檸檬皮中檸檬苦素對根霉的抑菌活性和機理

王 輝,曾曉房,,馮衛華,,于立梅,翟萬京,白衛東,,曾令鋼

(1.仲愷農業工程學院輕工食品學院,廣東廣州 510550;2.廣東中興綠豐發展有限公司,廣東河源 517000)

我國是檸檬種植大國,2013年全國檸檬種植面積高達5萬公頃,且檸檬平均每畝產量高達1066.7千克[1]。檸檬果肉可食用,但檸檬皮呈苦味,以提取檸檬精油、果膠、膳食纖維等加工為主。檸檬皮中含有豐富的檸檬苦素,檸檬苦素及其類似物是一類含有4,4,8-三甲基-17-呋喃基甾體基本骨架結構的化合物。目前已分離出36種檸檬苦素類似物和19種配糖體,包括檸檬苦素、諾米林、諾米林酸、奧巴叩酮等[2]。已發現檸檬苦素類化合物具有抑菌、殺蟲、消炎、抗腫瘤等作用[3-4]。根霉(Rhizopus)是廣泛存在于自然界中的一類真菌,是釀造業常用的糖化菌,但也會引起食物等霉變[5]。已有利用羅漢果、木醋液、植物黃酮、黃芩提取物等對根霉的抑菌性能的研究[5-8]。也有關于檸檬苦素抑菌活性的研究,如李彪等[9]發現柚子皮中檸檬苦素對小麥紋枯病原菌、水稻紋枯病原菌等的生長有一定抑制作用;李赤翎等[10]發現檸檬苦素類似物對細菌與真菌的抑制效果明顯。但尚未有檸檬苦素對根霉的抑菌活性和抑菌機理的研究。

因此,本文以根霉為研究對象,通過測定檸檬苦素對根霉的MIC、MBC、孢子萌發抑制率和菌絲生長抑制率確定抑菌活性,并進一步研究了多種因素對抑菌活性的影響。同時,通過測定根霉胞外蛋白質含量、堿性磷酸酶(AKP)活力、菌絲體總糖含量,并結合掃描電鏡觀察,初步闡述檸檬苦素對根霉的抑菌機理,為開發檸檬苦素作為天然抑菌劑應用于食品領域提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

脫脂檸檬皮粉 廣東中興綠豐發展有限公司提供;根霉(Rhizopus) 仲愷農業工程學院輕工食品學院微生物實驗室保藏;馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養基、馬鈴薯葡萄糖液體(PDB)培養基 廣東環凱微生物科技有限公司;檸檬苦素標準品(純度99.98%) 濟寧天之藍生物科技有限公司;堿性磷酸酶試劑盒 上海酶聯生物科技有限公司;考馬斯亮藍-G250、蒽酮 北京索萊寶科技有限公司;福林試劑、石油醚、二氯甲烷、無水乙醇等 均為分析純。

JEOL-6360LV型掃描電子顯微鏡、JFD-320型冷凍干燥儀、JFC-1600型離子濺射儀 日本電子株式會社;DDS-18A型精密數字式電導率儀 上海日島科學儀器有限公司;SW-CJ-1FD型凈化工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司;PYX-280S-A型生化培養箱 韶關市科力實驗儀器有限公司;UV759型紫外分光光度計 上海橫搖科技有限公司;DSX-280型手提式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫療器械廠;THZ-82型冷凍水浴恒溫振蕩器 金壇市中大儀器廠;XHRE-52A型旋轉蒸發儀 鄭州豫華儀器制造有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 檸檬皮中檸檬苦素溶液的制備 10 g脫脂檸檬皮粉中加入400 mL 80%乙醇溶液,60 ℃下振蕩提取120 min后真空濃縮至10 mL。濃縮液加入等體積的二氯甲烷重復萃取5次后,40 ℃下真空旋轉蒸發得到檸檬苦素結晶。使用時以適量15%乙醇溶液溶解制得檸檬苦素溶液[11]。

1.2.2 孢子懸浮液的制備 向根霉的PDA斜面培養物中加入無菌生理鹽水,將孢子洗脫,后用400目滅菌紗布過濾制得孢子懸浮液,用血球計數板計數調整孢子懸浮液濃度為108個/mL,4 ℃冰箱保藏,備用。

1.2.3 檸檬苦素抑制根霉活性的測定

1.2.3.1 MIC及MBC的測定 用試管法測定MIC。用移液槍移取2 mL質量濃度為10000 μg/mL檸檬苦素溶液于1號試管中;接著從第1管中移取1 mL液體于2號管中;按照此倍半稀釋法稀釋至8號管。1～8號試管分別加入0.9 mL PDB培養基和0.1 mL根霉孢子懸浮液。9號試管為空白對照,只加入培養基和檸檬苦素溶液,不接種菌液;10號管為菌液對照組,不加入檸檬苦素溶液,均以無菌水代替。28 ℃培養箱培養2 d[12]。以試管中無菌生長的最低濃度檸檬苦素濃度為MIC。分別從無菌生長的試管中各取100 μL液體涂布于PDA平板培養基,28 ℃培養箱培養5 d,以培養皿中無菌生長的最低檸檬苦素濃度為MBC。

孢子萌發抑制率(%)=(對照組萌發數-處理組萌發率)×100/對照組萌發數

1.2.3.3 菌絲生長抑制率的測定 在培養皿中分別加入不同質量濃度(如1.2.3.2)的檸檬苦素溶液和PDA培養基,充分混勻,使每個平板培養基中檸檬苦素溶液的最終濃度分別為1250、625、312.5、156.25、78.125 μg/mL,備用。從用PDA培養基培養3 d的根霉菌落邊緣取直徑為4 mm的菌餅,將菌餅分別接種于平板培養基正中央,每個平板接種一個菌餅,菌絲面朝下,28 ℃培養箱中培養3 d。每組重復3次。用十字交叉法測量菌落直徑。以不同檸檬苦素濃度的對數值和菌絲生長抑制率,計算檸檬苦素對菌絲生長的毒力方程和半最大效應濃度EC50[14]。以15%無水乙醇為溶劑對照。

菌落直徑(mm)=測量菌落平均值-打孔器直徑

菌絲生長抑制率(%)=(對照組菌落直徑-處理組菌落直徑)×100/對照組菌落直徑

1.2.4 不同因素對檸檬苦素抑制根霉活性的影響

1.2.4.1 抑菌圈測定方法 在每個含根霉孢子濃度為106個/mL的PDA平板培養基上用打孔器打出3個直徑6 mm的小孔,分別加入85 μL檸檬苦素樣液、15%乙醇、無菌水,28 ℃培養箱中培養48 h。每組重復3次。用十字交叉法測量其抑菌圈直徑。

1.2.4.2 不同溫度對檸檬苦素溶液抑制根霉活性的影響 將檸檬苦素溶液置于40、60、80、100 ℃恒溫加熱30 min,若加熱后出現體積損失,則用15%乙醇調節至原體積,處理完畢后按照“1.2.4.1”測定抑菌圈直徑。

1.2.4.3 不同pH檸檬苦素溶液的配制 配制不同pH的緩沖溶液,與檸檬苦素溶液以3∶1的比例混合,制成pH分別為2、4、6、8、10的檸檬苦素樣液后按照“1.2.4.1”測定抑菌圈直徑。

1.2.4.4 明膠對檸檬苦素抑制根霉活性的影響 檸檬苦素溶液與1 mg/mL的明膠溶液以1∶1 (v/v)的比例混合均勻,置于室溫下避光孵育0、0.5、1.0、6.0、12.0 h后按照“1.2.4.1”測定抑菌圈直徑。

1.2.4.5 Fe3+和Fe2+對檸檬苦素抑制根霉活性的影響 檸檬苦素溶液分別與10 mmol/L的FeCl3、FeSO4溶液以9∶1 (v/v)的比例混合均勻,室溫下避光孵育0、0.5、1.0、6.0、12.0 h后按照“1.2.4.1”測定抑菌圈直徑。

1.2.5 檸檬苦素抑制根霉的機理

1.2.5.1 檸檬苦素對根霉菌絲體總糖的影響 采用蒽酮比色法[15]。移取5 mL PDB培養液與0.1 mL根霉孢子懸浮液至離心管,28 ℃下150 r/min振蕩培養5 d后,分別加入等量不同濃度(0、312.5、625、1250、2500、5000 μg/mg)的檸檬苦素溶液。以加入等量的15%乙醇作為對照。混合液振蕩培養3 d后過濾得根霉菌絲,用蒸餾水沖洗菌絲數遍后用濾紙吸干。稱取0.05 g菌絲,加入蒸餾水研磨至糊狀后加水至5 mL,沸水浴15 min后快速冷卻至室溫。用蒸餾水定容至25 mL,加入0.25 mL 10%醋酸鉛溶液,充分搖勻,以沉淀其中的蛋白質。反應完全后,加入0.05 g草酸以除去過量的醋酸鉛溶液,充分搖勻,反應完全后過濾。分別取濾液2 mL,加入0.5 mL蒽酮試劑和5 mL濃H2SO4,搖勻后密封置于沸水浴加熱5 min后,快速冷卻至室溫,靜置片刻,于620 nm波長下測定OD值。每個處理重復 3 次。根據已得葡萄糖標準曲線(y=0.009x+0.0031,R2=0.9979)得到含糖量A。

式中:A為在標準曲線上查得的含糖量,μg;V為總體積,mL;Vs為測定取樣體積,mL;W為樣品質量,g。

1.2.5.2 檸檬苦素對根霉胞外可溶性蛋白含量的影響 采用考馬斯亮藍G-250比色法[16]。制得標準曲線:y=0.0058x-0.0135,R2=0.9931。將根霉孢子懸液接種于PDB培養基,加入檸檬苦素使其最終濃度為MIC后,置于28 ℃恒溫培養,分別于0、8、16、24、32、40 h移取孢子懸浮液,1000 r/min離心10 min后,取0.1 mL上清液、5 mL考馬斯亮藍G-250試劑和0.9 mL蒸餾水,充分混勻,放置5 min后,在595 nm波長下測定其OD值。以加入15%乙醇為對照。根據所測樣液的OD值,通過標準曲線計算蛋白質含量。

1.2.5.3 根霉菌液堿性磷酸酶(AKP)活力的測定 采用比色法[17]。調整濃度為106個/mL的根霉孢子懸浮液中的檸檬苦素最終濃度為1×MIC。將混合液于28 ℃,150 r/min振蕩孵育0、2、4、6、8、10 h后,1000 r/min離心10 min,取上清液按照堿性磷酸酶(AKP)試劑盒方法測定其AKP活力。以15%乙醇作為對照。

1.2.5.4 掃描電鏡分析 取100 μL 106個/mL的根霉孢子懸浮液涂布在PDA平板培養基上,28 ℃恒溫培養48 h后,用打孔器制得直徑為4 mm的菌餅,將菌餅倒置在含有2×MIC濃度檸檬苦素的PDA培養基上,28 ℃培養48h。用無菌的鑷子將平板上的菌絲刮下,放入裝有2.5%戊二醛固定液的離心管內,在4 ℃下固定13 h。用pH為5.6的磷酸鹽緩沖液沖洗5 min,共洗2次,以去除孢子中的戊二醛。在4 ℃、12000 r/min條件下離心10 min,除去上清液,加入0.5 mL無菌水搖晃至孢子懸浮。取一滴于潔凈的蓋玻片上,經空氣干燥后,噴金鏡檢[18]。以15%乙醇為對照。

1.3 數據處理

每個測定均重復三次,結果表示為平均值±標準偏差。應用SPSS 22.0軟件(SPSS Inc.,Chicago,IL,USA)中的One-Way ANOVA對所有數據進行方差分析,利用鄧肯式多重比較對差異顯著性進行分析。

2 結果與分析

2.1 檸檬苦素抑制根霉的活性

2.1.1 檸檬苦素對根霉的MIC和MBC 由表1可知,檸檬苦素對根霉的MIC為1250 μg/mL,MBC為5000 μg/mL。

表1 檸檬苦素對根霉的MIC和MBCTable 1 MIC and MBC of limonoids against Rhizopus

2.1.2 檸檬苦素對根霉孢子萌發和菌絲生長抑制率的影響 由表2可知,檸檬苦素抑制根霉孢子萌發的EC50值約為菌絲生長的EC50值的53.79%。由圖1可知,檸檬苦素質量濃度為312.5 μg/mL時,對根霉孢子萌發的抑制率開始快速提高;而對菌絲生長抑制率在濃度高于625 μg/mL時開始快速提高。檸檬苦素質量濃度為156.25～1250 μg/mL時,孢子萌發抑制率的提升速率較快;在檸檬苦素質量濃度為1250～2500 μg/mL時,菌絲生長抑制率的增長趨勢大于孢子萌發抑制率。但相同濃度檸檬苦素對根霉孢子萌發抑制率始終大于菌絲生長抑制率。因此,相同質量濃度檸檬苦素對根霉孢子萌發具有更強的抑制作用,高濃度檸檬苦素對根霉菌絲才有較好的抑制作用。

表2 檸檬苦素對根霉的毒力回歸方程和EC50Table 2 Virulence regression equation and EC50 of limonoids against Rhizopus

圖1 檸檬苦素對根霉的菌絲和孢子萌發的抑制率

2.2 不同因素對檸檬苦素抑制根霉活性的影響

由圖2A、圖2C可知,經過不同溫度和添加明膠的處理后,檸檬苦素對根霉的抑菌活性沒有顯著變化(p>0.05)。由圖2B可知,pH為4和6時,檸檬苦素對根霉的抑菌活性最強;隨著pH升高或降低,抑菌活性逐漸顯著減弱(p<0.05)。這與薤白乙醇提取物的抑菌活性受pH影響的研究結果一致[18]。可能是因為檸檬苦素溶液pH接近4,環境的酸堿性改變會造成其變性,從而抑菌活性降低;而根霉受強酸和強堿環境影響較小,從而導致抑菌圈直徑變小。同時,由圖2D可知,Fe3+、Fe2+均能顯著增強檸檬苦素的抑菌活性(p<0.05),且隨處理時間延長,增強作用比較穩定。

圖2 不同因素對檸檬苦素抑制根霉活性的影響

2.3 檸檬苦素抑制根霉的機理

2.3.1 檸檬苦素對根霉菌絲總糖含量的影響 由圖3可知,對照菌絲體總糖含量為0.12%,經質量濃度為312.5 μg/mL的檸檬苦素處理后,根霉菌絲體總糖含量為0.11%,是對照菌絲體總糖含量的87.53%。隨著處理檸檬苦素溶液濃度的提高,菌絲體總糖含量降低。當檸檬苦素質量濃度為5000 μg/mL時,菌絲體總糖含量僅為0.04%,為對照菌絲體總糖含量的32.66%。經Duncan方差分析,隨檸檬苦素處理濃度的增大,根霉菌絲體總糖含量呈現顯著下降的趨勢(p<0.05)。說明經檸檬苦素處理后,根霉菌絲體內糖外滲,且隨檸檬苦素濃度增高,外滲量增大,菌絲體總糖含量越低。

圖3 檸檬苦素濃度對根霉菌絲總糖含量的影響

2.3.2 檸檬苦素對根霉胞外可溶性蛋白含量的影響 由圖4可知,檸檬苦素處理組和對照組的胞外蛋白質含量均呈上升,并逐漸穩定的趨勢,但處理組胞外蛋白質含量上升幅度遠遠大于對照組。說明15%乙醇和檸檬苦素均會導致根霉胞內蛋白質滲出,但檸檬苦素的作用明顯更強。同時可知,處理組胞外蛋白質含量在作用初期開始迅速上升,處理時間為16 h時,胞外蛋白質含量達到最高值,并小幅下降,趨于穩定。說明檸檬苦素迅速影響了根霉細胞膜的通透性,處理時間為16 h時,胞內蛋白質滲出已達最高值;且質量濃度為625 μg/mL(MIC)的檸檬苦素對根霉的作用是抑制,并非殺滅[19],根霉可以利用胞外蛋白質進行一定的生長代謝,因此,胞外蛋白質含量會出現小幅波動。

圖4 檸檬苦素對根霉胞外蛋白質含量的影響

2.3.3 檸檬苦素對根霉菌液AKP活力的影響 堿性磷酸酶(AKP)是一種存在與細胞壁與細胞膜之間的酶,當細胞壁遭受破壞時,AKP泄露,因此通過檢測細胞外AKP活力即可反映出細胞壁完整性[20]。由圖5可知,檸檬苦素處理組AKP活力從處理初期開始呈持續上升趨勢,在8 h后趨于穩定,且AKP活力遠遠大于對照組。說明檸檬苦素可以使根霉細胞壁的通透性發生了變化,導致根霉內AKP大量滲出;且8 h后檸檬苦素對根霉細胞壁破壞作用已基本完成。

圖5 檸檬苦素對根霉菌液AKP活力的影響

2.4 電鏡分析

由圖6可知,在檸檬苦素作用后,根霉形態與對照組相比發生了明顯變化。對照組根霉的孢子(圖6A1和圖6B1)表面完整、光滑,形態較飽滿;菌絲(圖6C1)粗壯、表面光滑,無斷裂。2×MIC濃度檸檬苦素處理后的根霉孢子(圖6A2和圖6B2)凹陷嚴重,溶出物明顯,出現嚴重皺縮現象;菌絲(圖6C2)出現斷裂扭曲、變形、變細。與對細胞壁、細胞膜破壞性以及對孢子、菌絲的抑制作用研究結果一致。

圖6 根霉掃描電鏡圖

3 結論

檸檬苦素對根霉的MIC和MBC分別為1250和5000 μg/mL;相同濃度下,孢子萌發抑制率大于菌絲生長抑制率。檸檬苦素對根霉的抑菌活性不受加熱和明膠的影響,在弱酸性環境較強,且Fe3+、Fe2+均能提高檸檬苦素的抑菌活性。因此,檸檬苦素比較適合在弱酸性的環境中應用,并且可以應用于富含Fe3+、Fe2+和蛋白質,需要經過高溫處理的食品中作為根霉的抑菌劑。進一步對檸檬苦素抑菌機理的研究發現,檸檬苦素可以使根霉胞內物質大量滲出。隨著處理濃度增加,滲出量增大。且處理前期,處理時間越長,胞內物質滲出量越大;但到8和16 h時,AKP和蛋白質滲出量基本趨于穩定。通過掃描電鏡觀察發現經檸檬苦素處理的根霉孢子出現變形,溶出物滲出明顯;菌絲發生細微斷裂扭曲、變形、變細。因此,檸檬苦素可以使根霉細胞變形、破裂,通過改變根霉細胞壁和細胞膜的通透性,使胞內物質滲出,從而抑制根霉的生長。