脹桶番茄醬中腐敗微生物的分離及鑒定

李 慧,李 赫,陳歷水,*,歐靜堃,劉 蕾,史玉瑩,張連慧

(1.中糧營養健康研究院,北京 102209;2.老年營養食品研究北京市工程實驗室,北京 102209;3.北京工商大學，北京食品營養與人類健康高精尖創新中心,北京 100048)

番茄營養豐富、風味獨特,具有獨特的保健功效,是餐桌上常見的蔬菜之一。因番茄的保質期短,通常加工成番茄醬、番茄汁等制品以延長儲藏時間[1]。番茄醬是由成熟紅番茄經去皮、破碎、去籽等粗硬物質打漿后,再經濃縮、裝罐、殺菌而制成,是國內外餐桌上不可缺少的佐餐食品原料,其品質直接影響經濟效益[2]。

番茄醬加工工藝成熟,按照嚴格的工藝要求和貯藏條件能夠達到2年保質期,但是工廠為了降低貯藏、運輸和包裝成本,外包裝多采用鋼桶、木箱等形式,貯藏方式多為露天存放,以苫蓋篷布防護為主。在此過程中,番茄醬很容易在保質期內出現脹桶、漏醬、癟桶等問題,使產品變質。針對這些變質問題,國內外學者一直開展相關研究,為持續解決這一行業難題提供解決方案。楊紅紅等[3]從番茄醬中分離純化了芽孢桿菌、大腸埃希氏桿菌、棒桿菌、酵母菌及霉菌,并證明芽孢桿菌是引起番茄醬變質的主要腐敗菌。黃玲等[4]從脹袋番茄醬中分離出季也蒙假絲酵母和叢生絲孢酵母。Vercammen等[5]研究發現,肉毒梭狀芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌、酸土脂環酸芽孢桿菌是熱加工酸性食品的主要腐敗菌。因此,不同的脹氣番茄醬產品,應進行針對性分析,確定引起番茄醬產氣變質的主要原因,以提供更科學的解決方案。

本研究針對露天儲存的大桶番茄醬產品在38 ℃以上高溫條件下存在輕微產氣脹桶的問題,通過微生物分離純化及鑒定,以確認引起本研究大桶番茄醬脹氣的腐敗微生物類型,為番茄醬生產企業有效控制或者降低大桶番茄醬變質損失,保障番茄醬的質量與安全提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

金屬桶裝大罐番茄醬 新疆某番茄制品有限公司露天存放已有脹氣現象,每桶體積為100 kg;溴甲酚紫葡萄糖瓊脂培養基、皰肉瓊脂培養基、酸性肉湯培養基、麥芽浸膏(瓊脂)培養基、營養肉湯(瓊脂)培養基、MRS(瓊脂)培養基、瓊脂、酵母粉、蛋白胨 北京陸橋技術有限責任公司;葡萄糖 分析純,國藥集團化學試劑有限公司;細菌基因組DNA提取試劑盒(DP302)、酵母基因組脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)提取試劑盒(DP307)、聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)產物純化試劑盒 天根生化科技有限公司;脫氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleoside triphosphate,dNTP)、Taq酶(5 U/μL)、Buffer 寶生物工程(大連)有限公司;引物 英捷濰基上海貿易有限公司合成;API 50 CHB/20 E試劑條 法國梅里埃公司。

IPP260低溫培養箱 德國Memmert公司;超凈工作臺 新加坡ESCO公司;生物安全柜 美國LABCONCO公司;ATBTMNew ATB自動微生物鑒定系統 法國梅里埃公司;Scan1200自動菌落計數儀、400VW拍擊式均質器 法國Interscience公司;Scope A1正置相差顯微鏡 德國ZEISS公司;SQ510C立式壓力蒸汽滅菌器 日本YAMATO公司;Mini Bead beater-16 磨珠均質器 美國Biospec公司;Veriti梯度PCR儀 美國Lifetechnologies公司;NanoDrop 2000超微量分光光度計 美國Thermo Fisher公司;XR System凝膠成像系統 美國Bio-Rad公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 污染菌種的分離和純化 從脹桶番茄醬中選取顏色異常的樣品25 g,置于盛有225 mL磷酸鹽緩沖液的無菌均質袋中,利用拍擊式均質器拍打1～2 min,制成1∶10 (v/v)的樣品勻液,然后將此樣品進行10倍梯度稀釋至10-6備用。

取各梯度稀釋樣品勻液1 mL置于無菌平皿中,每個稀釋度4個平皿。后將15～20 mL冷卻至46 ℃的溴甲酚紫葡萄糖瓊脂培養基、皰肉瓊脂培養基、酸性肉湯瓊脂培養基傾注平皿,并轉動平皿使其混合均勻冷卻。待瓊脂凝固后,將平板翻轉。取各培養基的2塊平板(其中1塊平板在厭氧盒中),分別置于36、55 ℃恒溫培養箱中,培養3～5 d,均用于分離嗜中溫微生物和嗜熱微生物。

另取各梯度稀釋樣品勻液1 mL置于無菌平皿中,每個稀釋度做2個平皿。后將15～20 mL冷卻至46 ℃的麥芽浸膏瓊脂培養基、營養瓊脂培養基、MRS培養基傾注平皿,并轉動平皿使其混合均勻。待瓊脂凝固后,將平板翻轉,麥芽浸膏瓊脂培養基平板于28 ℃恒溫培養箱中培養3～5 d,用于分離真菌;營養瓊脂培養基、MRS培養基平板(其中一塊平板在厭氧盒中)置于36 ℃恒溫培養箱,培養2～3 d,用于分離其他腐敗微生物及乳酸菌類微生物。

根據菌落生長形態、大小及顏色的不同,挑選不同的單菌落接種于相應的固體培養基中進行純化,直至得到單一菌落。

1.2.2 形態學觀察 將純化得到的細菌在相對應的分離固體培養基上劃線,36 ℃培養24～48 h后觀察菌落生長情況、菌落形態并鏡檢。將分離得到的真菌在麥汁瓊脂培養基上進行劃線,于28 ℃條件下培養3～5 d后觀察菌落生長情況、菌落形態并鏡檢。

1.2.3 分子生物學鑒定

1.2.3.1 細菌的分子生物學鑒定 挑取細菌平板上的單菌落分別接種營養肉湯培養基中,37 ℃過夜。取1 mL菌液12000 r/min離心10 min后,棄去上清,按照細菌基因組DNA提取試劑盒提取基因組的說明書規定操作,所得的基因組用超微量紫外分光光度計檢測濃度和純度。

16S rDNA序列擴增所用引物,正向引物為27F:5′-AGAGCCTGGCTCAGTTTGAT-3′反向引物為1492R:5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′[6-8]。

PCR反應體系:30 μL反應體系,依次加入無酶無菌水19.2 μL、10×Buffer 3 μL、dNTPs 2.5 μL、正、反向引物各1.5 μL、Taq酶0.3 μL(5 U/μL)、所提取的基因組2 μL。PCR反應條件:95 ℃預變性10 min,進入循環程序,95 ℃變性30 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,35個循環,再72 ℃延伸10 min,4 ℃條件下暫時保存,-20 ℃條件下保存備用。PCR完成后將PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

將電泳檢測后的PCR產物送至英濰捷基上海貿易有限公司進行測序,獲得16S rDNA基因序列。測序結果在NCBI的GenBank中進行BLAST分析比對,并進行同源序列搜索,根據同源序列搜索結果,導出同源性達99%以上相關模式菌株的16S rDNA基因序列區構建系統發育樹。

1.2.3.2 真菌分子生物學鑒定 挑取麥汁平板上的單菌落于YPD培養基中,在28 ℃恒溫搖床中200 r/min振蕩培養15 h。12000 r/min離心10 min后,棄去上清,按照酵母基因組DNA提取試劑盒提取基因組的說明書規定操作,所得的基因組用超微量紫外分光光度計檢測濃度和純度。

ITS區域擴增所用引物對參照李慧等[9]、Chen等[10]的研究,ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和 ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′),PCR反應體系同方法1.2.3.1,PCR反應條件為:95 ℃預變性5 min,進入循環程序,95 ℃變性1 min,52 ℃退火2 min,72 ℃延伸1 min,循環35次,72 ℃延伸10 min,4 ℃條件下暫時保存,-20 ℃條件下保存備用。PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測后送至英濰捷基上海貿易有限公司進行測序,獲得ITS基因序列。測序結果在NCBI的GenBank中進行BLAST分析比對,并進行同源序列搜索,根據同源序列搜索結果,導出同源性達99%以上相關模式菌株的ITS基因序列區構建系統發育樹。

1.2.4 細菌生化鑒定 挑取培養的單菌落,使用法國生物梅里埃公司API 50 CHB/20 E試劑條進行鑒定。

1.3 數據處理

使用MEGA 6.0軟件對分離、純化腐敗微生物的分子序列測序結果構建進化樹。

2 結果與分析

2.1 細菌的鑒定

2.1.1 細菌的菌落形態及鏡檢結果 通過對番茄醬中的細菌進行分離、簡單形態學分析后得到4株不同形態的細菌,依次編號為B001、B002、B003和B004。將菌株B001、B002、B003和B004在營養瓊脂培養基上劃線,(36±1) ℃培養48 h后觀察。

如圖1菌株B001菌落直徑3 mm左右,表面光滑,邊緣整齊,不透明,奶油狀,有芽孢,芽孢中生,橢圓形;菌株B002菌落直徑5～7 mm,邊緣不整齊,菌落白色,有芽孢,芽孢中生,橢圓形;菌株B003菌落直徑3～5 mm,圓形或近似圓形、邊緣不規則,菌落略帶黃色,有芽孢,芽孢中生;菌株B004菌落直徑5～7 mm,圓形或近似圓形,白色菌落,有芽孢,芽孢端生。

圖1 細菌的菌落形態及鏡檢結果(1000×)

2.1.2 細菌16S rDNA基因序列同源性比對與系統發育分析 將菌株B001、B002、B003、B004的擴增基因序列與GenBank內已知菌株的相應序列進行比對,通過同源性比對結果構建系統發育進化樹。以16S rDNA基因序列為分子標記的4株細菌系統發育樹,如圖2所示。菌株B001與Paenibacilluscinerisstrain 1-3在同一分枝上,且通過Bootstrap的驗證表明它們具有較高的置信度,支持度達到85%(圖2a),因此可以將分離菌株B1確定為厚壁類芽孢桿菌(Paenibacilluscineris)。菌株B002與Bacilluscereusstrain AER315-11在同一分枝上,且通過Bootstrap的驗證表明它們具有較高的置信度,支持度達到77%(圖2b),因此可以將分離菌株B002確定為蠟樣芽胞桿菌(Bacilluscereus)。菌株B003與GenBank內的Bacillussp.hb38在同一分支上(圖2 c),菌株B004與GenBank內的Bacillussp.CZGRY8在同一分支上(圖2 d),對于鑒定到屬的菌株B003和B004進一步利用生化鑒定方法確認。

圖2 以16S rDNA基因序列為分子標記的4株細菌系統發育樹

2.1.3 細菌的生化鑒定結果 對16S rDNA系統發育分析鑒定到屬的菌株B003、B004,進一步利用法國梅里埃ATP鑒定系統鑒定。由表1可知,菌株B003生化試驗鑒定結果為蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus),鑒定百分率為92%。

表1 菌株B003的生理生化鑒定試驗結果Table 1 Physiological and biochemical tests results of strain B003

由表2可知,菌株B 004生化鑒定試驗結果為蕈狀芽孢桿菌(Bacillusmycoides),鑒定百分率為81.2%。

表2 菌株B 004的生理生化鑒定試驗結果Table 2 Physiological and biochemical tests results of strain B004

番茄醬類的酸性罐頭食品中發現有芽孢桿菌的存在,說明可能是殺菌不徹底或有漏罐現象發生[5]。吳海文等[11]采用錳營養、甘露醇卵黃多粘菌素、嗜熱耐酸桿菌、脂耐熱嗜酸桿菌、溴甲酚紫葡萄糖肉湯、平酸菌增菌和液體硫乙醇酸鹽7種液體培養基對供試番茄醬在37 ℃和55 ℃下培養,分離鑒定出的主要細菌是枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和矮小芽孢桿菌,均為產酸不產氣可導致番茄醬平酸腐敗的好氧芽孢菌。楊紅紅等[3]的研究證明,番茄醬中污染了芽孢類細菌,會造成番茄醬的異味、變色的現象。芽孢桿菌(如解淀粉芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌)是紅油豆瓣醬產氣脹罐的主要原因[12]。

2.2 真菌的鑒定

2.2.1 真菌的菌落形態及鏡檢結果 從番茄醬中分離、純化得到1株真菌,編號為F001。如圖3所示,該真菌在麥汁瓊脂培養基上(28±1) ℃需氧培養3 d后,菌落呈乳白色,濕潤、質地均勻、菌體單細胞呈臘腸形,出芽生殖。

圖3 真菌的菌落形態及鏡檢結果(1000×)

2.2.2 真菌ITS同源性比對與系統發育分析 將菌株F001的擴增基因序列與GenBank內已知菌株的相應序列進行比對,通過同源性比對結果構建系統發育進化樹。菌株F001與多株Pichiakudriavzstrain的同源性達99%以上。菌株F001與Pichiakudriavzstrain CBS5147、Pichiakudriavzstrain 573、Pichiakudriavzstrain SJP、PichiakudriavzCDA 169Y2在同一分枝上,通過Bootstrap的驗證表明它們具有較高的置信,支持度達到84%(圖4)因此可以將分離菌株F001確定為奧默畢赤酵母(Pichiakudriavzevii)。

圖4 以ITS序列為分子標記的酵母菌系統發育樹

在低pH、低水活性、低濕度、高鹽或高糖的食品中,多數細菌無法在這種環境中生長繁殖,而酵母菌由于其耐受性較強,能夠生長[13]。畢赤酵母屬常在酸性食品中存在生長,為一些不耐酸的腐敗菌創造條件,并引起食品腐敗變質[14]。姚曉瑞寧等[15]從庫爾勒香梨中分離出了奧默畢赤酵母(Pichiakudriavzevii),該菌具有耐高糖、低酸、耐乙醇及二氧化硫等特性。本研究從漲罐番茄醬中分離出了奧默畢赤酵母,這是引起番茄醬漲袋的主要腐敗真菌。陸文俊等[16]從蜂蜜、草莓、香蕉、橙子、油桃、芒果中共分離出了22株酵母,研究發現這些酵母菌是引起水果腐敗的主要微生物。

閆國宏等[17]對從疑似脹袋的番茄醬中檢測出酵母菌和霉菌,分析后認為引起高溫條件下(38 ℃以上)的番茄醬脹袋,是由于罐頭加熱殺菌不充分,或罐頭密封不良導致真空度不夠或漏氣引起的。番茄醬產品特性決定其發生產氣變質的概率極低,但當原料受到的污染程度較嚴重,生產過程中工藝,參數或某個工序運行環節出現異常波動、生產設備管路存在泄漏或死角、產品殺菌不徹底、罐裝機殺菌溫度不足或受到污染、產品貯存不當或貯存溫度過高時、無菌袋質量存在缺陷和被污染及產品處于非商業無菌狀態時均存在產氣變質的隱患。罐裝番茄醬產品應滿足商業無菌的要求,銷往熱帶地區的產品,在商業無菌檢測同時建議同時55 ℃保溫5～7 d后觀察其商業無菌狀態,以有效避免產品在高溫貯存條件下放置一段時間后出現產氣或變質問題[18]。

3 結論

本研究對脹罐番茄醬污染微生物進行分離和純化,獲得4株形態不一的細菌。進一步對分離的細菌進行了形態學觀察、16S rDNA分子序列測序、構建系統發育樹,并結合生理生化鑒定,細菌B001、B002、B003、B004分別為厚壁類芽孢桿菌(Paenibacilluscineris)、蠟樣芽胞桿菌(Bacilluscereus)、蠟樣芽胞桿菌(Bacilluscereus)和蕈狀芽孢桿菌(Bacillusmycoides);鑒定結果顯示芽孢桿菌屬是番茄醬中的主要腐敗微生物。從脹罐番茄醬中分離和純化得到一株單細胞真菌,對該單細胞真菌進行形態學鑒定,ITS分子序列測序并進一步構建系統發育樹,確定該菌為奧默畢赤酵母(Pichiakudriavzevil)。因此,番茄醬在加工儲藏過程中應注意防止此類微生物的危害。