饅頭老酵子中酵母菌的分離鑒定及發(fā)酵特性分析

黨 輝,劉 柳,胡新中,楊 可

(陜西師范大學(xué)食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院,陜西西安 710119)

老酵子是我國傳統(tǒng)的饅頭發(fā)酵劑,一般也被稱為“老面”、“酵子”、“面肥”等[1],它是一個多種菌的混合體系[2],含有多種能產(chǎn)氣和產(chǎn)香物質(zhì)的微生物,賦予饅頭松軟的口感和特殊的風(fēng)味[3],是重要的生物疏松劑和微生物發(fā)酵劑[4-5]。20世紀(jì)80年代中期即發(fā)活性干酵母進(jìn)入我國市場,由于其活性高、發(fā)酵力大、使用量少等優(yōu)點,被用于饅頭的工廠化生產(chǎn),但是老酵子由于賦予饅頭特殊的風(fēng)味和口感仍然被大多數(shù)地區(qū)消費者使用[6]。丁長河等[7]研究發(fā)現(xiàn)老酵子發(fā)酵的饅頭咀嚼性、凝聚性及硬度均好于工業(yè)化生產(chǎn)的饅頭樣品,并且其內(nèi)部結(jié)構(gòu),外觀形狀也顯著優(yōu)于工廠化生產(chǎn)的饅頭。因此,酵子將來在饅頭加工中具有工業(yè)酵母不可替代的應(yīng)用價值。

關(guān)于老酵子發(fā)酵面團(tuán)菌種的研究發(fā)現(xiàn),老酵子中的酵母菌種類豐富多樣。釀酒酵母是饅頭老酵子中主要的酵母菌[8],具有優(yōu)良的發(fā)酵性能。Liu等[9]從中國不同地區(qū)收集的15個老酵子中分離出105株酵母菌,經(jīng)RAPD分析后,鑒定出6種酵母,用這6種酵母單獨發(fā)酵制作饅頭,分析饅頭香氣特征與差異,研究表明,饅頭的香氣特征是由酵母菌決定的。因此,研究老酵子中天然優(yōu)勢酵母菌的發(fā)酵性能,可為酵子饅頭工業(yè)化提供理論依據(jù)。阿氏絲孢酵母是世界各地發(fā)酵酒糖化發(fā)酵劑中經(jīng)常出現(xiàn)的酵母菌之一,其菌株的β-葡萄糖苷酶活力最高,而這種酶在葡萄酒糖苷類風(fēng)味前體的水解中起著非常重要的作用。石威[10]在自然發(fā)酵豆渣中分離出阿氏絲孢酵母,李良鳳[11]在漿水樣品中也分離出阿氏絲孢酵母。

對酵子內(nèi)部酵母菌的分離、鑒定以及發(fā)酵特性的分析是進(jìn)行酵子工程化生產(chǎn)的必要前提[12]。本文通過對三種不同饅頭酵子中分離出的三株不同酵母進(jìn)行鑒定,并以AQ菌株為對照(從安琪酵母中分離)測定了四株菌的生長曲線以及研究其最適生長溫度、最適生長pH、面團(tuán)發(fā)酵力、液化力、糖化力和酯化力的差異,來探討不同酵母菌的生長發(fā)酵特性,以期從此角度為工業(yè)篩選有效的天然酵母菌提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

酵子 陜西省長安縣農(nóng)戶家;酵母基因組DNA提取試劑盒、Taq DNA聚合酶、dNTP、DL2000 marker 大連寶生物公司;10×buffer(Mg2+)、PCR引物ITS4、ITS5 北京奧科生物技術(shù)公司;0.1%標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液、20 g/L可溶性淀粉、1號液體培養(yǎng)液(氯霉素0.1 g,酵母浸粉10.0 g,蛋白胨20.0 g,加蒸餾水900 mL)、安琪酵母 西安晶博生物科技有限公司。

U-3010型紫外可見分光光度計 日本HITICHI公司;A301681型酸度計 上海默西科學(xué)儀器有限公司;AB204-N型分析天平 梅特勒-托利多國際貿(mào)易(上海)有限公司;MJ-250型恒溫培養(yǎng)箱 上海和羽良電子科技有限公司;SW-CJ-1F型超凈工作臺 蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;LDZX-30KBS型立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 酵母菌分離純化方法 酵母菌的分離純化采用稀釋平板分離法[9],陜西當(dāng)?shù)馗山妥臃壑糜跓o菌水中震蕩20 min,取上清液進(jìn)行梯度稀釋后均勻涂布于YPD培養(yǎng)基上,并于28 ℃培養(yǎng)48 h。根據(jù)菌落特征及鏡檢確認(rèn)為酵母菌后,挑取單菌落平板劃線進(jìn)行純化,將分離出的三株酵母菌分別接種于1號液體培養(yǎng)液中于28 ℃過夜培養(yǎng)。

1.2.2 DNA提取、PCR擴(kuò)增及分子測序 酵母菌DNA的提取使用Yeast Gen DNA Kit酵母基因組DNA提取試劑盒,提取的DNA放置-20 ℃保存?zhèn)溆谩CR 的反應(yīng)體系為:上、下游引物各2 μL,10×buffer(Mg2+)5.0 μL,dNTPs(each 25 mmol/L)1.0 μL,Taq DNA聚合酶(5 U/μL)1.0 μL,DNA模板1 μL,用無菌去離子水補(bǔ)齊至50 μL。其中,酵母菌的擴(kuò)增引物ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)和ITS5(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)[13]。PCR反應(yīng)程序:94 ℃預(yù)變性2 min;94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,30個循環(huán);72 ℃終延伸7 min。PCR產(chǎn)物送往上海生工生物工程股份有限公司純化測序,根據(jù)供試菌株的序列,在GenBank數(shù)據(jù)庫中分別進(jìn)行同源序列搜索同時制作系統(tǒng)發(fā)育樹鑒定。

1.2.3 酵母菌生長曲線的測定 在1號液體培養(yǎng)基中分別接入OD600值約為1.0的三株酵母菌菌液,置于28 ℃的恒溫培養(yǎng)震蕩器中以轉(zhuǎn)速180 r/min進(jìn)行培養(yǎng),以未接種酵母菌的液體培養(yǎng)基為空白對照,每隔2 h測定OD600值[14]。

1.2.4 最適生長溫度和pH的測定 在1號液體培養(yǎng)基中分別接入OD600=1.0的三株酵母菌液(自然pH下),置于24、26、28、32、36、40 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中以轉(zhuǎn)速180 r/min進(jìn)行培養(yǎng),24 h后分別測定OD600值。

在1號液體培養(yǎng)基中分別接入三株酵母菌液,分別調(diào)pH為3.1、3.6、4.1、4.6、5.1、5.6、6.1,然后在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中以180 r/min進(jìn)行培養(yǎng),24 h后分別測定OD600值[15]。

1.2.5 酵母菌發(fā)酵面團(tuán)能力測定 將4.0 g的面粉,0.2 mL的酵母菌液,7 mL無菌水加入到20 mL的無菌有刻度試管中,用玻璃棒迅速混勻成面團(tuán)狀,在30 ℃環(huán)境中靜置培養(yǎng),從18 h開始記錄面團(tuán)體積[16]。

1.2.6 液化力、糖化力、酯化力測定 根據(jù)《QB/T 4257-2011釀酒大曲通用分析方法》[17]對酵母菌糖化力、液化力進(jìn)行測定。液化力是35 ℃下100 mL酵母菌液1 h液化淀粉的克數(shù),液化力計算公式如下。

式中:Y表示液化力;2%表示可溶性淀粉溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù);20表示可溶性淀粉溶液使用體積;3表示酵母菌液的稀釋倍數(shù);15表示酶液使用量;3600表示時間;t(s)表示反應(yīng)時間;1000表示換算成mg。

糖化力是5.0 mL酵母菌液1 h轉(zhuǎn)化可溶性淀粉生成葡萄糖的毫克數(shù),糖化力計算公式如下。

式中:X為試樣的糖化力,u/mL;V1為滴定空白時,消耗葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積,mL;V2為滴定試樣時,消耗葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積,mL;2.5為每毫升葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液中含有葡萄糖的質(zhì)量,mg;30為糖化混合液(可溶性淀粉溶液加酵母菌液)的總體積,mL;0.25為5 mL酵母菌液相當(dāng)酵母的質(zhì)量,g;5為滴定時吸取的糖化液體積,mL。

酯化力是15 mL酵母菌液經(jīng)過48 h催化乙酸和無水乙醇合成乙酸乙酯的毫克數(shù)。用酸降表示其酯化力[18]。

式中:V0表示反應(yīng)前消耗氫氧化鈉的體積(mL);V1表示反應(yīng)48h后消耗氫氧化鈉的體積(mL)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用DPS 9.50軟件進(jìn)行差異顯著性分析,利用Excel 2016軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和繪圖,每個處理組進(jìn)行三次平行實驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌分離鑒定結(jié)果及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

酵母菌兩側(cè)的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS區(qū))具有明顯的種間差異性,因此可以作為區(qū)分鑒定酵母菌的依據(jù)[19],是目前酵母菌分類鑒定常用的分子生物學(xué)方法。對Y-1、Y-2和Y-3的ITS基因片段進(jìn)行擴(kuò)增,將測得的ITS區(qū)序列通過GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)進(jìn)行同源性分析比較得出,菌株Y-1、Y-2和Saccharomycescerevisiae的相似度分別為99%和100%;Y-3與Trichosporonasahii的相似度為100%。

表1 酵子分離菌株ITS區(qū)序列相似性分析

Table 1 Analysis of ITS gene sequences of yeast isolates from Jiaozi

菌株編號酵母菌鑒定結(jié)果GenBank登錄號相似度(%)Y-1Saccharomyces cerevisiaeAM26283199Y-2Saccharomyces cerevisiaeJN837100100Y-3Trichosporon asahiiJX174411100

由圖1可知,菌株Y-1與Saccharomyces屬的親緣關(guān)系最近,與SaccharomycescerevisiaeAM262831的同源性為99%,菌株Y-2也與Saccharomyces屬的親緣關(guān)系最近,與SaccharomycescerevisiaeJN837100的同源性為100%,菌株Y-3與Trichosporon的親緣關(guān)系最近,與TrichosporonasahiiJX174411的同源性為100%。因此,將Y-1與Y-2鑒定為釀酒酵母,Y-3鑒定為阿氏絲孢酵母。

圖1 菌株 Y-1、Y-2以及Y-3的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹

2.2 酵母菌的生長曲線

如圖2所示,三株酵母菌的生長均包括遲緩期、對數(shù)期和穩(wěn)定期,與文獻(xiàn)[20]一致。Y-1、Y-2和AQ三株酵母菌菌株的生長趨勢大致相同,延遲期都比較短,對數(shù)期較長,此時酵母細(xì)胞生長速率最大,酶系活躍,代謝旺盛,且酵母細(xì)胞抗不良環(huán)境的能力最強(qiáng);20 h后Y-2進(jìn)入穩(wěn)定期,此時酵母菌數(shù)量達(dá)到最高水平,24 h后Y-1進(jìn)入穩(wěn)定期,26 h后AQ進(jìn)入穩(wěn)定期,但Y-2的OD值比Y-1和AQ大,說明Y-2具有較強(qiáng)的發(fā)酵活性;Y-3酵母菌株的生長曲線與Y-1、Y-2和AQ相比差異較大,Y-3的延遲期比較長,這說明酵母細(xì)胞適應(yīng)新環(huán)境而合成必需的酶、輔酶或中間代謝產(chǎn)物的時間比較長;對數(shù)期比較短,在24 h后進(jìn)入穩(wěn)定期且OD值明顯低于其他三株菌,說明其繁殖能力較弱。經(jīng)比較可以看出,Y-1和Y-2符合釀酒酵母延長期短,最終活菌量大的特點,這對于提高生產(chǎn)效率具有十分重要的作用。

圖2 酵母菌生長曲線

2.3 最適生長溫度和pH的測定

溫度是影響酵母生長的重要因素,由圖3A可觀察到Y(jié)-2的OD600值在不同的溫度條件下是最高的,其次是Y-1和AQ,最后是Y-3,這與生長曲線研究結(jié)果一致;四株酵母菌在不同溫度條件的生物量變化趨勢大致相同,都呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。Y-1的最適生長溫度是28 ℃,因為此溫度下酵母菌的生物量最大且與其他溫度下的OD600值相比差異顯著(p<0.05);在28～32 ℃時,Y-2的生物量無明顯差異(p>0.05),與其他溫度相比,生物量大且差異顯著(p<0.05);Y-3在36 ℃時的生物量最大且與其他溫度下的OD600值相比差異顯著(p<0.05),當(dāng)溫度上升到40 ℃時,生物量下降明顯,說明Y-3的耐高溫能力較差。隨著溫度升高,酵母菌生長代謝量減少,這是由于溫度過高發(fā)生菌體自溶現(xiàn)象導(dǎo)致菌體減少[21]。

培養(yǎng)基的pH會影響酵母原生質(zhì)膜對離子的滲透作用,進(jìn)而影響菌體酶生成、酶活、營養(yǎng)物質(zhì)的吸收、代謝途徑等方面[22]。由圖3B可知,培養(yǎng)基pH較低時,酵母菌生長能力弱。當(dāng)pH在5.1～5.6范圍內(nèi),Y-1生長良好,當(dāng)pH減小或者增大時都會受到明顯抑制(p<0.05);Y-2在pH=5.1時生長情況最佳(p<0.05),當(dāng)pH為3.1～4.1和5.6～6.1時無顯著性變化,但pH為5.6～6.1時的生物量大于pH為3.1～4.1的生物量且差異顯著(p<0.05),說明Y-2的耐酸能力弱;Y-3在pH=4.1時生長情況最佳(p<0.05)。此外,王玉霞[23]研究發(fā)現(xiàn),阿氏絲孢酵母在pH=4時,β-葡萄糖苷酶的含量最高,說明此酸度條件下的的阿氏絲孢酵母代謝活性比較高,與本文研究結(jié)果基本一致。此外三株酵母在相同pH條件下生長情況均為:Y-2>Y-1>Y-3,這表明Y-2酵母菌數(shù)量最大,其次是Y-1,最后是Y-3,說明Y-2菌株生長代謝率最高,與上述生長曲線以及溫度對酵母生長影響的研究結(jié)果一致。

圖3 溫度和pH對酵母菌生長的影響

2.4 酵母菌發(fā)酵面團(tuán)能力測定

酵母產(chǎn)氣能力能保證面筋蛋白的充分延伸和面團(tuán)充分膨脹,是影響面團(tuán)發(fā)酵的重要因素。面團(tuán)發(fā)酵是由酵母菌的生命活動維持的,所以酵母菌自身活性是影響產(chǎn)氣量的重要因素之一。面團(tuán)在酵母菌的作用下發(fā)酵會發(fā)生一系列的化學(xué)反應(yīng),α-淀粉酶能將淀粉分解為麥芽糖和糊精,從而繼續(xù)反應(yīng)生成葡萄糖,在微生物作用下,葡萄糖生成丙酮酸,丙酮酸在酵母菌的作用下繼續(xù)反應(yīng)生成乙醛,然后乙醛被還原成乙醇,在一系列的反應(yīng)中,產(chǎn)生的CO2增加了饅頭的體積。構(gòu)成面團(tuán)的面筋經(jīng)發(fā)酵后得到充分?jǐn)U展,使氣體能保留在發(fā)酵面團(tuán)內(nèi)部使面團(tuán)膨脹,從而賦予饅頭松軟的口感。

面團(tuán)膨發(fā)體積反映出面團(tuán)的持氣能力,如圖4可知,三株酵母在發(fā)酵初期進(jìn)行旺盛的有氧呼吸,發(fā)酵速度較快,面團(tuán)體積速度增大,發(fā)酵一段時間后,Y-1與Y-3發(fā)酵的面團(tuán)體積平穩(wěn),Y-2在2.5 h后出現(xiàn)塌陷現(xiàn)象,這是由于Y-2發(fā)酵面團(tuán)前期產(chǎn)氣速度過快,使得酵母產(chǎn)氣量較早達(dá)到高峰,而此時面團(tuán)的持氣能力還未達(dá)到最高峰,使得面團(tuán)內(nèi)部形成高壓,當(dāng)超過面筋的彈性極限時面筋網(wǎng)絡(luò)斷裂,CO2溢出,導(dǎo)致面團(tuán)體積減小。不同酵母菌對面團(tuán)的膨發(fā)能力是有差異的,這是由酵母菌自身性質(zhì)決定的。在0～2 h之間,Y-1與Y-3進(jìn)行緩慢發(fā)酵,面團(tuán)體積逐漸增大到最大值,2 h后處于平穩(wěn)狀態(tài)(p>0.05);Y-2在發(fā)酵初期產(chǎn)氣速度快,產(chǎn)氣量大,1 h后進(jìn)入平穩(wěn)期(p>0.05),但2 h后溢出的CO2量較多,持氣量較其他兩株酵母菌稍差;Y-1和Y-3酵母產(chǎn)氣能力較弱,但持氣能力比較強(qiáng);2和2.5 h時Y-2發(fā)酵面團(tuán)的體積最大且。綜合比較Y-2的面團(tuán)發(fā)酵能力最好,其次是Y-3,最后是Y-1。

圖4 酵母菌發(fā)酵面團(tuán)能力測定結(jié)果

2.5 酵母菌液化力、糖化力、酯化力測定

酵母菌的糖化力、液化力、酯化力是評價酵母菌質(zhì)量的重要指標(biāo)[24],這些能力指的是酵子中具有液化作用、糖化作用、酯化作用的酶及微生物能將淀粉轉(zhuǎn)化為糖分的程度[25-26]。液化力反映了酵母菌將淀粉水解為糊精的能力,這也是淀粉水解最后生成葡萄糖被人體吸收利用的重要步驟。由圖5A可以看Y-2液化能力最強(qiáng),與其他兩株酵母菌相比差異顯著(p<0.05),Y-1與Y-3差異不明顯(p>0.05)。糖化力是酵母代謝產(chǎn)生的糖化酶催化淀粉轉(zhuǎn)化成糖,因此糖化酶是糖化力的主要影響因素,由圖5B可以看出Y-2的糖化能力最強(qiáng),與其他兩株酵母菌相比差異顯著(p<0.05),Y-1的糖化能力稍強(qiáng)于Y-3,但差異不明顯(p>0.05)。酯化力是酵母菌催化合成酯類的能力,對發(fā)酵面團(tuán)形成獨特的風(fēng)味有重要的貢獻(xiàn),由圖5C可知,Y-2的酯化力最強(qiáng),與其他兩株酵母菌相比差異顯著(p<0.05),Y-1的酯化能力稍強(qiáng)于Y-3,但差異不明顯(p>0.05),這與糖化力結(jié)果是一致的。液化力、糖化力與酯化力的結(jié)果與酵母菌生長曲線有一定的相關(guān)性,酵母菌繁殖能力越強(qiáng),產(chǎn)生的酶越多。Y-1與Y-2都是釀酒酵母,它們的繁殖能力比Y-3強(qiáng),所以在液化力、糖化力以及酯化力方面Y-1與Y-2較Y-3有優(yōu)勢。

圖5 三株酵母菌的液化力、糖化力、酯化力測定結(jié)果

3 結(jié)論

通過對從老酵子中分離出的三株酵母菌進(jìn)行測序以及一些發(fā)酵性能的測定,得到以下結(jié)論:三株酵母菌中兩株(Y-1和Y-2)為釀酒酵母,另一株(Y-3)為阿氏絲孢酵母,阿氏絲孢酵母是首次在老酵子中被分離出來。Y-1與Y-2這兩株釀酒酵母的生長能力比Y-3阿氏絲孢酵母能力強(qiáng);Y-1的最適生長溫度是28 ℃,Y-2的最適生長溫度是28～32 ℃,Y-3的最適生長溫度是36 ℃;Y-1最適生長pH為5.1～5.6,Y-2最適生長pH為5.1,Y-3最適生長pH為4.1;面團(tuán)發(fā)酵能力和液化力、糖化力、酯化力都是Y-2>Y-1>Y-3。研究結(jié)果可以反映在饅頭酵子發(fā)酵過程中酵母菌的多樣性,為進(jìn)一步研究具有我國西北部地區(qū)特色發(fā)酵面食風(fēng)味特征、篩選優(yōu)良天然酵母提供參考。