一株黃芪內生真菌甾醇類代謝產物的分離和鑒定

劉 瑞,張弘弛,安志鵬,李 慧

(大同大學生命科學學院,大同大學應用生物技術研究所,山西大同 037009)

甾醇類代謝產物廣泛分布于真菌細胞膜中,其化學骨架結構環由26～28個碳原子組成,相對于甾體類化合物,甾醇多了一個飽和或不飽和的仲醇。在自然界中既可以游離態形式存在,也可以結合態形式存在,不同真菌中甾醇的種類與含量不盡相同,主要區別在于C17所連的基團R3不同[1]。

目前生物活性研究發現,甾醇具有降低膽固醇、抗菌、抗腫瘤、調節兔疫系統、抗氧化作用等多種生物學功能。因其特有的生物學性質和物化特點,在醫藥、食品、化妝品、化工、紡織等行業中都被廣泛應用[2]。隨著生物技術的進步和天然產品市場的擴大,對甾醇及其衍生物的研究開發將持續擴大,利用真菌提取、分離以及生物合成甾醇及其衍生物的收到很大關注[3]。因而尋找含有豐富的甾醇類物質的新的真菌資源,并從新的真菌資源中提取甾醇及其衍生物有很大的基礎理論研究價值和商業價值。

課題組在對黃芪內生真菌代謝產物的系統研究中,發現了多株可產生甾醇類化合物的內生真菌[4-6],前期預實驗通過HPLC-MS分析,發現其中一株黃芪內生真菌AR-17-S03,其色譜特征峰密集地出現甾醇類化合物的特征峰,因而,我們對這株內生真菌進行了大量固體發酵,期望尋找到甾醇的新的內生真菌來源。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

內生真菌AR-17-S03[4-6]分離自黃芪根部，純化菌種保存于大同大學應用生物技術研究所;D101大孔吸附樹脂 天津市光復精細化工研究所;硅膠制備型預制板 青島海洋化工股份有限公司,Sephadex LH-20葡聚糖凝膠 美國GE Healthcare公司;乙腈試劑 色譜純,德國Sccbayer公司;石油醚、乙酸乙酯、甲醇、氯仿試劑 化學純,天津博迪試劑廠;改良大米固體培養基 發酵瓶中含大米基質100 g,NaCl 3 g,KNO31 g,谷氨酸鈉0.5 g,酵母浸粉10 g,水100 mL,pH7.0。

Waters 600分析高效液相色譜儀 美國Waters公司;Agilent 1200型半制備高效液相色譜 美國惠普公司,Welch material XB-C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);全自動熔點儀SMP40 英國Bibby-Stuart公司;Bruker maXis 4G UHR-TOF質譜儀 美國安捷倫公司;Bruker ADVANCE 400 MHz核磁共振儀 德國布魯克公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 內生真菌的分離和鑒定

1.2.1.1 內生真菌的分離純化 采用組織學法[7],具體步驟:取黃芪根,無菌水沖洗并晾干水分,用滅菌的剪刀將根部剪成0.5 cm×1 cm節段。表面消毒程序如下:75%乙醇消毒30 s,2%次氯酸鈉消毒10 s,75%乙醇潤洗20 s,無菌水沖洗2次,然后將組織材料縱切成4～5段,置于已制備的PDA培養基上,放置在28 ℃培養7 d后,觀察皿中材料切口處長出菌絲(菌落),采用頂端菌絲挑取法,挑取不同形態的菌落,連續接代幾次,即得內生真菌[5]，經過HPLC-MS分析，其中一株AR-17-S03可產生大量甾醇類化合物，因此對AR-17-S03進行后續實驗。

1.2.1.2 內生真菌的鑒定 將分離到的內生真菌,接種于PDA平板上,27 ℃暗箱培養,從第2 d開始記錄生長形態和外觀培養性狀菌落的大小、顏色、質地、有無氣生菌絲體、滲出物等)以及色素產生情況;采用玻片培養法,顯微觀察孢子梗的分枝狀況和孢子形態等情況。DNA提取方法和分子鑒定方法同文獻[8],內生真菌平板培養10～15 d后,刮取內生真菌菌落,抽干水分得干燥的菌絲塊,液氮中將菌絲塊研磨成粉末狀,選用CTAB法來提取內生真菌DNA。以提取到的基因組DNA為模板,經PCR擴增后,產物送交三聯兄弟生物醫藥研究(北京)有限公司測序。將測序獲得的ITS序列通過Blast比對,采用鄰接法(Neighbor-Joining)構建系統發育樹。

1.2.2 內生真菌的發酵及代謝產物提取和分離 黃芪內生真菌AR-17-S03斜面培養3 d,以改良查氏液體培養基做種子培養(接種量5%,培養溫度28 ℃,振蕩培養轉速130 r/min,周期7 d),得種子液。大量發酵以改良大米固體培養基發酵[9],10%接種量轉接至大米固體培養基,共計40瓶,培養溫度28 ℃,靜置黑暗培養45 d。發酵結束后,60 ℃直接將發酵培養物烘干,采用前期優化的超聲波細胞破碎工藝(超聲功率1500 W,超聲時間5 s,間隔時間5 s,全程時間5 min),95%乙醇結合微波輔助(微波功率250 W,輻射時間6 min,液固比5∶1)萃取3次,合并提取液濃縮后得粗提物197 g。

經前期分離條件優化,該菌株發酵粗提物的初級分離采用大孔吸附柱色譜,流動相選擇水-乙醇系統(體積比分別為100∶0、70∶30、50∶50、30∶70、10∶90),得到6個組分Fr.A-E,后續以L-B(醋酐-濃硫酸)[8]反應確定分離目標,確定Fr.B和C為下一級分離組分。Fr.B經硅膠柱色譜,流動相選擇乙酸乙酯-石油醚系統,得sFr.B(1-7),sFr.B2再經硅膠柱色譜洗脫(乙酸乙酯-石油醚系統),得化合物1(615 mg)和化合物2(235 mg),sFr.B2-2經半制備HPLC,以乙腈-水為流動相(1∶2;流速2.5 mL·min-1),得化合物3(121 mg),sFr.B3經Sephadex LH-20凝膠柱色譜,流動相為甲醇(流速1.5 mL/min),得化合物4(239 mg)和化合物5(166 mg),sFr.B4經pTLC色譜(展開系統氯仿∶甲醇∶水=20∶2∶1),刮板回收純化得化合物6(103 mg);Fr.C經經硅膠柱色譜洗脫(乙酸乙酯-石油醚系統),得sFr.C(1-6),sFr.C2經Sephadex LH-20凝膠柱色譜,甲醇洗脫(流速0.5 mL/min),得化合物7(93 mg),sFr.C3經多次硅膠柱色譜洗脫(乙酸乙酯-石油醚系統),HPLC檢測分析,得化合物8(75 mg),sFr.C3-2經半制備HPLC,以乙腈-水為流動相(1∶3;流速3 mL·min-1),得化合物9(19 mg)。

1.2.3 甾醇類代謝產物的結構鑒定 通過物理化學性質分析,結合核磁共振測試(NMR,400 MHz,TMS為內標)和質譜測試(ESI-MS,LC/MSD離子阱XCT質譜儀測定),鑒定分離得到的甾醇類化合物的結構。

1.3 數據處理

使用核磁共振及質譜測試數據庫分析甾醇類化合物結構。

2 結果與分析

2.1 內生真菌的鑒定

AR-17-S03宏觀菌落觀察:單一菌落,初期為白色,漸變為灰色至褐色(黑色);孢子團呈現顆粒狀,且聚團;培養基從淡黃色漸變至黑褐色。顯微形態觀察:菌絲體表面著生有色物,單生菌絲且有隔;直立型單生孢子梗,頂端呈球形;分生孢子無色且串生,呈球形(圖1)。經序列測定,ITS序列長549 bp,提交到NCBI進行序列Blast比對,Mega 6.0構建進化樹(圖2),該菌株與多株Aspergillussp.真菌具有同源性,聚類分析,AR-17-S03和Aspergillusniger以支持率100聚合在一起,綜合形態學特征觀察和進化樹聚類分析,將AR-17-S03鑒定為黑曲霉Aspergillusniger。已有研究發現海藻內生真菌棘孢木霉Richodermaasperellum[10],白木香內生真菌Fimetariellarabenhorstii[11],南海紅樹林的內生真菌E33和K38[12],南海馬尾藻內生真菌No.ZZF36[13],代謝產物都是以甾醇類為主。

圖1 菌株AR-17-S03菌落形態

圖2 菌株AR-17-S03系統發育分析

2.2 甾醇類代謝產物的結構鑒定

菌株AR-17-S03分離到的9個甾醇類化合物,被鑒定為麥角甾醇(化合物1),過氧化麥角甾醇(化合物2),膽固醇(化合物3),啤酒甾醇(化合物4),23-甲基麥角甾-7,22-二烯-3β,5α,9α-三醇(化合物5),5α,8α-表二氧麥角甾-6,9(11),22-三烯-3β-醇(化合物6),5α,8α-表二氧-23-甲基麥角甾-6,22-二烯-3β-醇(化合物7),麥角甾-4,6,8(14),22-四烯-3-酮(化合物8),3β,5α-二羥基麥角甾-7,22-二烯-6-酮(化合物9)(圖3)。代謝產物以麥角甾醇類為主,研究結果與文獻[10-13]類似,說明真菌有著相同的甾醇代謝合成途徑,而在具體甾醇類別,本研究與已有的研究有很大的差異性,說明內生真菌通過與不同寄主植物的長期共生,次級代謝途徑的關鍵酶體系出現差異性。

圖3 黃芪內生真菌AR-17-S03的代謝產物

化合物1,白色針狀結晶,mp.155～157 ℃。ESI-MS m/z 397.2[M+H]+。1H NMR(CDCl3)核磁譜圖中呈現了麥角甾醇類(含有3-β-羥基)的特征:3-OH的鄰位氫δ 3.66(1H,m,H-3),2個分子末端甲基氫δ 0.65(3H,s,H-18),0.97(3H,s,H-19),4個單裂分的甲基氫δ 1.06(3H,d,J=6.5 Hz,H-21),0.94(3H,d,J=7.0 Hz,H-26),0.84(3H,d,J=7.0 Hz,H-27),0.96(3H,d,J=7.0 Hz,H-28)和4個烯氫δ 5.20(1H,dd,J=15.1,6.9 Hz,H-22),5.21(1H,dd,J=15.1,7.4 Hz,H-23),5.40(1H,s,H-6),5.59(1H,s,H-7)。13C NMR及DEPT-135(CDCl3)核磁譜圖中呈現了28個碳,其中6個烯碳δ139.9(C-5),119.7(C-6),116.4(C-7),141.5(C-8),135.7(C-22),131.9(C-23);1個連氧碳δ 70.6(C-3),6個甲基碳δ12.0(C-18),17.7(C-19),21.2(C-21),19.8(C-26),19.7(C-27),17.4(C-28),其他碳 δ 38.5(C-1),31.9(C-2),41.0(C-4),46.2(C-9),37.1(C-10),21.0(C-11),39.2(C-12),42.9(C-13),54.7(C-14),23.1(C-15),28.4(C-16),55.8(C-17),40.5(C-20),42.8(C-24),33.2(C-25)。與文獻[14]核磁數據對比,化合物1鑒定為麥角甾醇。

化合物2,白色針狀結晶,mp.180～182 ℃。ESI-MS m/z 429.4[M+H]+和451.4[M+Na]+。1H NMR(CDCl3)核磁譜圖中也呈現了麥角甾醇類(含有3-β-羥基)信號:3-OH的鄰位氫δ 3.97(1H,m,H-3),2個分子末端甲基氫0.81(3H,s,H-18),0.88(3H,s,H-19),4個單裂分的甲基氫δ 1.00(3H,d,J=6.8 Hz,H-21),0.84(3H,d,J=6.8 Hz,H-26),0.82(3H,d,J=7.0 Hz,H-27),0.90(3H,d,J=7.0 Hz,H-28)和4個烯氫δ 5.22(1H,dd,J=15.2,7.6 Hz,H-22),5.11(1H,dd,J=15.1,8.0 Hz,H-23),6.23(1H,d,J=8.6 Hz,H-6),6.48(1H,d,J=8.6 Hz,H-7)。13C NMR及DEPT-135(CDCl3)核磁譜圖中呈現了28個碳,4個烯碳δ 135.0(C-1),130.7(C-1),135.4(C-22),132.1(C-23);2個連氧季碳δ 82.5(C-5),79.4(C-8);1個連氧次甲基碳δ 67.2(C-3),6個甲基碳δ 12.9(C-18),17.9(C-19),21.2(C-21),19.6(C-26),17.5(C-27),20.2(C-28),其他碳δ34.1(C-1),30.9(C-2),37.8(C-4),50.9(C-9),37.1(C-10),20.8(C-11),39.3(C-12),44.3(C-13),52.1(C-14),23.5(C-15),28.4(C-16),56.1(C-17),40.0(C-20),42.7(C-24),32.9(C-25)。與文獻[15]核磁數據對比,化合物 2 鑒定為過氧化麥角甾醇。

化合物3,白色針狀晶體,mp.147～149 ℃。ESI-MS m/z 387.2[M+H]+。1H NMR(CDCl3)核磁譜圖中呈現了5個甲基氫δ 0.71(3H,s),1.04(3H,d,J=6.4 Hz),0.87(3H,d,J=7.0 Hz),0.86(3H,d,J=7.0 Hz),0.95(3H,d,J=6.4 Hz),1個雙鍵的烯氫δ 5.38(1H,s),1個連氧碳上的氫δ 3.53(1H,m)。13C NMR及DEPT-135(CDCl3)核磁譜圖中呈現了27個碳原子,2個烯碳δ 140.8(C-5),121.6(C-6),1個連氧碳δ 77.9(C-3),5個甲基碳δ22.9(C-27),22.6(C-26),19.0(C-21),18.9(C-19),12.1(C-18),其他碳δ37.4(C-1),32.0(C-2),42.2(C-4),31.9(C-7),34.0(C-8),50.2(C-9),36.9(C-10),21.3(C-11),39.9(C-12),46.0(C-13),56.7(C-14),24.4(C-15),28.3(C-16),56.2(C-17),36.0(C-20),36.4(C-22),23.2(C-23),39.9(C-24),29.3(C-25)。與文獻[16]核磁數據對比,化合物3鑒定為膽固醇。

化合物4,白色針狀結晶,mp.245～247 ℃。ESI-MS m/z 431.4[M+H]+。1H NMR(CDCl3)核磁譜圖中也呈現了麥角甾醇類(含有3-β-羥基)信號:3位羥基鄰位氫δ 4.07(1H,m,H-3),6位羥基鄰位氫3.60(1H,d,J=4.8,H-6),2個分子末端甲基氫0.60(3H,s,H-18),1.09(3H,s,H-19),4個單裂分的甲基氫δ 1.04(3H,d,J=6.5 Hz,H-21),0.81(3H,d,J=7.0 Hz,H-26),0.83(3H,d,J=7.0 Hz,H-27),0.92(3H,d,J=7.0 Hz,H-28)),3個烯氫δ 5.34(1H,dd,J=4.8,2.4 Hz,H-7),5.20(1H,dd,J=15.0,8.0 Hz,H-22),5.25(1H,dd,J=15.0,7.5 Hz,H-23)。13C NMR及DEPT-135(CDCl3)核磁譜圖中呈現了28個碳原子,4個烯碳δ 115.0(C-7),143.9(C-8),132.2(C-22),135.8(C-23),3個連氧碳δ 67.4(C-3),76.3(C-5),72.8(C-6),6個甲基碳δ 12.4(C-18),18.3(C-19),19.7(C-21),19.8(C-26),21.2(C-27),17.5(C-28),其他碳δ 32.7(C-1),30.5(C-2),39.6(C-4),43.6(C-9),37.3(C-10),22.2(C-11),39.5(C-12),43.8(C-13),55.1(C-14),23.1(C-15),28.7(C-16),56.2(C-17),40.7(C-20),43.1(C-24),33.3(C-25)。與文獻[17]核磁數據對比,化合物4鑒定為啤酒甾醇。

化合物5,無色晶體,ESI-MS m/z 445.4[M+H]+。1H NMR(CDCl3):δ4.08(1H,m,H-3),3.61(1H,d,J=4.8 Hz,H-6),5.37(1H,dd,J=4.8,2.4 Hz,H-7),0.61(3H,s,H-18),1.09(3H,s,H-19),0.99(3H,d,J=6.6 Hz,H-21),4.91(1H,d,J=10.0 Hz,H-22),0.83(3H,d,J=7.0 Hz,H-26),0.80(3H,d,J=7.0 Hz,H-27),0.91(3H,d,J=7.0 Hz,H-28)1.49(3H,s,H-29)。13C NMR(CDCl3):32.7(C-1),30.8(C-2),67.8(C-3),39.3(C-4),76.2(C-5),72.5(C-6),115.0(C-7),143.7(C-8),43.8(C-9),37.3(C-10),22.2(C-11),39.5(C-12),43.8(C-13),54.9(C-14),22.7(C-15),28.0(C-16),56.0(C-17),12.4(C-18),18.3(C-19),39.8(C-20),21.6(C-21),131.5(C-22),135.2(C-23),43.6(C-24),33.7(C-25),19.7(C-26),19.4(C-27),17.2(C-28),13.3(C-29)。與文獻[18]核磁數據對比,化合物5鑒定為23-甲基麥角甾-7,22-二烯-3β,5α,9α-三醇。

化合物6,白色粉末,ESI-MS m/z 427.3[M+H]+。該化合物核磁數據如下:1H NMR(CDCl3):4.01(1H,m,H-3),6.28(1H,d,J=8.8 Hz,H-6),6.60(1H,d,J=8.2 Hz,H-7),5.43(1H,dd,J=6.0,2.0 Hz,H-11),0.75(3H,s,H-18),1.08(3H,s,H-19),1.00(1H,d,J=6.8 Hz,H-21),5.24(1H,dd,J=15.2,7.6 Hz,H-22),5.13(1H,dd,J=15.1,8.0 Hz,H-23),0.83(3H,d,J=6.8 Hz,H-26),0.82(3H,d,J=7.0 Hz,H-27),0.91(3H,d,J=7.0 Hz,H-28)。13C NMR(CDCl3):32.9(C-1),30.7(C-2),66.8(C-3),37.0(C-4),82.7(C-5),135.3(C-6),130.7(C-7),78.9(C-8),142.6(C-9),37.8(C-10),119.8(C-11),41.1(C-12),43.6(C-13),51.1(C-14),21.3(C-15),28.0(C-16),56.5(C-17),13.1(C-18),20.9(C-19),37.2(C-20),24.3(C-21),135.9(C-22),131.2(C-23),47.7(C-24),31.8(C-25),19.8(C-26),20.1(C-27),17.2(C-28)。與文獻[19]核磁數據對比,化合物6鑒定為5α,8α-表二氧麥角甾-6,9(11),22-三烯-3β-醇。

化合物7,白色無定形粉末,ESI-MS m/z 443.4[M+H]+和465.4[M+Na]+。該化合物核磁數據如下:1H NMR(CDCl3):3.97(1H,m,H-3),6.24(1H,d,J=8.6 Hz,H-6),6.50(1H,d,J=8.6 Hz,H-7),0.83(3H,s,H-18),0.89(3H,s,H-19),0.99(1H,d,J=6.8 Hz,H-21),4.86(1H,d,J=10.0 Hz,H-22),0.85(3H,d,J=6.8 Hz,H-26),0.81(3H,d,J=7.0 Hz,H-27),0.92(3H,d,J=7.0 Hz,H-28),1.48(3H,s,H-29)。13C NMR(CDCl3):33.9(C-1),30.8(C-2),66.9(C-3),37.8(C-4),82.5(C-5),135.2(C-6),130.7(C-7),79.5(C-8),50.9(C-9),37.3(C-10),20.7(C-11),39.3(C-12),44.3(C-13),52.0(C-14),23.5(C-15),28.3(C-16),55.8(C-17),12.9(C-18),17.6(C-19),40.2(C-20),21.3(C-21),135.4(C-22),132.3(C-23),42.8(C-24),32.9(C-25),19.5(C-26),17.4(C-27),19.9(C-28),12.9(C-29)。與文獻[20]核磁數據對比,化合物7鑒定為5α,8α-表二氧-23-甲基麥角甾-6,22-二烯-3β-醇。

化合物8,淡黃色針狀結晶,mp.118～120 ℃。ESI-MS m/z 391.1[M-H]-。比較其1H NMR、13C NMR與化合物1的核磁數據(位移、耦合常數)發現,H-3的峰消失,多了1個環內共軛酮羰基碳δ 198.9(C-3),判定化合物8是3位羥基氧化的甾酮。1H NMR(CDCl3)核磁譜圖中呈現了5個烯氫δ 5.69(1H,s,H-3),6.06(1H,d,J=10.4 Hz,H-3),6.68(1H,d,J=10.4 Hz,H-7),5.18(1H,dd,J=14.8,7.8 Hz,H-22),5.33(1H,dd,J=14.8,7.8 Hz,H-23),6個甲基氫δ 0.93(3H,s,H-18),1.04(3H,s,H-19),1.09(3H,s,H-21),0.80(3H,s,H-26),0.85(3H,s,H-27),0.92(3H,s,H-28)。13C NMR及DEPT-135(CDCl3)核磁譜圖中呈現了28個碳原子,8個烯碳122.5(C-4),124.6(C-5),124.6(C-6),133.3(C-7),124.0(C-8),155.5(C-14),135.3(C-22),132.3(C-23),6個甲基碳18.5(C-18),16.6(C-19),20.5(C-21),19.9(C-26),20.3(C-27),17.6(C-28),其他碳δ 34.1(C-1),33.9(C-2),43.7(C-9),35.9(C-10),19.0(C-11),35.7(C-12),44.3(C-13),24.8(C-15),27.8(C-16),55.2(C-17),39.4(C-20),42.7(C-24),32.6(C-25)。與文獻[21]核磁數據對比,化合物8鑒定為麥角甾-4,6,8(14),22-四烯-3-酮。

化合物9,白色粉末,ESI-MS m/z 429.4[M+H]+。該化合物核磁數據如下:1H NMR(DMSO-d6):3.72(1H,m,H-3),5.45(1H,s,H-7),0.55(3H,s,H-18),0.82(3H,s,H-19),0.89(3H,d,J=6.5 Hz,H-21),5.19(1H,dd,J=15.4,8.2 Hz,H-22),5.29(1H,dd,J=15.4,7.6 Hz,H-23),0.81(3H,d,J=7.0 Hz,H-26),0.94(3H,d,J=7.0 Hz,H-27),0.18(3H,d,J=7.0 Hz,H-28),4.39(1H,d,J=5.0 Hz,3-OH),5.15(1H,s,5-OH)。13C NMR(DMSO-d6):31.2(C-1),30.4(C-2),65.9(C-3),38.7(C-4),75.8(C-5),198.1(C-6),119.3(C-7),159.7(C-8),42.4(C-9),39.9(C-10),21.2(C-11),36.7(C-12),43.8(C-13),54.9(C-14),22.5(C-15),28.1(C-16),55.3(C-17),12.4(C-18),16.3(C-19),40.5(C-20),20.7(C-21),131.0(C-22),135.2(C-23),43.2(C-24),32.7(C-25),19.8(C-26),19.4(C-27),17.1(C-28)。與文獻[20]核磁數據對比,化合物9鑒定為3β,5α-二羥基麥角甾-7,22-二烯-6-酮。

3 結論

本研究基于這一出發點,發現了一株可以產生系列甾醇類代謝產物的黃芪內生真菌Aspergillusniger編號AR-17-S03,其產生的甾醇類代謝產物以麥角甾醇類為主,主要類別有麥角甾醇類、5α,8α-表二氧類麥角甾醇類、3-酮和6-酮類麥角甾醇類。這些甾醇類代謝產物的分離拓展了甾醇的新的來源,未來我們將進一步開展這些甾醇構效關系的研究,進一步提出功能性甾醇的結構修飾方案,為制備具有生理功能性甾醇衍生物提供資源準備。