短的是無苦味、低分子量的親水性肽與氨基酸,保留時間長的是苦味、大分子量的疏水性肽。Wang等[22]用HILICL-RPLC分離系統分離親水性溶質與疏水性溶質,結果表明C18柱對親水性溶質的保留效果較弱。Newman等[23]利用RP-HPLC和感官評定分析巴氏殺菌奶酪,結果發現疏水性多肽含量與苦味值成正相關。采用RP-HPLC分析的酶解多肽粉、微濾多肽粉、吸附多肽粉與洗脫多肽粉結果如圖3。

圖3 處理前后酶解多肽的反相色譜圖

比較圖3a和圖3b可知,微濾多肽中保留時間在10 min前的組分含量減少,10 min后的組分相差不大,這與氨基酸結果中微濾多肽的游離氨基酸含量減少一致;比較圖3b和圖3c可知,流出多肽中保留時間在10 min前的組分含量增加,10 min后的組分含量減少,這也與氨基酸結果中流出多肽的游離氨基酸含量增加一致,同時表明AB-8大孔樹脂主要吸附極性弱、疏水性強肽;比較圖3b和圖3d可知,洗脫多肽中保留時間在15 min前的組分含量大幅減少,這也與氨基酸結果中洗脫多肽的游離氨基酸含量大幅減少一致。根據反相色譜的原理,出峰時間是由溶質的親水性和疏水性決定的,比較圖3a～圖3d,可知洗脫多肽中疏水性肽段較多,推測洗脫多肽中含有較多的苦味肽段,表明大孔樹脂能吸附苦味肽。

3 結論

陶瓷膜微濾處理對羅非魚肉酶解多肽的灰分有截留作用,對酶解多肽的其他基本成分含量基本無影響;與酶解多肽相比，大孔樹脂AB-8吸附和洗脫處理后,蛋白損失率分別為1.99%和3.07%,灰分和脂肪含量都有所增加。陶瓷膜微濾和大孔樹脂吸附都起到脫色效果。

陶瓷膜微濾對酶解多肽粉的分子量分布影響不大。與微濾多肽相比，AB-8吸附多肽中,除了1～2、2～3 ku組分的比例增加外,其余組分的占比均下降；而洗脫多肽中,除了<1 ku組分比例減少外,1～2、2～3、3～5、5～8 ku組分的比例均增加,可見AB-8大孔樹脂對2～8 ku多肽的吸附較敏感。

陶瓷膜微濾處理除了富集賴氨酸以外,對酶解多肽的氨基酸組成影響不大;AB-8吸附使氨基酸總量、必需氨基酸、苦味氨基酸與疏水性氨基酸含量降低,對肽的吸附能力較強,對游離氨基酸吸附較少。

反相液相分析結果顯示,洗脫多肽粉比酶解多肽粉、微濾多肽粉與吸附多肽粉含有更多的疏水性肽段,即大孔樹脂可以吸附苦味肽改善羅非魚肉酶解液的風味。