辣木葉蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物的制備及其抗菌活性研究

康丹丹,李照瑩,董浩瀾,周 偉,李積華,彭芍丹,郭長青

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,湖北武漢 430070;2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部熱帶作物產(chǎn)品加工重點實驗室,廣東湛江 524001;3.南昌大學(xué)食品學(xué)院,江西南昌 330000;4.海南省果蔬貯藏與加工重點實驗室,廣東湛江 524001;5.河南金辣木生物科技有限公司,河南鶴壁 458000)

在食品加工、運(yùn)輸及貯存過程中,添加食品防腐劑可有效防止食品腐敗變質(zhì)、保障食品質(zhì)量安全[1]。目前,我國食品行業(yè)中使用的防腐劑大多數(shù)是人工合成的。然而,在長期使用過程中,合成防腐劑的致畸、致癌等副作用逐漸凸顯,人們更加關(guān)注天然防腐劑的研發(fā)[2]。其中,抗菌肽具有抗細(xì)菌、真菌以及病毒等多種生物活性且不易產(chǎn)生抗藥性,有望成為抗生素及化學(xué)防腐劑的理想替代品,應(yīng)用于化妝品、食品、醫(yī)藥等行業(yè)[3]。

辣木(MoringaoleiferaLam.),為熱帶落葉喬木,原產(chǎn)于印度北部,我國臺灣、云南及廣東等地均有種植,其花、葉及種子等部位均含有豐富的營養(yǎng)成分,是優(yōu)質(zhì)食品原料[4-5]。2012年11月,我國衛(wèi)生部批準(zhǔn)辣木葉為新資源食品[6]。目前,研究發(fā)現(xiàn)辣木葉具有抗炎抑菌、抗病毒、抗氧化、降血糖、抗腫瘤等多種生物活性[7-9]。Jayawardana等[10]將不同量的辣木葉粉末加入到香腸中,儲藏一段時間后研究其菌落生長情況,發(fā)現(xiàn)大腸桿菌被完全抑菌,而金黃色葡萄球菌菌落數(shù)小于102CFU/g,推測其抗菌活性可能與其中的小分子蛋白及多肽有關(guān),但未深入研究。此外,研究表明辣木葉中富含蛋白質(zhì),含量在27%～37%,與大豆相當(dāng)[11],但是,辣木葉蛋白體外消化率低且多作為動物飼料使用,造成資源的極大浪費[12]。酶法酶解蛋白,可將其水解成具有特異抗菌活性的小分子肽,并易于被人體消化吸收[13]。

因此,本研究以辣木葉為原料,提取辣木葉中蛋白質(zhì)并評估其抗菌活性,并以酶解產(chǎn)物抑菌活性為指標(biāo),比較單酶酶法及復(fù)合酶酶解效果,選擇最優(yōu)酶解酶,分析酶解產(chǎn)物的抑菌譜及最小抑菌濃度,為實現(xiàn)辣木葉蛋白價值最大化提供有益思路,并為辣木葉抗菌肽的制備和應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

辣木葉 河南金辣木生物科技有限公司;堿性蛋白酶(酶活力200 U/mg)、木瓜蛋白酶(酶活力80萬 U/g)、胰蛋白酶(酶活力250 N.F.U/mg)、中性蛋白酶(酶活力60000 U/g)、胃蛋白酶(酶活力250 U/mg) 北京索萊寶科技有限公司;菠蘿蛋白酶 實驗室自制[14](酶活力 6.94×106U/g,制備方法:菠蘿汁離心(4000 r/min,15 min)后取上清液,加0.01%(w:w)EDTA和0.005%(w:w)L-半胱氨酸,攪拌均勻,以此進(jìn)行微濾、超濾,收集濃縮液并凍干,得菠蘿蛋白酶粉末);營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基 海博生物技術(shù)有限公司;營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司;鹽酸、氫氧化鈉、無水乙醇、碳酸氫鈉 國產(chǎn)分析純,廣東光華科技股份有限公司;測試菌株包括3株革蘭氏陽性菌：金黃色葡萄球菌(StaphylococcusaureusCICC 25923)、化膿性鏈球菌(StreptococcusCICC 19616)、單增李斯特氏菌(ListeriamonocytogenesCICC 21574)、3株革蘭氏陰性菌：大腸桿菌(EscherichiacoliCICC(B)44103)、銅綠假單胞菌(PseudomonasaeruginosaCICC 27853)、鼠傷寒沙門氏菌(SalmonellatyphimuriumCICC 14028) 以上菌株均購于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

萬能高速粉碎機(jī) 上海菲力博食品有限公司;HG-50全自動高壓蒸汽滅菌鍋 日本Hirayama公司;ZHJH-C1115B超凈工作臺 上海智城分析儀器制造公司;梅特勒FE20-Five Easy PlusTMpH計 美國Mettler Toledo公司;UV-1780型紫外可見分光光度計 津島儀器(蘇州)有限公司;3-30K型低溫高速離心機(jī) 德國Sigma公司;Alpha1-2凍干機(jī) 北京博勱行儀器有限公司;KjeltecTM8400自動凱氏定氮儀 福斯華(北京)科貿(mào)有限公司;MJX-288型霉菌培養(yǎng)箱 寧波市科技園區(qū)新江南儀器有限公司;XW-80A漩渦混合器 上海青浦滬西儀器廠;LA8080氨基酸自動分析儀 日立高新技術(shù)公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 辣木葉蛋白質(zhì)的制備 選取無斑點、無蟲蛀的辣木葉,經(jīng)過粉碎機(jī)粉碎5 min,觀察無明顯顆粒后過60目篩,得辣木葉粉末。

參考Paula等[15]的辣木葉蛋白質(zhì)提取方法并適當(dāng)修改:取一定量的辣木葉粉末,按1∶100 (g/mL)的比例加入蒸餾水,調(diào)節(jié)pH為9.0,40 ℃水浴40 min,8000 r/min離心15 min,取上清液,調(diào)節(jié)pH為4～4.5后5000 r/min離心10 min,所得沉淀水洗2次,透析凍干,得辣木葉蛋白,于4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 辣木葉蛋白提取率測定 采用凱氏定氮法先測定辣木葉中粗蛋白含量:準(zhǔn)確稱取2.000 g供試?yán)蹦救~粉(精確到0.001 g),平行測定3份,算出平均值,同時吸取空白消化液做空白。同時采用凱氏定氮法測定辣木葉蛋白粉末中的蛋白質(zhì)含量(g/100 mL或g/100 g),蛋白質(zhì)提取率計算公式:

提取率(%)=提取的蛋白粉末中蛋白含量×100/辣木葉干粉中粗蛋白含量

1.2.3 辣木葉蛋白氨基酸組分測定 參考Kaushik等[16]的方法略作修改:樣品處理:采用鹽酸水解法對蛋白樣品進(jìn)行處理:稱取0.0200 g辣木葉樣品于水解管中,加入8 mL 6 mol/L HCl,真空封管并于110 ℃的烘箱內(nèi)水解24 h;冷卻,將水解液定容至25 mL,濾紙過濾;取濾液1 mL于燒杯中,40 ℃真空干燥25 min后加入1 mL 0.02 mol/L HCl,靜置1 h,倒入1.5 mL離心管內(nèi),10000 r/min離心10 min,取1 mL經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后轉(zhuǎn)移至Agilent專用樣品瓶內(nèi);上機(jī)分析。

氨基酸自動分析儀分析檢測條件為:(4.6×250) mm 5 μm ODS分析柱;柱溫40 ℃;反應(yīng)溫度97 ℃;緩沖液流速為0.225 mL/min;茚三酮流速為0.30 mL/min。

1.2.4 辣木葉蛋白抑菌活性評價

1.2.4.1 辣木葉蛋白溶液配制 冷凍干燥所得辣木葉蛋白,用滅菌水(121 ℃,高壓蒸汽滅菌20 min)溶解,配制成30 mg/mL的蛋白溶液,用0.22 μm無菌微孔濾膜過濾除菌,備用。

1.2.4.2 菌種培養(yǎng) 細(xì)菌培養(yǎng)使用營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基。將實驗用菌株接種到裝有培養(yǎng)基的試管內(nèi),37 ℃培養(yǎng)24 h。取活化好的菌種,分別溶于100 mL的無菌生理鹽水中,充分震蕩10 min。調(diào)整濁度,用麥?zhǔn)媳葷峁苤瞥珊鷶?shù)108CFU/mL的菌懸液,再逐級稀釋至106CFU/mL,備用。

1.2.4.3 抑菌圈大小 采用濾紙片-瓊脂擴(kuò)散法[17]測定提取物抑菌活性。取熔化的營養(yǎng)肉湯-瓊脂培養(yǎng)基大約20 mL倒入無菌培養(yǎng)皿中,水平放置,凝固后,在培養(yǎng)皿底部標(biāo)記濾紙片(直徑6 mm)的擺放位置及菌種等。取100 μL菌液均勻涂布于相應(yīng)固體培養(yǎng)基上,待菌液完全滲入后,于不同的標(biāo)記位置上放置對應(yīng)的濾紙片,重復(fù)3次。37 ℃恒溫培養(yǎng)18～24 h,采用十字交叉法測定抑菌圈直徑大小。并選擇30 mg/mL卡那霉素作為陽性對照,滅菌水為陰性對照。

抑菌圈實驗測定標(biāo)準(zhǔn):抑菌圈大于20 mm,極敏;15～20 mm,高敏;10～15 mm,中敏;7～10 mm,低敏;小于7 mm,不敏感。

1.2.5 辣木葉蛋白抑菌酶解產(chǎn)物的制備

1.2.5.1 單酶酶解 選用堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶、菠蘿蛋白酶6種酶,分別在其最適pH及溫度條件下對辣木葉蛋白進(jìn)行水解,酶解條件如表1。將辣木葉蛋白粉末配制成2%的溶液10 mL,調(diào)至適宜的溫度和pH,分別加入5000 U/g的蛋白酶,低速水浴震蕩2 h,沸水浴中維持滅酶15 min,將滅活后的酶解液降至室溫,5000 r/min離心15 min,取上清液,得粗酶解液,低溫保存作為進(jìn)一步實驗樣品備用。

表1 辣木葉蛋白酶解條件Table 1 Enzymatic hydrolysis conditions of Moringa oleifera leaves protein

1.2.5.2 復(fù)合酶酶解 選擇3種復(fù)合酶(胰蛋白酶+胃蛋白酶、胰蛋白酶+中性蛋白酶、胃蛋白酶+木瓜蛋白酶),復(fù)合酶所包含的兩種酶添加量分別為5000 U/g,在最適溫度及pH條件下前酶先酶解2 h后滅酶,加另一種酶酶解2 h后酶解結(jié)束,沸水浴中維持滅酶15 min,將滅活后的酶解液降至室溫,5000 r/min離心15 min,取上清液,得粗酶解液,4 ℃低溫保存?zhèn)溆谩Ｊ褂?.2.5.1及1.2.5.2所得酶解液,選擇大腸桿菌、金黃色葡萄球菌作為指示菌進(jìn)行抑菌圈實驗。

1.2.6 酶解產(chǎn)物的抑菌譜研究 選擇最優(yōu)酶酶解所得的酶解凍干產(chǎn)物(溫度:-40 ℃,真空度:1.37 Pa)分別對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌等6種菌種做抑菌圈實驗。采用瓊脂平板擴(kuò)散法測定[17]抑菌活性。選擇30 mg/mL卡那霉素及氨芐青霉素作為陽性對照,滅菌水為陰性對照。

1.2.7 最小抑菌濃度(MIC)的測定 參考Kobbi等[18]的實驗方法并略作修改:采用肉湯稀釋法(二倍稀釋法)[19]測定抑菌肽的MIC。將胃蛋白酶和胰蛋白酶復(fù)合酶酶解凍干產(chǎn)物溶于滅菌水,配制成不同濃度(100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.5625、0.7812、0.3906、0.1953 mg/mL)。在各試管中依次加入8.9 mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、0.1 mL菌懸液、1 mL不同濃度酶解液,最終酶解凍干產(chǎn)物濃度為10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.1562、0.0781、0.0391、0.0195 mg/mL,以營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基作為空白對照,陽性對照為菌濃度為106CFU/mL的菌液120 μL。相同條件下培養(yǎng)24 h,在630 nm波長處測定吸光度值,以O(shè)D630增量<0.05的最小濃度為MIC。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗重復(fù)3次,實驗結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,用Origin 8數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 辣木葉蛋白質(zhì)提取率的測定及氨基酸的組成分析

通過凱氏定氮法測得的辣木蛋白提取率為32.67%±0.45%,對比熊瑤[20]測定的辣木葉蛋白提取率36.75%相差不大,辣木葉蛋白質(zhì)氨基酸的組成及含量見表1。

表1顯示,辣木葉含有16種氨基酸,總量為64.50 g/100 g,其中,天冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸這3種氨基酸的含量較高,含量分別為6.99%、7.70%、6.26%,第一限制性氨基酸為半胱氨酸+甲硫氨酸,含量為2.38%。辣木葉蛋白質(zhì)7種必需氨基酸的總量為25.33%,占氨基酸總量的39.27%,酪氨酸、異亮氨酸等7種疏水性氨基酸的含量約為27.68%,占氨基酸總量的43.91%,2種親水性氨基酸含量約為10.55%,堿性氨基酸含量為10.06%。本研究結(jié)果與呂曉亞等[21]的研究結(jié)果相近。

表1 辣木葉蛋白氨基酸組成Table 1 Amino acid composition of Moringa oleifera leaves protein

辣木葉蛋白中必需氨基酸之間的比例適宜,含量均高于WHO/FAO標(biāo)準(zhǔn)模式及美國模式,與人體需求較為接近,營養(yǎng)價值高,必需氨基酸占氨基酸總量的比例(39.27%)高于WHO/FAO推薦值(35.0%)及美國模式(34.5%),是一種優(yōu)質(zhì)蛋白資源。

2.2 辣木葉蛋白抑菌圈實驗

辣木葉蛋白抑菌圈實驗結(jié)果如表2,顯示辣木葉蛋白對大腸桿菌無抗菌活性,對金黃色葡萄球菌具有抗菌活性,抑菌圈大小為(7.67±0.24) mm,屬低敏程度,這可能是因為大腸桿菌與金黃色葡萄球菌相比,具有外壁層,其主要由脂多糖及脂蛋白組成,脂多糖可以有效阻礙植物抑菌蛋白類大分子物質(zhì)進(jìn)入[22],從而有效保護(hù)大腸桿菌。金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁肽聚糖含量高,辣木葉存在的天然抗菌劑可抑制肽聚糖四肽側(cè)鏈與甘氨酸5聯(lián)橋之間的聯(lián)結(jié),而干擾肽聚糖的合成,從而抑菌金黃色葡萄球菌[23]。

表2 辣木葉蛋白抑菌圈實驗Table 2 Inhibition zone experiment of Moringa oleifera leaves protein

2.3 辣木葉蛋白質(zhì)酶解物的抑菌活性

2.3.1 單酶酶解結(jié)果 從表3的結(jié)果可知,6種酶的酶解產(chǎn)物對大腸桿菌均無抑菌性,對金黃色葡萄球菌則都顯示抗菌活性,根據(jù)抗菌肽抑菌機(jī)理,可能是與細(xì)菌細(xì)胞壁的差異有關(guān),金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁含較多帶有負(fù)電性的肽聚糖,并且為網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),酶解產(chǎn)生的陽離子型抗菌肽更易與其結(jié)合,使細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)變性并通過,然后通過靜電作用與細(xì)胞膜相互作用,改變膜構(gòu)象或形成離子通道,使內(nèi)容物泄露來致死靶細(xì)胞[24]。此外,與辣木葉蛋白抑菌實驗結(jié)果比較,6種酶的酶解產(chǎn)物對金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出的抑菌活性都較蛋白強(qiáng),且采用胰蛋白酶水解之后的酶解產(chǎn)物抗菌活性最強(qiáng),抑菌圈大小(10.67±0.94) mm,屬高敏程度,這可能與胰蛋白酶酶切位點有關(guān),胰蛋白酶以堿性氨基酸如賴氨酸、精氨酸等氨基酸所在位置作為酶切位點,一定程度上,滿足了抗菌肽對一級和二級的結(jié)構(gòu)要求[25]。

表3 單酶酶解抑菌圈實驗結(jié)果Table 3 Inhibition zone experiment results of of single enzymes enzymatic

2.2.2 復(fù)合酶酶解結(jié)果 由表4分析結(jié)果可知,復(fù)合酶酶解產(chǎn)物均只對金黃色葡萄球菌顯示抗菌活性,其中,胃蛋白酶和胰蛋白酶分步酶解得到的酶解產(chǎn)物抗菌活性最強(qiáng),抑菌圈大小為(10.83±0.62) mm,相較于單酶酶解的抑菌圈大小有提升,這可能與胰蛋白酶和胃蛋白酶的專一性酶切特性有關(guān),由于胃蛋白酶切割位點為疏水性氨基酸,因此,切割片段兩端多為疏水性氨基酸;而酶解產(chǎn)物中疏水性殘基片段越多,越易與細(xì)胞膜上的疏水區(qū)域結(jié)合[26],再通過某種特殊的抗菌方式實現(xiàn)其抗菌作用。

表4 復(fù)合酶酶解抑菌圈實驗結(jié)果Table 4 Inhibition zone experiment results of complex enzyme enzymatic

表6 MIC實驗結(jié)果Table 6 Results of MIC experiment

胰蛋白酶則可斷裂精氨酸形成的肽鍵,富含精氨酸的肽具有的陽離子性和氫鍵特性有利于與細(xì)菌細(xì)胞膜上的陰離子組分結(jié)合,進(jìn)而通過改變菌膜通透性或形成離子通道達(dá)到抑菌效果[27]。

2.4 酶解產(chǎn)物的抑菌譜研究

復(fù)合酶解所得酶解液的抑菌圈實驗結(jié)果如表5,可知,辣木葉蛋白經(jīng)胃蛋白酶結(jié)合胰蛋白酶復(fù)合酶酶解制備的酶解產(chǎn)物對金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌及化膿性鏈球菌這3株革蘭氏陽性菌均產(chǎn)生了抑菌作用,抑菌圈大小分別為(10.96±0.47)、(9.33±0.47)、(11.70±0.94) mm。且酶解產(chǎn)物對化膿性鏈球菌的抑菌效果與陽性對照氨芐青霉素相差較小,抑菌圈大小僅差2.44 mm。

表5 酶解產(chǎn)物的抑菌譜Table 5 Antibacterial spectrum of enzymatic hydrolysis products

2.5 最小抑菌濃度結(jié)果

針對復(fù)合酶解產(chǎn)物具有的抑制革蘭氏陽性菌作用,測定其最小抑菌濃度(MIC),值越小表明活性越強(qiáng),可見酶解產(chǎn)物對化膿性鏈球菌的MIC最小,為2.5 mg/mL,抑菌效果最明顯。對單增李斯特菌的MIC最大,為10 mg/mL,而金黃色葡萄球菌居中,為5 mg/mL。對比孫宜君[28]分離純化出螺旋藻抗菌肽純品對金黃色葡萄球菌最低抑制濃度為16 mg/mL。本實驗中粗酶解產(chǎn)物具有較好的抑菌活性,且化膿性鏈球菌與金黃色葡萄球菌為存在于人體表面的細(xì)菌,針對辣木葉對化膿性鏈球菌的抑菌效果可進(jìn)一步優(yōu)化并擴(kuò)大其應(yīng)用范圍。

3 結(jié)論

本研究以辣木葉為原料,提取辣木葉蛋白,提取率為32.67%±0.45%,氨基酸分析結(jié)果表明辣木葉蛋白氨基酸含量高,必須氨基酸種類齊全,且占氨基酸總量的比例高于大豆及花生,是一種優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)。蛋白粗提取對大腸桿菌無活性,對金黃色葡萄球菌顯示抗菌活性,抑菌圈實驗結(jié)果(7.67±0.24) mm。單酶酶解和復(fù)合酶酶解效果比較發(fā)現(xiàn)胃蛋白酶+胰蛋白酶酶解效果最優(yōu)。酶解產(chǎn)物抑菌譜研究發(fā)現(xiàn)復(fù)合酶酶解產(chǎn)物對革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌及化膿性鏈球菌顯示抑菌活性,且對化膿性鏈球菌顯示最強(qiáng)抑菌活性。以上結(jié)果表明,復(fù)合酶酶解制備的辣木葉蛋白酶解產(chǎn)物具有較好的抗菌活性,可開發(fā)成一種新型植物抗菌肽。但是酶解產(chǎn)物的抗菌機(jī)理,以及其中多肽的氨基酸序列等尚不明確,需要進(jìn)一步純化處理并探究其多肽組成和抗菌機(jī)制。為其實際應(yīng)用提供更加全面的理論研究基礎(chǔ)。