鹽析法制備寒富蘋果渣果膠及其抗氧化性研究

張欣萌,呂春茂,孟憲軍,李 斌,張 琦

(沈陽農業大學食品學院,遼寧沈陽 110866)

我國蘋果主產區的遼寧省因寒富蘋果等具有自主知識產權的抗寒大蘋果的選育成功及大面積推廣,其蘋果產量增長迅速,因此蘋果加工業帶來了大量果渣。日常管理中果渣只有少部分被添加到飼料中利用,大部分被當作加工廢料遺棄,而這些廢料中卻含有豐富的可溶性糖、礦物質、維生素、果膠、纖維素等營養物質,合理利用蘋果渣會減少資源的浪費,同時還可減少廢棄物對環境的污染。

果膠是一種親水性植物膠,分別以原果膠、果膠、果膠酸三種形態廣泛存在于高等植物的根、莖、葉、果等部位的細胞壁中[1]。果膠的主要成分為半乳糖醛酸,是一種非常重要的食品添加劑,可作為膠凝劑、增稠劑、穩定劑和乳化劑等應用于食品加工業中[2]。蘋果中的果膠還具有降血脂、抗癌等多種生理活性[3]。蘋果渣中果膠含量約為15%～18%,利用蘋果渣獲取果膠是其商業化應用的關鍵[4],一方面可以解決蘋果渣腐敗變質所引起的環境污染問題,另一方面也可解決我國果膠資源緊缺的現狀。

目前果膠沉淀的常用方法是醇沉法,此方法在果膠工業化生產中是應用最廣泛,也是最早實現規模化生產的方法[5],但此法沉淀果膠時需要大量的酒精,生產成本較高。而鹽析法是近年來被廣泛應用于果膠工業化生產的方法,且果膠提取率較醇沉法明顯提高。但目前鹽析法后續的脫鹽環節還存在金屬離子殘留問題,影響了產品質量。本課題系統研究了寒富蘋果果渣制備果膠的鹽析工藝和脫鹽工藝,并就其抗氧化性進行了分析,為寒富蘋果渣及其他果蔬加工廢棄物的資源化利用提供了理論依據和借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

寒富蘋果渣 沈陽市深井子金德勝果園;硫酸鋁 成都西亞試劑有限公司;氯化銅、氯化鐵、氯化鎂、硫酸銨 上海吉生物科技發展有限公司;濃氨水 成都普菲德生物技術有限公司;無水乙醇、鹽酸、亞硫酸 天津市富宇精細化工有限公司;DPPH、三羥甲基氨基甲烷(Tris) 山東魯抗立科藥業有限公司;FeSO4溶液、水楊酸、雙氧水、磷酸緩沖液 江蘇銳陽生物科技有限公司;鄰苯三酚、VC河北百味生物科技有限公司;以上試劑均為分析純。

PHS-25型數顯酸度計 上海精密科學儀器有限公司;HH-6型數顯恒溫水浴振蕩器 國華電器有限公司;TDL-40B型臺式離心機 上海安亭科學儀器廠;TU-1810型紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限公司;DHG-9070A型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海精宏實驗設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 酸法制備果膠提取液 選取鹽酸與亞硫酸配比為3∶1 (v/v)的混合酸提取液,在酸解時間為1.9 h、反應溫度90 ℃、pH為2.0、料液比為1∶17 (g/mL)的條件下進行寒富蘋果渣中果膠的提取[6]。再經過溫度為25 ℃,果膠粗提液流速為250 mL/h的大孔樹脂脫色,制備果膠提取液。

1.2.2 鹽析法沉淀果膠工藝優化

1.2.2.1 用鹽的選擇 選擇硫酸鋁、氯化銅、氯化鐵、氯化鎂和氯化鋁5種能與果膠產生沉淀的鹽,制成對應的飽和溶液各取3 mL,向每種飽和溶液中加入100 mL的果膠提取液,用濃氨水調pH至5.0,在60 ℃下保溫沉淀45 min。沉淀物再經過脫鹽、70 ℃的烘箱干燥至恒重等處理制得果膠,以果膠得率為主要指標,確定適用于沉淀果膠的鹽。

1.2.2.2 單因素實驗 采用1.2.1中果膠提取液,考察沉淀溫度、保溫時間、pH以及料液比(沉淀果膠用鹽:果膠提取液)四個因素對鹽析法沉淀制備果膠的影響。制備條件為:固定保溫沉淀時間80 min,pH4.0,料液比1∶20 g/mL,考察不同溫度(40、50、60、70、80、90 ℃)對果膠得率的影響;固定沉淀溫度70 ℃,pH4.0,料液比1∶20 g/mL,分別考察不同保溫時間(20、40、60、80、100、120 min)對果膠得率的影響;固定沉淀溫度為70 ℃,時間80 min,料液比為1∶20 g/mL,觀察pH(2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0)的變化對果膠得率的影響;固定沉淀溫度為70 ℃,保溫時間80 min,pH為4.0,考察不同料液比(1∶8、1∶12、1∶16、1∶20、1∶24、1∶28 g/mL)對果膠得率的影響。

1.2.2.3 響應面優化試驗 試驗采用Minitab 16軟件設計響應面試驗方案[7],以Box-Behnken設計建立數學模型,選取沉淀溫度(X1)、保溫時間(X2)、pH(X3)和料液比(X4)為自變量,以果膠得率(Y)為響應值,設計四因素三水平共計27 個試驗,中心點重復3次,分析結果數據。試驗設計因素及水平見表1。

表1 響應面因素和水平Table 1 Factors and levels in response surface design

1.2.2.4 果膠得率的計算

1.2.3 果膠脫鹽工藝優化

1.2.3.1 脫鹽液中酸含量 準備六份150 mL脫鹽液(乙醇+鹽酸+水),其中乙醇的含量固定為60%,鹽酸的含量分別為1%、2%、3%、4%、5%、6%,其余全部為水。取3 g果膠鹽粉末放入脫鹽液中50 ℃下保溫攪拌30 min后4000 r/min離心7 min,靜置取下層沉淀放入干燥潔凈的表面皿中,于70 ℃在鼓風干燥箱中干燥至恒重,測量各組果膠重量。

1.2.3.2 脫鹽液的用量 分別準備100、150、200、250、300和350 mL的脫鹽液(乙醇60%+鹽酸3%+水37%),向其中各加入3 g果膠鹽粉末,50 ℃下保溫攪拌30 min,4000 r/min下離心7 min,靜置取沉淀物在70 ℃的鼓風干燥箱中干燥至恒重,測量各組果膠重量。

1.2.3.3 脫鹽的時間 準備五份150 mL的脫鹽液(乙醇60%+鹽酸3%+水37%),各加入3 g果膠鹽粉末,50 ℃下分別保溫攪拌20、30、40、50和60 min,4000 r/min離心7 min后靜置取下層沉淀物放入干燥潔凈的表面皿中,于70 ℃在鼓風干燥箱中干燥至恒重,測量、記錄果膠重量。

1.2.3.4 脫鹽溫度 準備五份150 mL的脫鹽液(乙醇60%+鹽酸3%+水37%)分別加入3 g果膠鹽粉末,在20、30、40、50和60 ℃下保溫攪拌30 min,以4000 r/min離心7 min,靜置取下層沉淀物放入干燥潔凈的表面皿中,在70 ℃的鼓風干燥箱中干燥至恒重,稱量各組果膠重量并記錄。

1.2.4 抗氧化性實驗

1.2.4.1 DPPH·清除率的測定 按照1.2.3最佳工藝制備脫鹽果膠粉,配成不同濃度(0.5、0.7、0.9、1.2、1.5、2.0、2.5 mg/mL)的待測果膠樣品各2 mL,加入等量0.2 mmol/L的DPPH-乙醇溶液,搖勻之后避光常溫下放置0.5 h。DPPH·溶于乙醇后形成的紫色溶液最大吸收波長為517 nm[8],利用紫外分光光度計測定517 nm下吸光度A樣品。再以相同濃度的果膠樣品2 mL,加入2 mL乙醇溶液作為對照組,測定其吸光度A對照。向2 mL蒸餾水加入2 mL 0.2 mmol/L的DPPH-乙醇溶液作為空白組,測定吸光度A空白。共測定3次,取每組平均值計算清除率。以VC為陽性對照,結果越大,說明樣品的抗氧化性越強[9],計算公式如式(1)。

式(1)

1.2.4.2 ·OH自由基清除率的測定 利用Fenton反應體系[10]來測定蘋果渣果膠對于·OH自由基的清除作用。準備果膠樣品(0.5、0.7、0.9、1.2、1.5、2.0、2.5 mg/mL)各1 mL,取2 mL 1.8 mmol/L的FeSO4溶液和1.5 mL 1.8 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液,再加入0.1 mL含量為0.3%的雙氧水,充分混合搖勻。在37 ℃的下水浴保溫0.5 h,利用分光光度計在510 nm處[11]測得吸光度A樣品,以蒸餾水代替果膠樣品作為對照A對照。以VC為陽性為對照計算自由基的清除率,公式如式(2)。

式(2)

式(3)

1.2.4.4 卵黃脂蛋白脂質過氧化抑制率的測定 制備卵黃懸液:取雞蛋中的卵黃部分,再取與卵黃等體積的0.1 mol/L pH7.4的磷酸緩沖液充分混合配成懸液。用磷酸緩沖液將懸液稀釋25 倍,放入冰箱冷藏室備用。

取配制好的1 mL懸液放入具塞試管中,分別加入0.5 mL果膠樣品(0.5、0.7、0.9、1.2、1.5、2.0、2.5 mg/mL)、1 mL 25 mmol/L的硫酸亞鐵和1 mL磷酸緩沖液,混合均勻,放入水浴振蕩器(37 ℃)振蕩15 min。完畢后再向試管中分別加入1 mL 20%的三氯乙酸混合均勻,4500 r/min離心15 min。取上清液3 mL,分別加入1 mL 0.8%的硫代巴比妥酸,蓋好管塞,放入沸水中加熱10 min。待加熱完成后取出試管,冷卻至室溫,采用分光光度計在532 nm處測定吸光度A樣品,用蒸餾水代替果膠樣品作為對照A對照,以樣品的抗氧化活性判斷果膠對卵黃脂蛋白氧化的抑制程度,以VC做陽性對照[13]。卵黃脂蛋白脂質過氧化抑制率見式(4)。

式(4)

1.3 數據處理

實驗中所有數據測定全部重復三次,結果以平均數±標準偏差表示。數據處理[14]采用SPSS 18.0分析軟件對實驗數據進行差異顯著性分析,p<0.05為差異顯著,p<0.01為差異極顯著。響應面優化試驗中利用Minitab 16軟件對數據進行Box-Behnken組合設計,建立數學模型進行結果分析。

2 結果與分析

2.1 鹽析法沉淀果膠工藝優化結果

2.1.1 果膠提取液中果膠含量 根據1.2.1中果膠提取工藝,粗體液經過大孔樹脂純化后,在寒富蘋果渣中果膠得率為14.96%。制成的果膠提取液供后續鹽析法沉淀果膠的工藝優化使用。

2.1.2 不同鹽種類對沉淀果膠效果的影響 如圖1,硫酸鋁沉淀的果膠得率為11.68%,氯化銅的果膠得率為11.54%,氯化鐵對應的果膠得率為9.89%,氯化鋁對應的果膠得率為7.96%,氯化鎂對應的果膠得率最低僅為5.69%。硫酸鋁和氯化銅的果膠得率差別不大,但經硫酸鋁沉淀的果膠顏色最淺,而氯化銅所沉淀的果膠顏色偏深,對果膠的品質產生影響[15],且銅離子為重金屬離子,若后續脫鹽不徹底會導致果膠產品中的重金屬超標,因此,選擇硫酸鋁為最佳用鹽。

圖1 不同用鹽對于果膠得率的影響

2.1.3 鹽析法沉淀果膠單因素試驗的結果分析

2.1.3.1 沉淀溫度對果膠沉淀效果的影響 如圖2,隨著溫度的升高果膠得率也呈現上升趨勢,當溫度為40 ℃時,果膠得率僅為6.23%,溫度上升到70 ℃時果膠得率顯著增加至13.48%(p<0.05)。然而隨著溫度繼續上高,果膠的得率開始略有下降。由于鹽析沉淀果膠過程會伴有解聚現象發生,當溫度過高,解聚現象增強[16],導致果膠得率開始下降;而溫度過低時則使果膠沉淀緩慢,反應體系變得粘稠,同樣導致產率偏低,因此選擇70 ℃為最優的沉淀溫度。

圖2 溫度對果膠得率的影響

2.1.3.2 保溫時間對果膠沉淀效果的影響 如圖3所示,果膠得率隨著保溫時間的延長逐漸上升,當時間過短,不利于果膠與金屬鹽離子充分形成果膠鹽沉降下來,導致果膠得率偏低。保溫時間為20 min時果膠得率為8.16%,在60 min處達到峰值,果膠得率顯著增加到13.58%(p<0.05),而后隨著時間繼續增加得率趨于平穩且無明顯變化。因此選擇60 min作為最佳保溫時間。

圖3 保溫時間對果膠得率的影響

2.1.3.3 不同pH對于果膠沉淀效果的影響 如圖4,pH小于5.0時,隨著pH的增大,果膠得率逐漸升高。當pH為5.0時果膠鹽充分沉淀,果膠得率達到最大14.02%(p<0.05),大于5.0時,隨著pH繼續增大果膠得率略有下降。因此選擇pH為5.0作為最佳實驗條件進行后續實驗。

圖4 pH對果膠得率的影響

2.1.3.4 不同料液比對果膠沉淀效果的影響 不同料液比對果膠沉淀效果的影響如圖5所示。果膠得率隨著料液比的增大先增大后逐漸降低,當溶劑較少時,果膠得率偏低,可能是溶劑量少,物料粘度大,導致果膠從溶液中的析出量少[17],從而果膠得率低。當料液比在1∶16 (g/mL)處果膠得率達到峰值為13.67%(p<0.05),因此選擇料液比1∶16 (g/mL)作為果膠沉淀的最佳比例。

圖5 料液比對果膠得率的影響

2.1.4 響應面優化試驗結果分析

2.1.4.1 建立響應面模型與顯著性分析 本試驗采用Box-Behnken組合設計,利用Minitab 16軟件對果膠的提取進行定量研究并建立數學模型,研究提高鹽析法沉淀果膠的得率方法,試驗設計及結果如表2所示。

表2 Box-Behnken組合試驗設計及試驗結果Table 2 Experimental design and results of extraction by Box-Behnken

通過對表2進行統計分析得出表3回歸方差分析結果,并且建立二次回歸方程如下:

表3 響應面回歸模型的方差分析(ANOVA)Table 3 ANOVA analysis for response surface design

2.1.4.2 響應面及等高線圖分析 根據表3可知,沉淀溫度與pH、保溫時間與料液比相互作用對果膠得率影響顯著,為了方便考察模型中交互項對于果膠得率的影響,在其他條件保持不變的情況下,分析兩個因素相互作用對果膠得率的影響,利用Minitab 16軟件分析,得到響應面圖及等高線圖如圖6所示。

如圖6,由3D響應面圖及等高線圖可以直觀地反映沉淀溫度、保溫時間、料液比、pH與響應值果膠得率的關系。影響因素的增大,導致果膠得率的變化也隨之增大,但當果膠得率到達頂點后,又伴隨著影響因素的增大而開始下降[18]。最終結果與方差分析一致,在交互項中沉淀溫度與pH相互作用對果膠得率的影響顯著(p<0.05),料液比與保溫時間兩兩作用對果膠得率的影響顯著。

圖6 鹽析的響應面及其等高線

2.1.4.3 鹽析法沉淀果膠工藝參數的優化驗證 根據響應面試驗并通過軟件優化得到鹽析法沉淀果膠的最佳工藝參數為:沉淀溫度73.93 ℃,保溫時間68.68 min,pH5.01,料液比1∶16.56 g/mL,在此最佳條件下蘋果渣果膠得率的理論值為15.63%。考慮到實際操作,將最佳工藝修正為:沉淀溫度74 ℃,保溫時間為69 min,pH為5.0,料液比為1∶17 g/mL。在此鹽析工藝下進行驗證,果膠得率可達15.59%±0.51%,與理論值15.63%相近,表明該模型對鹽析法沉淀果膠的方案可行。

2.2 脫鹽條件結果分析

果膠脫鹽部分的結果好壞直接影響果膠的品質及其用途,硫酸鋁滴入果膠中形成的氫氧化鋁與果膠相遇后,兩種膠體發生聚沉繼而使果膠沉淀出來,此過程可逆。之后再通過酸將鋁離子溶解出來,從而達到脫鹽的目的[19]。

2.2.1 脫鹽液中鹽酸的用量 當脫鹽液中酸量過少時,無法把全部的鋁離子都置換出來,鋁離子的殘留導致果膠成品中鋁離子的超標,影響果膠品質;當酸量過多則會引起果膠一定程度上的降解,并導致果膠成品的顏色過深,影響果膠品質。

如圖7所示,含酸量為1%時所得的果膠質量為1.25 g,雖然得膠量大,但由于酸量的不足導致鋁離子殘留,所得的果膠量并不是真實的含量;當含酸量增大的時候果膠質量開始趨于平穩,含酸量為3%時所得果膠質量為0.86 g(p<0.05),含酸量為4%時所得果膠質量為0.85 g,含酸量繼續增大果膠質量下降不足0.2 g,故選擇酸的添加量為3%,因此脫鹽液的組成為60%乙醇+3%鹽酸+37%水。

圖7 鹽酸用量對脫鹽效果的影響

2.2.2 脫鹽液的用量 在對果膠脫鹽的試驗中,脫鹽液的用量對脫鹽效果的影響也是至關重要的。如圖8,脫鹽液為100 mL時,所得果膠質量為1.12 g,隨著脫鹽液用量的增大,果膠得量開始下降后趨于平穩。這是由于初期脫鹽液量不足導致果膠鹽中的金屬離子無法充分溶出,果膠脫鹽不徹底從而果膠品質下降,所得果膠量也不能真實反應果膠的實際質量。當脫鹽液增加到150 mL時,所得果膠質量為0.89 g(p<0.05),之后繼續增加脫鹽液用量果膠得量幾乎保持不變,當脫鹽液量過多雖然可以保證脫鹽效果很好,但是造成浪費增加生產成本,所以通過試驗找到一個合適的用量是必要的。故每3 g果膠鹽選擇脫鹽液用量為150 mL為最佳用量。

圖8 脫鹽液用量對脫鹽效果的影響

2.2.3 脫鹽時間 脫鹽時間的長短對果膠脫鹽是否徹底,有著很重要的影響。如圖9所示,脫鹽時間為20 min時,所得果膠質量為1.02 g,隨著反應時間延長,果膠脫鹽越充分,但果膠質量開始下降,這是由于當脫鹽時間不充足,反應無法充分完成,但反應時間過長則會導致部分果膠開始發生降解[20],當脫鹽時間為40 min時所得果膠質量為0.88 g(p<0.05),脫鹽時間為50 min時所得果膠為0.87 g,時間繼續增大為60 min時果膠質量都有一定程度的下降,造成浪費資源。因此選擇40 min為最合適的脫鹽時間。

圖9 脫鹽時間量對脫鹽效果的影響

2.2.4 脫鹽溫度 脫鹽過程中合適的反應溫度對于提高反應的完成速度和效果有著重要影響,溫度過低,會使反應耗時過長,溫度過高又會使果膠降解影響果膠品質。如圖10,溫度為20 ℃時,所得果膠質量為0.92 g,溫度繼續升高后,果膠質量發生明顯變化。當溫度到達40 ℃時,所得果膠的質量為0.85 g(p<0.05),而后產量開始平穩或略有減少。因此選擇脫鹽溫度為40 ℃最佳。

圖10 脫鹽溫度對脫鹽效果的影響

2.2.5 最佳脫鹽工藝驗證 根據以上四組試驗確定果膠脫鹽的最佳工藝參數為:脫鹽液中鹽酸含量為3%(60%乙醇+3%鹽酸+37%水),脫鹽液用量為每3 g果膠鹽用150 mL,脫鹽時間為40 min,脫鹽溫度為40 ℃。在此條件下驗證結果為果膠所得質量(0.89±0.10) g。

2.3 蘋果渣果膠抗氧化性結果分析

2.3.1 DPPH·清除效果 如圖11,此濃度下的VC對DPPH·清除率保持在90%以上。由于果膠樣品是隨著果膠濃度的增大,溶液產生褪色反應,對DPPH自由基的清除效果逐漸增強[21]。當果膠濃度為2 mg/mL時,清除率達到最大為73.34%(p<0.05)。

圖11 果膠樣品和VC的DPPH·的清除能力

2.3.2 ·OH自由基清除效果分析 如圖12,果膠樣品對于羥基自由基具有一定的清除效果,當果膠濃度為0.5 mg/mL時,清除率僅為2.45%,濃度增大到1.5 mg/mL時,清除率增加至24.98%(p<0.05)。VC對其的清除效果則是隨著濃度升高而大大增強,當濃度到達1.2 mg/mL,清除率基本穩定在90%以上。可以明顯看出蘋果渣提取的果膠清除·OH自由基能力低于VC。

圖12 果膠樣品和VC的·OH的清除能力

2.3.3 清除超氧陰離子自由基效果分析 由圖13可知,隨著樣品和VC濃度的增加對于超氧陰離子的清除效果逐漸增強,當VC的濃度達到1.2 mg/mL時,其對超氧陰離子自由基的清除率穩定在90%以上。當果膠樣品濃度為0.5 mg/mL時其對于超氧陰離子的清除率僅為5.19%,增加果膠樣品的濃度至2 mg/mL時,清除率最大為32.66%(p<0.05)。

圖13 果膠樣品和VC對于超氧陰離子自由基的清除效果 free radical removal capability of pectin and VC

2.3.4 卵黃脂蛋白脂質過氧化抑制效果的分析 如圖14,隨著樣品的供試濃度逐漸增大,過氧化抑制效果也逐漸增強,VC對于脂質過氧化的抑制效果基本保持在80%以上,果膠樣品則是濃度達到1.2 mg/mL時,抑制率最高為61.42%(p<0.05)。

圖14 果膠樣品和VC對于卵黃脂蛋白過氧化的抑制效果

3 結論

在鹽析法提取果膠過程中的適宜用鹽、鹽析沉淀果膠的工藝條件和脫鹽條件試驗中,通過對幾種鹽的比較,利用果膠得率確定鹽析法的最佳工藝。研究結果表明,在同樣的條件下用硫酸鋁制取的果膠無論是得率還是品質都有著明顯的優勢;在鹽析法沉淀果膠的工藝優化中,確定最佳工藝參數為鹽析溫度74 ℃,時間為69 min,pH為5.0,料液比1∶17 (g/mL)。此工藝下果膠得率達到15.59%。在脫鹽試驗中主要考察了脫鹽液中酸的含量、脫鹽液用量、脫鹽時間以及脫鹽溫度對果膠得率的影響,最終確定了脫鹽的最佳工藝為脫鹽液中鹽酸含量為3%(60%乙醇+3%鹽酸+37%水),脫鹽液用量為每克果膠鹽50 mL,脫鹽時間為40 min,脫鹽溫度為40 ℃。通過果膠對DPPH·、·OH、超氧陰離子的清除效果以及對卵黃脂蛋白脂質過氧化的抑制效果考察蘋果渣果膠的抗氧化能力。以VC作為對比參考,發現蘋果渣果膠對于DPPH·自由基的清除效果和對卵黃脂蛋白脂質過氧化的抑制效果優于另外兩種體系,證明了蘋果渣果膠具有一定的清除自由基和抑制脂質過氧化的能力,可作為一種天然的抗氧化劑進行開發。