復(fù)合乳酸菌發(fā)酵枸杞汁的工藝優(yōu)化

王 茹,方海田,*,劉慧燕,馬若霜,劉予煊,李金娜,趙貝貝,周 婷,魏姍姍,安廣穎

(1.寧夏大學(xué)，寧夏食品微生物應(yīng)用技術(shù)與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,寧夏銀川 750021;2.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院,寧夏銀川 750021)

枸杞(Lyciumbarbarum),也稱枸杞子,屬茄科枸杞的成熟果實(shí),是我國(guó)重要的特色藥用植物資源之一,分布在我國(guó)寧夏、新疆、青海和甘肅等地[1]。枸杞主要成分有枸杞多糖、甜菜堿、枸杞色素、黃酮、蛋白質(zhì)、游離氨基酸、維生素E和維生素C等[2-3],具有增強(qiáng)人體免疫力、降低膽固醇、抗腫瘤、抗氧化、抗衰老等方面的藥理作用[4-5]。

植物乳桿菌和腸膜明串珠菌是食品中常用的乳酸菌[6-10],膜明串珠菌又稱風(fēng)味菌、香氣菌和產(chǎn)香菌,和植物乳桿菌腸同為革蘭氏陽(yáng)性菌[11]。有研究表明,腸膜明串珠菌和植物乳桿菌進(jìn)行混合發(fā)酵會(huì)得到風(fēng)味和品質(zhì)更好的產(chǎn)品[12-14]。汪敏[12]利用腸膜明串珠菌和植物乳桿菌對(duì)辣椒進(jìn)行發(fā)酵,研究發(fā)現(xiàn)混合菌株發(fā)酵的產(chǎn)品風(fēng)味明顯優(yōu)于單菌株發(fā)酵。李秀秀等[15]按照石榴枸杞果汁體積比2∶1,酵母量3%,發(fā)酵時(shí)間6 d,發(fā)酵溫度28 ℃的配方發(fā)酵石榴枸杞酒;成堃等[16]利用保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌(1∶1)研究蟲草枸杞風(fēng)味酸奶的工藝。嚴(yán)倩云等[17]以枸杞和瑪咖水提物殘?jiān)鼮樵?37 ℃發(fā)酵24 h,生產(chǎn)酵素產(chǎn)品。雖然上述以枸杞為原料的加工工藝研究不少,但用乳酸菌直接發(fā)酵枸杞汁的工藝較少,且大多發(fā)酵過程太慢,生長(zhǎng)周期長(zhǎng),會(huì)提高產(chǎn)品的成本。為了縮短發(fā)酵周期,降低生產(chǎn)成本,拓展枸杞產(chǎn)品的開發(fā)和生產(chǎn)。

因此,本論文以枸杞干果為主要原料,將其破碎取汁后接入腸膜明串珠菌和植物乳桿菌進(jìn)行混合發(fā)酵,旨在開發(fā)一種富含功能因子的發(fā)酵枸杞汁,為益生菌在發(fā)酵枸杞汁方面的應(yīng)用提供理論和實(shí)踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

枸杞、白砂糖、小蘇打 市售;異抗壞血酸鈉 特正商貿(mào)有限公司;植物乳桿菌、腸膜明串珠菌 寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院生物實(shí)驗(yàn)室保存;MRS培養(yǎng)基 青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司;考馬斯亮藍(lán)G-20、牛血清蛋白、蘆丁、苯酚、濃硫酸、葡萄糖 均為分析純,北京索萊寶科技有限公司。

RZ-988eRoyalstar打漿機(jī) 合肥榮事達(dá)小家電公司;PB-LO pH計(jì) 賽多利斯科學(xué)儀器有限公司;PLD-HDE2.0手持糖量計(jì) 陜西普洛帝測(cè)控技術(shù)有限公司;V-5100紫外分光光度計(jì) 上海精科實(shí)業(yè)有限公司;SBA-40E生物傳感分析儀 山東省科學(xué)院研究所。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 乳酸菌的活化與擴(kuò)大培養(yǎng) 將保存于甘油中的腸膜明串珠菌和植物乳桿菌分別接入MRS斜面培養(yǎng)基上,37 ℃恒溫培養(yǎng)8～10 h后取出,重復(fù)3次,使其充分活化。

將挑取一環(huán)斜面培養(yǎng)基上生長(zhǎng)較好的單菌落,接種至MRS液體培養(yǎng)基中,37 ℃恒溫培養(yǎng)8～10 h后取出,震蕩搖勻后,按照接種量1%轉(zhuǎn)接于100 mL三角瓶中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)(37 ℃,8～10 h),得到腸膜明串珠菌和植物乳桿菌菌懸液,備用。

1.2.2 發(fā)酵枸杞汁制備工藝 挑選肉厚,無腐爛的中寧枸杞,用流動(dòng)水多次沖洗枸杞表皮,洗掉黏在枸杞表面的污垢后,以1∶5 (m∶v)加水,浸泡8～9 h,加入護(hù)色劑(0.05%的異抗壞血酸鈉),后打漿,用無菌紗布和漏斗過濾,得到枸杞汁。添加適量的小蘇打調(diào)pH至6.5～7.0后,加入適量白砂糖后,采用巴氏殺菌法(65 ℃,25～35 min)進(jìn)行殺菌。殺菌結(jié)束后,將制備好的菌液,按一定的接種比例接入枸杞汁中,放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵一定時(shí)間,得到成品。

1.2.3 單因素試驗(yàn) 固定接種量5%,發(fā)酵時(shí)間為10 h,白砂糖加量5%,考察腸膜明串珠菌:植物乳桿菌不同體積比(1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1)對(duì)枸杞汁中乳酸含量和感官評(píng)價(jià)的影響;固定腸膜明串珠菌∶植物乳桿菌1∶1,發(fā)酵時(shí)間10 h,白砂糖加量5%,考察不同接種量(3%、4%、5%、6%、7%)對(duì)枸杞汁中乳酸含量和感官評(píng)價(jià)的影響;固定腸膜明串珠菌∶植物乳桿菌1∶1,接種量5%,白砂糖加量5%,考察不同發(fā)酵時(shí)間(8、9、10、11、12 h)對(duì)枸杞汁中乳酸含量和感官評(píng)價(jià)的影響;固定腸膜明串珠菌∶植物乳桿菌1∶1,接種量5%,發(fā)酵時(shí)間10 h,考察不同白砂糖加量(3%、4%、5%、6%、7%)對(duì)枸杞汁中乳酸含量和感官評(píng)價(jià)的影響,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化 在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,確定菌種比例、接種量、發(fā)酵時(shí)間、白砂糖加量4個(gè)因素的水平值,以感官評(píng)分為指標(biāo)，運(yùn)用Design-Expert 10.0.7軟件進(jìn)行Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析。具體實(shí)驗(yàn)因素與各水平值見表1,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

表1 枸杞發(fā)酵工藝條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Test factors and levels of optimization response surface of Lycium barbarum fermentation technology

1.2.5 乳酸含量的測(cè)定 采用生物傳感分析儀直接測(cè)定。

1.2.6 感官評(píng)價(jià) 枸杞復(fù)合飲料加工后,請(qǐng)15位有豐富評(píng)定經(jīng)驗(yàn)的專業(yè)人員組建感官評(píng)定小組,通過表2分別從色澤、滋味、協(xié)調(diào)性和組織狀態(tài)對(duì)枸杞復(fù)合飲料進(jìn)行綜合評(píng)定,總分為100分,然后取其平均值作為評(píng)分結(jié)果。

表2 枸杞發(fā)酵飲料感官品質(zhì)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Evaluation standard of sensory quality of Lycium barbarm juice

1.2.7 理化及微生物指標(biāo)的測(cè)定 可溶性固形物測(cè)定:采用手持糖度計(jì)直接測(cè)定;pH的測(cè)定:采用精密pH計(jì);蛋白質(zhì)含量的測(cè)定:采用考馬斯亮藍(lán)G-250 法測(cè)定[18];總黃酮含量的測(cè)定:采用紫外分光光度法測(cè)定[19];總糖含量的測(cè)定:采用苯酚-濃硫酸法測(cè)定[20];乳酸菌菌落總數(shù)和致病菌的測(cè)定:采用GB 4789-2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)乳酸菌檢驗(yàn)》[21]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2007及Design-Expert 10.0.7軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素結(jié)果

2.1.1 菌種比例對(duì)枸杞汁的影響 由圖1可知,當(dāng)腸膜明串珠菌∶植物乳桿菌的比例為1∶3時(shí),乳酸含量最高為349 mg/100 mL;當(dāng)腸膜明串珠菌∶植物乳桿菌的比例為1∶1時(shí),感官評(píng)分最高90.12 分。植物乳桿菌代謝產(chǎn)生有機(jī)酸、過氧化氫、雙乙酰等多種天然活性物質(zhì),具有維持腸道內(nèi)菌群平衡,降低膽固醇水平,抑制腫瘤前體物質(zhì)形成[22-25],提高機(jī)體免疫力等多種益生菌功能[26]。腸膜明串珠菌主要發(fā)酵蔗糖產(chǎn)生酸、葡聚糖[27]和甘露醇[28]等物質(zhì),并產(chǎn)生大量B族維生素,產(chǎn)生多種風(fēng)味物質(zhì)[29],大量的有機(jī)酸、醇類及各種氨基酸等代謝物[30],可以調(diào)節(jié)腸道菌群,抑制抗腐敗菌[31]。由圖可知,當(dāng)腸膜明串珠菌比例越來越大時(shí),乳酸逐漸降低,出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是由于雖然腸膜明串珠菌和植物乳桿菌都是高產(chǎn)酸菌株,但和腸膜明串珠菌相比,植物乳桿菌產(chǎn)酸能力更強(qiáng)[32]。因此,根據(jù)乳酸含量和感官評(píng)分,擇取菌種比例三個(gè)較優(yōu)的水平分別為1∶2、1∶1、2∶1。

圖1 菌種比例對(duì)枸杞汁乳酸含量和感官評(píng)分的影響

2.1.2 接種量對(duì)枸杞汁的影響 由圖2可知,發(fā)酵液中的乳酸含量隨接種量的增加而呈先上升后逐漸平穩(wěn)的趨勢(shì)。在接種量為7%時(shí),乳酸含量達(dá)到最大值為350 mg/100 mL,而在接種量為5%時(shí),感官評(píng)分最高90.56分。在接種量為3%～5%范圍內(nèi),乳酸含量增長(zhǎng)最快,這可能是因?yàn)槌跏艰坭街械臓I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富,接種量越大,乳酸菌迅速利用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行發(fā)酵。但是,當(dāng)接種量大于5%后,乳酸含量趨于平穩(wěn)。這可能由于乳酸菌種間存在競(jìng)爭(zhēng),營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)用于自身繁殖,一部分菌體在競(jìng)爭(zhēng)中處于劣勢(shì)而死亡。因而,接種量選擇4%、5%、6%三個(gè)水平進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

2.1.3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)枸杞汁的影響 由圖3可知,發(fā)酵液中的乳酸含量隨時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增加,但增加的趨勢(shì)越來越弱。當(dāng)發(fā)酵12 h時(shí),乳酸含量達(dá)到最大值349 mg/100 mL,當(dāng)枸杞汁發(fā)酵10 h時(shí),感官評(píng)分最高90.21分。在發(fā)酵8～10 h時(shí),乳酸含量急劇增加,這可能是因?yàn)榘l(fā)酵初期,枸杞汁中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富,乳酸菌大量繁殖,不斷消耗營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)產(chǎn)生大量的乳酸。在發(fā)酵10 h時(shí),延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間,乳酸含量逐漸趨于平穩(wěn)。這是可能是因?yàn)殍坭街械臓I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不斷消耗,乳酸含量不斷增加,酸度上升,過酸的條件不利于乳酸菌的生長(zhǎng),使菌株的生長(zhǎng)和代謝受到抑制。因而,選取發(fā)酵時(shí)間的三個(gè)較優(yōu)的水平分別為9、10、11 h。

圖3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)枸杞汁乳酸含量和感官評(píng)分的影響

2.1.4 白砂糖加量對(duì)枸杞汁的影響 由圖4可知,發(fā)酵液中的乳酸含量隨著白砂糖加量的增加而呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)白砂糖加量在5%的時(shí)候,乳酸含量達(dá)到最高,為340 mg/mL,當(dāng)白砂糖加量為5%時(shí),感官評(píng)分最高90.12分。當(dāng)白砂糖加量在3%～4%時(shí),乳酸含量比較低,這可能是因?yàn)樘荚床怀渥?發(fā)酵不充分,當(dāng)白砂糖加量大于5%時(shí),乳酸含量都逐漸趨于平緩,可能是由于過高的碳源濃度導(dǎo)致發(fā)酵液滲透壓升高,對(duì)微生物生長(zhǎng)有輕微的抑制作用,導(dǎo)致微生物代謝減慢。綜上所述,白砂糖加量選擇4%、5%、6%三個(gè)水平進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

圖4 白砂糖加量對(duì)枸杞汁乳酸含量和感官評(píng)分的影響

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果及數(shù)據(jù)分析

2.2.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果 在上述單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,利用Box-Behnken試驗(yàn),以枸杞汁中乳酸含量和感官評(píng)分為響應(yīng)值,以菌種比例(A)、接種量(B)、發(fā)酵時(shí)間(C)和白砂糖加量(D)為自變量,建立四因素三水平中心組合實(shí)驗(yàn)。

表中數(shù)據(jù)為3 組平行試驗(yàn)結(jié)果平均值。

2.2.2 回歸方程擬合及方差分析 以乳酸含量為響應(yīng)值,回歸分析結(jié)果見表4,對(duì)各因素回歸擬合后,得到回歸方程為:

表4 以乳酸含量為響應(yīng)值的回歸模型及方差分析Table 4 Regression model and variance analysis based on lactic acid content

Y1(乳酸含量)=341.60+11.83A+10.42B+9.42C-3.17D+0.25AB-1.25AC+2.00AD-2.50BC-1.00BD-1.00CD-10.03A2-7.41B2-5.66C2-10.03D2

表5 以感官評(píng)分為響應(yīng)值的回歸模型及方差分析Table 5 Regression Model and Variance Analysis with sensory score as response value

該模型p<0.01,說明該模型極顯著;失擬項(xiàng)p>0.05,說明沒有產(chǎn)生失擬現(xiàn)象。R2為 0.9982,說明擬合度良好,方程的顯著性及可靠性極高。各項(xiàng)方差分析表明,一次項(xiàng)A、B、C、D,交互項(xiàng)AD、BC,平方項(xiàng)A2、B2、C2、D2對(duì)乳酸含量有極顯著影響(p<0.01)。根據(jù)F值大小可知,各因素對(duì)乳酸含量影響的主次因素為A>B>C>D,即菌種比例>接種量>發(fā)酵時(shí)間>白砂糖加量。對(duì)乳酸含量影響的交互項(xiàng)中,AD即菌種比例和白砂糖加量以及BC即接種量和發(fā)酵時(shí)間交互作用對(duì)乳酸含量的影響有極顯著影響(p<0.01),其響應(yīng)面圖5。由于其他因素的交互作用對(duì)乳酸含量和感官評(píng)分的影響較小,所以未列出。

圖5 菌種比例、接種量、發(fā)酵時(shí)間和白砂糖加量對(duì)乳酸含量影響的響應(yīng)面

將感官評(píng)分作為響應(yīng)值,回歸分析結(jié)果見表5,得到模型的二次多項(xiàng)回歸方程:

Y2(感官評(píng)分)=91.86+1.34A+0.85B+0.18C+1.72D-1.54AB+0.25AC+0.14AD-0.76BC-0.63BD+0.26CD-6.85A2-6.07B2-5.42C2-6.76D2

該模型p<0.01,說明該模型極顯著;失擬項(xiàng)p>0.05,說明沒有產(chǎn)生失擬現(xiàn)象。R2為0.9970,說明擬合度良好,方程的顯著性及可靠性極高。各項(xiàng)方差分析表明,一次項(xiàng)A、B、D,交互項(xiàng)AB、BC、BD,平方項(xiàng)A2、B2、C2、D2對(duì)感官評(píng)分有極顯著影響(p<0.01)。根據(jù)F值大小可知,各因素對(duì)乳酸含量影響的主次因素為D>A>B>C,即白砂糖加量>菌種比例>接種量>發(fā)酵時(shí)間。在交互項(xiàng)對(duì)感官評(píng)分的影響中,AB即菌種比例和接種量,BC即接種量和發(fā)酵時(shí)間及BD接種量和白砂糖加量交互作用對(duì)感官評(píng)分的影響有極顯著影響(p<0.01),其響應(yīng)面見圖6。由于其他因素的交互作用對(duì)乳酸含量和感官評(píng)分的影響較小,所以未列出。

2.2.3 響應(yīng)面圖分析 由圖5可以直觀地看出各因素交互作用對(duì)乳酸含量的影響,若曲線越陡峭,表明響應(yīng)值對(duì)于操作條件的改變?cè)矫舾?此因素的交互作用對(duì)感官評(píng)價(jià)的影響越大;反之曲面坡度越平緩,操作條件的改變對(duì)響應(yīng)值的影響也就越小[32]。從圖5可知,白砂糖加量和菌種比例的坡度很陡峭,說明兩者交互作用對(duì)乳酸含量的影響很大,達(dá)到極顯著水平(p<0.01);發(fā)酵時(shí)間和接種量交互形成的曲面很陡峭,說明發(fā)酵時(shí)間和接種量?jī)梢蛩氐慕换プ饔煤軓?qiáng),對(duì)乳酸含量的影響達(dá)到極顯著水平(p<0.01)。

從圖6可知,接種量和菌種比例的坡度很陡峭,說明接種量和菌種比例兩者交互作用變化明顯,對(duì)感官評(píng)價(jià)的影響達(dá)到極顯著水平(p<0.01);發(fā)酵時(shí)間和接種量交互形成的曲面很陡峭,說明發(fā)酵時(shí)間和接種量?jī)梢蛩氐慕换プ饔脤?duì)感官評(píng)價(jià)的影響達(dá)到極顯著水平(p<0.01);白砂糖加量和接種量的坡度很陡峭,說明兩者交互作用對(duì)感官評(píng)價(jià)的影響很大,達(dá)到極顯著水平(p<0.01)。

圖6 菌種比例、接種量、發(fā)酵時(shí)間和白砂糖加量對(duì)感官評(píng)分影響的響應(yīng)面

2.2.4 優(yōu)化發(fā)酵工藝條件的確定及驗(yàn)證 利用Design-Expert 10.0.7 軟件的optimization功能,得到復(fù)合乳酸菌發(fā)酵枸杞的優(yōu)化工藝條件:菌種比例1∶1.2,接種量5.16%,發(fā)酵時(shí)間10.15 h,白砂糖加量5.06%;此發(fā)酵枸杞汁中乳酸含量達(dá)346 mg/100 mL,感官評(píng)分91.76 分。為了驗(yàn)證模型預(yù)測(cè)理論值的準(zhǔn)確性和真實(shí)性,同時(shí)為了方便實(shí)際操作,將最佳發(fā)酵工藝的條件調(diào)整為菌種比例1∶1,接種量5%,發(fā)酵時(shí)間10 h,白砂糖5%,在此優(yōu)化條件下進(jìn)行3次平行試驗(yàn),得到發(fā)酵液中乳酸含量平均值為(342±5.29) mg/100 mL,感官評(píng)分為(92.01±0.45)分,該實(shí)際值和預(yù)測(cè)值大小相近,其他理化指標(biāo)的結(jié)果如表6所示。由表6可知,與發(fā)酵前相比較,發(fā)酵枸杞汁中的乳酸含量增加,蛋白質(zhì)含量減少,總黃酮含量未改變,總糖含量降低。利用最優(yōu)配方配制的復(fù)合乳酸菌發(fā)酵枸杞飲料為紅色,酸甜適口,增強(qiáng)了枸杞的特殊風(fēng)味。因此采用響應(yīng)面法優(yōu)化的復(fù)合乳酸菌發(fā)酵枸杞工藝條件準(zhǔn)確合理,有實(shí)際指導(dǎo)意義。

表6 發(fā)酵結(jié)束后枸杞汁中各項(xiàng)理化指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果Table 6 Determination of physicochemical indexes in Lycium barbarum juice after fermentation

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以枸杞為原料,選腸膜明串珠菌和植物乳桿菌對(duì)發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化。最佳發(fā)酵條件為:菌種比例1∶1,接種量5%,發(fā)酵時(shí)間10 h,白砂糖5%。按照該配方制得的枸杞飲料為桔紅色,色澤明亮,酸甜可口,具有枸杞特有的滋味和芳香。

該飲料的pH4.01,可溶性固形物8%,乳酸342 mg/100 mL,蛋白質(zhì)20 μg/100 mL,總黃酮410 mg/100 mL,總糖124 mg/100 mL,乳酸菌菌落總數(shù)2.1×108CFU/mL,致病菌未檢出。與發(fā)酵前相比較,發(fā)酵枸杞汁中的乳酸含量增加,蛋白質(zhì)含量減少,總黃酮含量未改變,總糖含量降低。綜上所述,本文利用腸膜明串珠菌和植物乳桿菌發(fā)酵枸杞汁,不僅產(chǎn)生大量的乳酸菌，還可以利用枸杞中的各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),產(chǎn)生多種風(fēng)味物質(zhì)和小分子氨基酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。