鮑魚內臟蛋白的提取及水解肽的抗氧化活性研究

梁 杰,趙曉旭,汪秀妹,楊志強,汪少蕓

(1.莆田學院環境與生物工程學院,福建省新型污染物生態毒理效應與控制重點實驗室,福建莆田 351100;2.福州大學生物科學與工程學院,福建福州 350108)

生物活性肽具有抗菌[1]、抗氧化[2-3]、抗心血管疾病[4]、抗癌[5]、神經保護活性[6]、抗炎癥[7]、抑制肥胖[8]等多種生理功能[9-12]。海洋生物因為生活環境與陸地環境的巨大差異(低溫、高壓、高鹽度、避光、低氧)而具有結構奇特、功能特殊的生物學特性。鮑魚(Abalone)是一種營養價值和藥用價值較為全面的優質動物蛋白,由于其高蛋白、低脂肪、低膽固醇的特點,加上滋味鮮美的口感,素有“海味之冠”的美譽[13]。我國海域遼闊,鮑魚資源豐富,近十年養殖增長率高達54.68%,2016年養殖產量已達13.97萬噸,其中福建省鮑魚產量約占全國鮑魚產量80%[14-15]。除鮮活鮑魚外,罐頭鮑魚、干鮑魚是鮑魚目前的主要銷售方式,鮑魚加工企業在生產過程中產生大量的內臟下腳料,造成環境污染。內臟主要包括性腺、消化腺、胃等器官,內臟約占鮑魚體重的20%～30%,其中含有豐富的蛋白質、氨基酸、脂質、維生素、多糖和礦物質等,具有較高的研發價值[15]。目前鮑魚內臟的主要加工方法是簡單加工成飼料、魚粉,沒有對其營養價值進行充分開發利用。相關研究證實,鮑魚內臟蛋白具有一定的抗氧化能力,說明其中含有抗氧化能力的氨基酸序列和活性物質[16]。

本文以鮑魚加工下腳料鮑魚臟器為原料,以蛋白提取率為指標,通過響應面法優化提取內臟蛋白,以水解度和抗氧化能力為指標對蛋白進行酶解,篩選最適工具酶,進一步對水解肽進行抗氧化性質測定及應用研究,為開發海洋生物源抗氧化肽提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮑魚臟器 福建莆田匯豐食品加工有限公司提供;酸性蛋白酶(2.4×104U/mL)、中性蛋白酶(1.3×105U/mL)、堿性蛋白酶(1.9×105U/mL)、木瓜蛋白酶(1.1×105U/mL)、復合蛋白酶(2.1×105U/mL) 諾維信(中國)生物技術有限公司;2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚 分析純,美國Sigma;牛血清蛋白、考馬斯亮藍G-250、鹽酸、氫氧化鈉、三氯乙酸、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼、甲醇 分析純,國藥集團化學試劑有限公司。

FD-1B-55型冷凍干燥機 北京博醫康實驗儀器公司;UV2550紫外/可見分光光度計 日本島津;DHG-9030A電熱恒溫鼓風干燥箱 上海精宏;MDF-U333型超低溫冰箱 日本三洋;PB-10型精密數顯酸度計 賽多利斯;3-18K冷凍離心機 德國SIGMA;BS-100A自動部份收集器 上海滬西分析儀器廠有限公司;FS-450臺式數控超聲波處理儀 上海生析超聲。

1.2 實驗方法

1.2.1 鮑魚臟器蛋白提取工藝

1.2.1.1 提取工藝 將鮑魚內臟置于-18 ℃低溫冰箱冷藏,取適量置于組織搗碎機充分勻漿,冷凍干燥后密封備用,稱取一定質量內臟于一定濃度NaOH中充分攪拌后,置于超聲波處理器中(150 W)浸提,充分反應后,以10000 r/min將抽提液離心30 min取上清;不斷攪拌并向體系中加入1 mol/L鹽酸溶液,對體系pH實時抽測,調節pH,放置于層析冷柜中(4 ℃)靜置30 min后,蛋白質充分凝集形成沉淀,10000 r/min離心10 min,棄上清液,反復使用去離子水水洗沉淀至pH為7.0,將沉淀蛋白質冷凍干燥至恒重,得到蛋白質凍干粉,-20 ℃冷藏備用。

1.2.1.2 提取蛋白單因素實驗 以蛋白提取率為評價指標,固定初始條件設置為:堿濃度1.0%,超聲波時間15 min,提取時間30 min,料液比1∶10 g/mL,提取溫度40 ℃,分別考察堿濃度(0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%)、超聲波時間(5、10、15、20、25 min)、提取時間(超聲后10、20、30、40、50、60 min)、料液比(1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14、1∶16、1∶18、1∶20、1∶22 (g/mL))、提取溫度(50、60、70、80、90 ℃)等條件對鮑魚臟器蛋白提取效果的影響,每個因素的最佳水平帶入下個因素進行實驗,確定各因素的適宜范圍。

1.2.1.3 響應面試驗的設計 通過分析單因素實驗,選取對提取率影響較為顯著的因素:堿濃度,超聲波時間,提取時間,提取溫度,通過Design-Expert 8.0軟件Box-Behnken方法,以蛋白質提取率為響應值設計響應面優化實驗。因素水平及編碼表1所示:

表1 試驗設計因素及編碼水平Table 1 Factors and levels of experimental design

1.2.1.4 粗蛋白沉淀的pH范圍確定 參考文獻[17]的方法,以蛋白沉淀率為指標,取蛋白提取上清液,用HCl調節pH至2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5,層析冷柜4 ℃下靜置30 min后,蛋白質充分凝集形成沉淀,10000 r/min離心10 min,棄上清液,水洗沉淀至pH為7.0,冷凍干燥至恒重。

式(1)

1.2.1.5 鮑魚臟器蛋白提取率的測定 鮑魚臟器總蛋白含量的測定采用凱氏定氮法,堿提取液中蛋白含量測定采用Bradford法測定。得到蛋白質含量標準曲線回歸方程:蛋白質含量(μg/mL)=(A595-0.0051)/0.0056,R2=0.9984,提取率計算公式如下:

蛋白質提取率(%)=提取液中蛋白質含量×100/鮑魚臟器總蛋白含量

式(2)

1.2.2 水解肽制備工藝優化

1.2.2.1 最適蛋白酶的篩選 選取五種蛋白酶,對蛋白進行酶解,以DPPH自由基和OH·自由基清除率和水解度(DH)為指標評價酶解效果,篩選最適蛋白酶;各酶的最適條件見表2。反應條件設置為:蛋白凍干粉用去離子水配制為濃度為2%(w/v),酶活力800 U/g,酶解pH、溫度分別在各酶的最適條件下,恒溫水浴震蕩反應一定時間,水解至終點沸水浴滅酶10 min,冷卻后以10000 r/min離心10 min,收集上清液,進行水解度和DPPH自由基和OH·自由基清除活力的分析測定。

表2 蛋白酶最適pH和溫度Table 2 Suitable hydrolysis pH value and temperature for proteases

1.2.2.2 DPPH自由基清除率的測定 參照文獻[18]的方法測定DPPH自由基清除率。用95%乙醇配制0.1 mmol/L的DPPH溶液,避光冷藏,將待測樣品稀釋10倍;將2 mL測試樣品溶液與2 mL DPPH溶液加入到同一試管中,搖勻后進行避光反應,靜置30 min后,測定波長517 nm處吸光值Ai;同時測定2 mL DPPH溶液與2 mL溶劑(去離子水)混合后的吸光度A0,以及2 mL測試樣品溶液與2 mL 95%乙醇混合后的吸光度Aj。計算公式如下:

式(3)

1.2.2.3 水解度的測定 采用甲醛滴定法參照文獻[19-20]測蛋白質水解度。量取蛋白酶解液5 mL并加入60 mL蒸餾水充分混合均勻,采用0.2 mol/L標準NaOH溶液調節酶解至pH8.2,再加入pH8.2的甲醛溶液20 mL,最后用0.1 mol/L標準NaOH溶液標定,記錄pH至9.2時所消耗的標準NaOH溶液的體積。計算公式:

式(4)

式中:ΔV:滴定樣品與蛋白原液所消耗的標準NaOH溶液體積差;C:NaOH標準溶液濃度,mol/L;W:原料克數,g;Vtot:酶解液的總體積,mL;V:滴定所用的酶解液體積,mL;n0:水解前每克蛋白游離的氨基毫摩爾數,mmol/g;n:水解后每克蛋白游離的氨基毫摩爾數,mmol/g;htot:原料蛋白質中所含肽鍵總數,mmol/g;Pro%:樣品的蛋白質含量;110:氨基酸平均分子量。

1.2.2.4 OH·自由基清除率的測定 參照文獻[21]的方法測定OH·自由基清除率。依次準確移取5 mL 2 mmol/L FeSO4溶液和5 mL 6 mmol/L過氧化氫溶液,混合均勻后用6 mmol/L水楊酸溶液定容于25 mL容量瓶刻度處,搖勻后快速在510 nm處測定A0值。在反應體系中加入1 mL酶解液,搖勻后立即測定As值。計算公式如下:

式(5)

1.2.2.5 還原力的測定 采用鐵氰化鉀法參照文獻[22]測定還原力。在不同濃度樣品各1 mL(空白對照用1 mL去離子水代替),依次加入2.5 mL 1%的鐵氰化鉀溶液和2.5 mL 0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH6.6),搖勻后放入已設置好50 ℃恒溫水鍋內,充分反應20 min,然后加入2.5 mL 10%的三氯乙酸(TCA)溶液,混勻后以3000 r/min的速率離心分離10 min,取2.5 mL上清液于另一試管中,加入2.5 mL去離子水和2.5 mL 0.1%的FeCl3,混勻后靜置,充分反應10 min后產生藍色沉淀,用紫外分光光度計測定700 nm波長處吸光值,吸光值與樣品的還原能力有關,藍色沉淀越多則溶液的吸光值越大,該樣品的還原能力越強。

1.2.3 水解肽的分離純化及應用研究

1.2.3.1 水解肽的分離純化 將酶解液凍干粉用去離子水復溶后上樣到處理妥當的Sephadex G-50(Φ2.5×200 cm)凝膠過濾層析柱上,自動部份收集器設置流速:0.3 mL/min,10 min/管;檢測波長:214 nm,收集洗脫液繪制洗脫曲線。收集各組分后濃縮凍干,用磷酸鹽緩沖液(pH7.4)配制成濃度為2.0 mg/mL,參照1.2.2方法,依次考察各組分羥基自由基清除能力、DPPH自由基清除能力及還原力,并與未分離的酶解液凍干粉原液對比。

1.2.3.2 水解肽的抗氧化應用研究 選擇市售新鮮豬肉和豬肥膘肉味原料(質量比4∶1)500 g,并用絞肉機絞碎至5 mm大小,加入12 g食鹽并充分斬拌均勻,此為基礎配方。添加抗氧化劑后繼續攪拌均勻,置于4 ℃冰箱中冷藏備用。

預處理:①在處理過的豬肉中添加抗氧化肽,添加量分別為:0.1%、0.5%、1.0%,混合均勻后置于4 ℃冷藏,測定樣品在2、4、6、8、10、12、14 d時的POV和TBA值,研究抗氧化肽在不同添加量情況下對豬肉制品脂肪氧化的影響;②在預處理過的豬肉樣品中依次添加抗氧化劑0.02% VC(VC用少量去離子水溶解)、0.02% BHT及不添加任何抗氧化劑的樣品對照組,混合均勻后置于4 ℃冷藏,測定樣品在3、6、9、12、15 d時的POV和TBA值,將抗氧化肽與其他抗氧化劑的抗氧化能力作比較[23]。

過氧化值(POV)的測定:參照閆文杰等[24]的方法,取10 g冷藏肉塊放入三角瓶中,并準確量取300 mL CM液(氯仿∶甲醇=2∶1,v/v)加入三角瓶,充分震蕩后抽提1.5 h并進行過濾,往濾液中入2/5體積1% NaCl溶液,靜置分層后,下層為脂肪提取液,將提取液置于用旋轉蒸發器設置40 ℃水浴蒸發濃縮,得到脂肪。油脂過氧化物值(POV)按照國家規定的GB/T 5009.37-2003方法進行測定。計算公式如下:

式(6)

式中:X:樣品所含過氧化值的量,meq/kg;C:樣品中鐵的含量,μg;C0:對照組鐵的含量,μg;m:樣品質量，μg;V1:樣品被稀釋后的體積,mL;V2:測定時量取的樣品體積,mL;55.84:鐵元素的原子量;2:換算因子。

硫代巴比妥酸值(TBA)的測定:參照文獻[25]中的方法,取10 g冷藏的試樣置于潔凈干燥的燒杯中,加入40 mL 10%三氯乙酸,14000 r/min均質10 min,2000 r/min離心5 min后過濾,將濾液轉移至50 mL容量瓶中,補充10%三氯乙酸并定容至50 mL,靜置使其充分反應10 min;準確移取5 mL濾液和5 mL 0.02 mol/L TBA溶液,充分混勻;調節水浴鍋溫度95 ℃,置于該溫度下密封保溫50 min,冷卻至室溫測定523 nm處吸光值。

1.3 數據處理

采用Origin 8.5軟件作圖,通過Design-Expert 8.0進行響應面設計及優化分析。

2 結果與分析

2.1 鮑魚臟器蛋白提取工藝研究

2.1.1 單因素實驗結果 如圖1A可知,隨著堿液濃度提高,提取率先迅速增大,NaOH濃度為1.5%時達到最大值79.25%±0.76%,這是由于NaOH對構成蛋白質分子的氫鍵造成破壞,同時一些極性基團發生解離,改變蛋白質表面帶電情況,增強蛋白質分子在溶液中的溶解[26];NaOH濃度高于1.5%時提取率下降,是由于堿性太強可能造成肽鍵斷裂、并產生脫羧、脫氨等副反應,生成蛋白交聯產物如賴氨酸-丙氨酸(lysinoalanine,LAL)、組氨酸-丙氨酸(histidinoalanine,HAL)等,影響蛋白質的功能特性[26],因此,最佳堿濃度為1.5%。

圖1 各因素對蛋白質提取率的影響

采用單一的堿液浸提方法提取蛋白,效率較低,提取過程通過超聲波輔助技術,可顯著提高蛋白質的提取效率[27-28]。利用超聲波產生的剪切和空化作用使溶劑迅速滲入物質內部,加強溶液的擴散能力和蛋白質的溶出效率[26],增大了溶液和底物的接觸面積,同時產生局部升溫,促進反應進行,提高蛋白質的浸提率。

由圖1B可知,隨著超聲波作用時間增加,超聲波的空化效應和機械效應加速蛋白分離而不斷溶出,處理時間為15 min蛋白提取率達到最大值76.40%±1.16%,此后時間繼續延長,提取率降低,可能是超聲時間過長積累反應結果,破壞了蛋白質分子之間的氫鍵、二硫鍵等化學鍵,蛋白質構象受損。因此,選擇最佳超聲波時間為15 min。

如圖1C所示,在提取初始階段隨著時間增加,提取率也不斷提高,當提取過程進行40 min時,提取率達到最大值81.55%±0.89%,提取過程繼續進行,提取率出現急速下降的情況,可能是提取時間過長,大部分蛋白質已經完全溶解,因此,最佳提取時間為40 min。

提取溫度對鮑魚臟器蛋白提取率的影響如圖1D所示,高溫導致肽鍵斷裂,蛋白質變性,可能發生凝膠作用,影響提取效果,因此70 ℃為鮑魚蛋白變性的臨界點,這與文獻資料中研究發現的大多數蛋白質在62～80 ℃時處于變形臨界點的觀點相一致。因此,最佳提取溫度為70 ℃。

料液比對蛋白提取率的影響如圖1E所示,提取率隨料液比的增大先上升后下降;料液比達到1∶18 g/mL時,提取率為最大80.12%±0.11%。一定范圍內,大的料液比可以降低體系的粘度,使蛋白質樣品在溶液中處于分散的狀態,加快蛋白質向體系溶出的過程;而料液比太小,則溶液的粘度提高,影響蛋白質向溶液中溶解過程的發生,在料液比為1∶20～1∶22 g/mL時,提取率下降,蛋白質向提取液中溶出到一定程度后不再繼續溶解,故選擇1∶18 g/mL為最佳料液比。

2.1.2 響應面試驗設計及結果分析 通過Box-Behnkend Design(BBD)方法進行響應面試驗,結果如表3所示。根據各項的回歸系數建立回歸模型,二次多項回歸方程為:

Y=81.43+0.070A+0.38B-1.08C+0.62D+0.26AB+1.22AC-1.52AD+2.96BC-0.78BD+0.58CD-5.65A2-4.07B2-1.65C2-1.81D2

表3 響應面設計及試驗結果Table 3 Design and results of response surface

表4 響應面回歸方程方差分析Table 4 ANOVA for response surface quadratic model

進一步表明各單因素對響應值的影響并非簡單的線性關系,而是極其錯綜復雜的;各因素影響主次順序依次為:C(提取時間)>D(提取溫度)>B(超聲波時間)>A(堿濃度)。

2.1.2.1 響應面分析 為進一步分析各因素對響應值的影響,繪制和分析各因素交互作用的響應面圖,結果如圖2。響應曲面坡度和等高線形狀反映了提取條件發生變化時,蛋白提取率響應值的敏感程度:若曲面陡峭,則提取條件變化時響應值敏感,若曲面坡度平緩,則提取條件變化對響應值影響不敏感;等高線為橢圓形表示交互作用影響顯著,為圓形表示交互作用影響不顯著,等高線密集,也表明交互作用顯著[29-30]。由圖2可知,超聲波時間與提取時間,堿濃度與提取溫度,堿濃度與提取時間,超聲波時間與提取時間之間的交互對響應值影響顯著,與表4的方差分析表一致。

圖2 各因素交互作用對蛋白提取率影響的響應面圖

2.1.2.2 最佳蛋白提取條件的確定及驗證 通過Design-Expert 8.0軟件進行回歸分析,得到提取鮑魚內臟蛋白最優工藝為:堿濃度1.47%,超聲波時間14.34 min,提取時間35.57 min,提取溫度81.56 ℃。此優化工藝下的提取率預測值:81.69%。為便于實際操作,設置堿濃度1.5%,超聲波時間14.5 min,提取時間35.5 min,提取溫度81.5 ℃,在此條件下驗證試驗,重復三次,可得鮑魚蛋白提取率81.01%±0.43%,誤差0.83%,表明該回歸模型可應用于生產實踐中。

2.1.3 粗蛋白沉淀的pH范圍確定 結果如圖3所示,pH在3.0～4.5之間時,曲線上升蛋白沉降量達到最大值,且在該pH范圍內始終處于較高水平。蛋白質是兩性電解質,大部分蛋白質等電點在酸性范圍,兩性電解質在溶液處于等電點時,溶解度最低;蛋白質分子之間雖然通過肽鍵相互連接,但仍有大量可解離的基團和氨基酸殘基,使得蛋白質分子所帶靜電荷隨著溶液pH的變化而發生改變。綜合考慮蛋白沉降率和時間成本等因素,調節溶液pH范圍至3.0～4.5來沉淀蛋白質。此條件下,蛋白質的沉降率約為84.56%±0.57%。

圖3 不同pH對鮑魚臟器蛋白沉淀的影響

2.2 制備水解肽最適蛋白酶的篩選

以水解度和自由基清除能力為指標篩選最適蛋白酶,制備較強抗氧化能力、營養豐富的抗氧化肽。由圖4可得出五種蛋白酶水解度大小依次為:木瓜蛋白酶>復合蛋白酶>堿性蛋白酶>中性蛋白酶>酸性蛋白酶。水解能力最強木瓜蛋白酶是一種巰基蛋白酶,作用位點主要為Lys、Arg、Phe的羧基端,由木瓜蛋白酶酶解所得的多肽溶解度、乳化能力、發泡能力都有所提高且腥味減弱,且木瓜蛋白酶中含有的3個二硫鍵使得其具有良好熱穩定性和酸堿穩定性[31]。如圖5所示,木瓜蛋白酶酶解液清除DPPH自由基和OH·自由基能力最高,清除率分別為63.17%±0.92%、24.23%±0.45%,這與圖4所示各種蛋白酶水解能力大小排序基本一致。蛋白質被酶催化水解時所斷裂的肽鍵數目是衡量水解度的標準之一,水解度越高,酶解生產的游離氨基酸和水解肽占比例也越大,含有較強抗氧化能力的活性肽段數量相應的也就越多。綜上所述,篩選木瓜蛋白酶為最適蛋白酶,調節至最佳條件進行酶解,所得上清液凍干即為抗氧化肽樣品。

圖4 最適蛋白酶的篩選

2.3 水解肽的分離純化及應用研究

2.3.1 水解肽的分離純化 將鮑魚內臟水解肽凍干粉通過Sephadex G-50凝膠過濾層析柱分離,收集洗脫液繪制洗脫曲線如圖6所示,洗脫液在214 nm處有三個峰值,將其依次命名為P1、P2、P3。

圖6 Sephadex G-50凝膠層析洗脫曲線

2.3.2 各組分抗氧化活性比較 由圖7可知,P1清除羥基自由基的能力最強,清除率為79.25%±1.12%,比原液的64.26%±0.66%高出14.99%;而P2、P3組分的羥基自由基清除率均低于原液,分別為46.25%±1.44%、14.25%±1.10%,P3的羥基自由基清除率約為P2的三分之一。P1組分清除DPPH自由基的能力最強,清除率為90.45%±0.46%,比原液的80.12%±1.34%高出10.33%,而P2、P3組分的DPPH自由基清除率均低于原液,分別為61.45%±0.46%、26.52%±1.56%,表明P2也具有一定的抗氧化能力。經預實驗得出2.0 mg/mL組分的還原力無顯著性差異，缺乏代表性，因此還原力采用組分濃度為3.0 mg/mL進行檢測分析。由圖8可知,各組分的還原能力與自由基清除能力情況一致,即P1還原能力最強,在700 nm下吸光值達到0.598±0.05,P2、P3還原能力依次遞減,吸光值分別為0.370±0.04、0.232±0.05。綜上,P1抗氧化能力最強,收集作為目標抗氧化肽段作為后續研究。

圖7 各組分自由基清除率能力

圖8 各組分還原能力

2.3.3 水解肽抗氧化應用研究

2.3.3.1 過氧化值(POV)的變化 不同質量分數的抗氧化肽對冷藏豬肉POV的影響情況如圖9A,隨著冷藏時間延長,各組豬肉樣品的POV值先增大到一定程度后降低,且在前6 d隨時間延長逐漸緩慢增加,油脂在此期間被氧化速率緩慢;第9 d開始POV值上升速度呈快速增長趨勢,到第12 d時各試驗組POV值達到最大值;12～15 d POV值的升高、降低呈現出不規律的變化趨勢,表明隨著氧化程度的加深,樣品氧化加劇與POV值沒有呈線性相關,這是因為油脂發生深度氧化時,氫過氧化物的分解速率超過生成速率,這時POV值就會降低。冷藏儲存期,對照組的POV值始終高于添加抗氧化劑的樣品組,試驗組POV值隨著抗氧化肽濃度的增大而減小,表明抗氧化肽在脂-肉體系中的抗氧化作用在一定范圍內隨著濃度的升高而增強,添加濃度為1.0%抗氧化肽的樣品組POV值變化差異不顯著(p>0.5),說明抗氧化肽濃度為1.0%時對冷藏豬肉的儲存效果良好。添加不同濃度抗氧化肽對油脂都具有一定的抗氧化效果,但與人工合成的BHT和VC相比,抗氧化能力尚有提升空間,VC抑制油脂氧化能力略高于BHT。

圖9 鮑魚抗氧化肽處理豬肉樣品在冷藏期的POV值和TBA值

2.3.3.2 硫代巴比妥酸(TBA)的變化 不同質量分數的抗氧化肽對豬肉樣品在冷藏期TBA影響情況如圖9B,隨著冷藏時間的延長,各樣品組TBA值均呈現不斷上升的趨勢,表明氧化反應隨時間的延長仍然在不斷的進行中。不添加的空白組TBA值始終高于添加抗氧化劑的處理組,隨著抗氧化肽濃度提高,TBA值基本呈減小的趨勢,這是由于抗氧化肽能有效抑制不飽和脂肪酸的氧化產物醛類的生成。在儲存期前3 d,包括空白組在內的各樣品組的TBA值無顯著差異;從第6 d起,加入抗氧化劑的樣品組的TBA與空白組之間開始存在顯著性差異性(p<0.05),空白組的TBA值大于樣品處理組;第12 d時,可以清除的看到各組TBA值隨抗氧化肽的增加而減小,空白組TBA值明顯高于其他樣品組;第15 d時,各處理組TBA值都達到最大值,空白組最大為1.522 mg/kg,其次是抗氧化肽濃度為0.1%的處理組TBA指為0.821 mg/kg,其余依次為0.02% BHT>0.50%抗氧化肽樣品組>1.0%抗氧化肽樣品組>0.02% VC,TBA值分別為0.521、0.501、0.497、0.428 mg/kg?？寡趸馁|量分數為0.1%與0.5%的樣品組的TBA值之間存在顯著差異(p<0.05),抗氧化肽質量分數為0.5%與1.0%樣品組的TBA值之間無顯著差異。與添加0.02% BHT的樣品組相比,抗氧化肽濃度為0.5%與1.0%樣品組的TBA值低于0.02% BHT,此時抗氧化肽抑制油脂自動氧化能力高于人工合成的抗氧化劑BHT。

3 結論

本文通過超聲波技術輔助堿提酸沉得到鮑魚內臟蛋白,通過響應面試驗優化可得:堿濃度1.5%,超聲波時間14.5 min,提取時間35.5 min,提取溫度81.5 ℃,在此條件下可得鮑魚蛋白提取率81.01%±0.43%,篩選木瓜蛋白酶為最適蛋白酶制備抗氧化肽,分離純化后得到抗氧化肽對OH自由基、DPPH自由基都具有較好的清除能力及還原力。收集抗氧化能力最強的部分,其對羥基自由基清除率為79.25%±1.12%,DPPH自由基的清除率為90.45%±0.46%?？疾轷U魚抗氧化肽對豬肉樣品的抗氧化效果良好。本研究表明:鮑魚內臟中含有抗氧化活性肽,它的抗氧化能力可與人工合成的抗氧化劑相媲美,為其在食品、化妝品和醫藥等領域開發天然抗氧化劑提供實驗基礎。