金線蓮總黃酮提取工藝優(yōu)化及不同月齡、品系金線蓮黃酮含量比較

陳 瑩,張巧云,任 麗,王文義,黃錦芳,張 雪,吳水生

(福建中醫(yī)藥大學藥學院,福建福州 350122)

金線蓮是蘭科植物花葉開唇蘭Anoectochilusroxburghii(Wall.)Lindl.的新鮮或干燥全草,為多年生草本植物,其味甘,性平,具有清熱涼血,祛風利濕等功效,福建、浙江、江西、廣西、廣東等地均有分布,是福建省重點保護野生藥材物種之一,也系閩臺等省的民間珍稀草藥[1]。臨床用于高尿酸血癥,2型糖尿病,慢性乙型肝炎等病癥[2-4]。已有研究表明,金線蓮主要化學成分為多糖、金線蓮苷、黃酮及黃酮苷類、氨基酸、生物堿和有機酸等[2,5-11],其中黃酮類化合物具有清除自由基和抗氧化、抗腫瘤、保護肝臟以及治療糖尿病的作用[12-13],是金線蓮的主要活性成分之一。

隨著人們生活水平的提高,金線蓮的藥用價值和保健作用日益凸顯,市場需求量不斷增加[14]。近年來隨著金線蓮組織培養(yǎng)和人工栽培技術(shù)的成熟,人工選育出適合栽培的尖葉、本地尖葉、本地圓葉、紅霞等品系金線蓮,金線蓮產(chǎn)業(yè)規(guī)模持續(xù)擴大[15]。金線蓮需經(jīng)組織培養(yǎng)4～6個月,轉(zhuǎn)移至大棚馴化壯苗后,再經(jīng)土壤栽培4～6個月甚至更長時間采收。但組織培養(yǎng)金線蓮與栽培金線蓮外觀形態(tài)相近[16],市場上存在金線蓮組培苗直接當成品銷售、同屬植物摻假的現(xiàn)象,嚴重影響金線蓮的產(chǎn)品質(zhì)量。目前尚未合適的質(zhì)量評價體系對組培金線蓮和不同月齡、不同品系金線蓮的品質(zhì)進行評估和區(qū)分,對不同月齡和不同品系金線蓮成分的比較研究鮮有報道。

因此,本實驗以金線蓮主要活性成分總黃酮為檢測指標,應用均勻設(shè)計法優(yōu)化金線蓮總黃酮提取工藝,并應用優(yōu)化的工藝,進一步比較不同月齡和不同品系金線蓮總黃酮的含量,為金線蓮的合理開發(fā)和質(zhì)量評價提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

金線蓮 為組織培養(yǎng)生根階段4個月藥材幼苗,栽培金線蓮為下地種植月齡為1、2、3、4、5、6、7、9、10、13個月的采收品,詳細樣品信息見表1,經(jīng)福建中醫(yī)藥大學藥學院范世明高級實驗師鑒定為蘭科開唇蘭屬花葉開唇蘭Anoectochilusroxburghii(Wall.)Lindl.的新鮮全草;蘆丁 批號100080-201610,購于中國食品藥品檢定研究院;亞硝酸鈉 批號1705032,西隴科學股份有限公司;硝酸鋁 批號20170706,天津市恒興化學試劑制造有限公司;氫氧化鈉 批號G19852B,上海泰坦科技股份有限公司;實驗用水 超純水;其余試劑 均為分析純。

表1 金線蓮樣品信息Table 1 Information of A.roxburghii samples

DV215CD型十萬分之一分析天平 奧豪斯公司OHAUS;DFY-500A粉碎機 上海四瑞儀器有限公司;GT-2120QTS超聲機 廣東固特超聲股份有限公司;TDL-40B 離心機 上海安亭科學儀器廠;DLSB-5/20低溫冷卻循環(huán)泵、SHB-Ⅲ循環(huán)水式真空泵 鄭州長城科工貿(mào)有限公司;RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠;Milli-Q超純水儀 美國MILLIPORE公司;UV-1800紫外可見分光光度計 日本島津公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 黃酮提取工藝 將60 ℃干燥至恒重的金線蓮,粉碎,過60目篩得金線蓮藥材粉末。精密稱取金線蓮粉末0.5000 g,置50 mL具塞三角瓶中,按一定液料比加入一定濃度的乙醇,60 ℃恒溫超聲提取(功率250 W,頻率50 kHz)一定時間,2500 r/min離心7 min,取上清液,提取一定次數(shù),合并上清液,60 ℃真空減壓濃縮至干,加適量無水甲醇復溶并轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中,用無水甲醇定容至刻度,搖勻,作為供試品溶液。

1.2.2 標準曲線繪制 精密稱取蘆丁對照品14.83 mg,置50 mL容量瓶中,加甲醇超聲(功率250 W,頻率50 kHz)2 min溶解后定容至刻度,搖勻,得質(zhì)量濃度為0.2966 mg/mL的蘆丁對照品溶液。精密量取蘆丁對照品溶液0、0.5、1、2、3、4、5、6 mL分別置于25 mL容量瓶中,各加甲醇至6 mL,分別加5%亞硝酸鈉溶液1 mL,搖勻,放置6 min,再加10%硝酸鋁溶液1 mL,搖勻,放置6 min,最后加4% 氫氧化鈉溶液10 mL,混勻,甲醇定容至刻度,放置15 min,以不加蘆丁的試劑為空白對照,在UV-1800紫外可見分光光度計下進行200～800 nm全波長掃描,在最大吸收波長下測定吸光度。以濃度(X)為橫坐標,以吸光度(Y)為縱坐標,建立標準曲線,得線性回歸方程,相關(guān)系數(shù)和線性范圍。

1.2.3 金線蓮總黃酮得率測定 精密吸取供試品溶液5 mL,置25 mL容量瓶中,按“1.2.2”項下方法,自“加5%亞硝酸鈉溶液1 mL”起,以不加樣品溶液的試劑為空白對照,依法測定吸光度。結(jié)合“1.2.2”項線性回歸方程和公式(1)計算總黃酮得率。

式(1)

式中,c:回歸方程計算所得提取液總黃酮濃度,mg/mL;m:稱取的樣品粉末質(zhì)量,g。

1.2.4 方法學考察

1.2.4.1 精密度實驗 精密量取2 mL質(zhì)量濃度為0.2966 mg/mL的蘆丁標準品溶液,置于25 mL容量瓶中,按“1.2.3”項下方法平行測定5次吸光度。

1.2.4.2 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液(編號:S25)分別于0、0.5、1、2和3 h,按“1.2.3”項下方法測定吸光度。

1.2.4.3 重復性試驗 精密稱取同一批金線蓮(編號:S25)樣品6份,按實驗優(yōu)化的方法制備供試品溶液,按“1.2.3”項下方法測定吸光度。

1.2.4.4 加樣回收實驗 精密稱取“1.2.4.3”項已知含量的金線蓮粉末(編號:S25),每份0.5000 g,共5份,精密稱定,分別精密加入已知樣品含量的100%的蘆丁對照品,按優(yōu)化的提取工藝制備供試品溶液,按“1.2.3”項下方法測定吸光度,計算總黃酮含量。

1.2.5 單因素實驗 以總黃酮得率為指標,通過預實驗,對提取方法(回流提取和超聲提取)、提取溶劑(水、乙醇、甲醇)進行考察。按張秀才等[17]優(yōu)化的金線蓮總黃酮回流提取工藝(20倍量的95%乙醇回流提取3次,每次90 min)和按同樣工藝超聲提取的金線蓮總黃酮得率結(jié)果差別不大,超聲提取法在保證提取效率的前提下,操作方法更簡便,所以本實驗選擇超聲提取法。提取溶劑考察結(jié)果顯示樣品水提取液總黃酮得率最低,而乙醇和甲醇提取液總黃酮得率接近,考慮乙醇相對于甲醇價格低,無毒性,故選擇乙醇為提取溶劑。

精密稱取金線蓮粉末(編號:S25)若干份于50 mL具塞三角瓶中,每份0.5000 g,以總黃酮得率為指標,按“1.2.1”項方法,固定提取溫度60 ℃,超聲提取功率250 W,提取1次,依次改變乙醇濃度、液料比、提取時間進行單因素考察。實驗方法如下:乙醇濃度:按液料比40∶1 mL/g分別加入濃度為50%、60%、70%、80%、90%、95%的乙醇溶液,超聲提取30 min;液料比:分別按液料比10∶1、15∶1、20∶1、30∶1、40∶1、60∶1 mL/g加入95%乙醇,超聲提取30 min;提取時間:按液料比40∶1 mL/g分別加入95%乙醇溶液,分別超聲提取20、30、40、60、70、90 min。

1.2.6 均勻設(shè)計法優(yōu)化總黃酮提取工藝 已有研究[17-19]表明提取次數(shù)也是影響金線蓮總黃酮提取率的主要因素之一,參考已有研究文獻選擇提取次數(shù)考察水平范圍為1～3次。以乙醇濃度(X1)、液料比(X2)、提取時間(X3)和提取次數(shù)(X4)作為考察因素,以總黃酮得率(Y)為評價指標,每個因素在單因素考察確定的水平范圍內(nèi)各設(shè)8個水平,通過DPS14.50軟件設(shè)計U8(84)均勻設(shè)計試驗方案,該均勻設(shè)計表的中心化偏差CD=0.1533。精密稱取金線蓮粉末(編號:S25),每份0.5000 g,按均勻設(shè)計實驗方案提取樣品,按“1.2.3”項下方法測定吸光度,計算總黃酮得率,每組試驗重復3次。

1.2.7 不同品系、不同月齡金線蓮總黃酮含量測定 分別精密稱取不同品系、不同月齡金線蓮樣品粉末0.5000 g,按“1.2.1”項方法,按優(yōu)化的提取工藝制備供試品溶液,測定吸光度,計算總黃酮含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用DPS 14.50軟件設(shè)計實驗方案、構(gòu)建模型和統(tǒng)計分析,應用SPSS 20.0軟件和Excel處理數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 最大吸收波長的確定

蘆丁標準溶液在紫外可見分光光度計下波長掃描結(jié)果如圖1所示,結(jié)果顯示,其在450～550 nm之間有一個最大吸收峰,510 nm為最大吸收波長,此處最大吸收峰與蘆丁質(zhì)量濃度有良好的響應關(guān)系。

圖1 蘆丁標準溶液吸收曲線

2.2 標準曲線繪制

計算得金線蓮總黃酮線性回歸方程為Y=12.0966 X-0.0098(r=0.9999),結(jié)果表明金線蓮總黃酮在0.0578～0.0712 mg/mL內(nèi)線性良好。

2.3 方法學考察結(jié)果

2.3.1 精密度實驗 計算結(jié)果顯示金線蓮總黃酮吸光度的RSD值為0.21%,表明儀器的精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗 計算結(jié)果顯示被測物吸光度RSD值為2.33%,表明供試液在3 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.3 重復性試驗 計算結(jié)果顯示金線蓮總黃酮質(zhì)量濃度的RSD為1.66%,表明該法重復性良好。

2.3.4 加樣回收實驗 結(jié)果顯示,總黃酮平均加樣回收率為97.71%,RSD為3.20%,表明金線蓮總黃酮的加樣回收率良好。

2.4 單因素實驗結(jié)果分析

2.4.1 乙醇濃度對總黃酮得率影響 由圖2可知,乙醇濃度小于90%時,總黃酮得率隨著乙醇濃度的升高而逐漸增加,當乙醇濃度大于90%時,得率呈下降趨勢。其原因可能為總黃酮包括黃酮及其苷類化合物,在乙醇濃度較低時,溶劑極性較大,根據(jù)相似相溶的原理,親水性的黃酮醇苷類物質(zhì)先溶出;隨著乙醇濃度逐漸提高,溶劑極性逐漸降低,疏水性的黃酮類化合物逐漸溶出;當乙醇濃度達90%后,樣品中其他脂溶性化合物競爭性溶出[20],導致黃酮類化合物溶出度反而降低。綜上選擇乙醇濃度為85%～95%為考察水平范圍。

圖2 乙醇濃度對總黃酮得率的影響

2.4.2 液料比對總黃酮得率影響 由圖3可知,總黃酮得率隨著液料比的升高,先升高后下降,在液料比為30∶1 mL/g時達到最高值。可能原因是隨著溶劑用量的增大,樣品粉末顆粒與溶劑接觸面的濃度差增加,隨著滲透壓的增大,黃酮類成分溶出率隨之增加,并達到峰值;當液料比超過30∶1 mL/g時,總黃酮得率下降可能與雜質(zhì)成分溶出率增加有關(guān)[21]。同時考慮節(jié)約溶劑用量,又能達到較高的提取率,故選擇液料比為20∶1～40∶1 mL/g為考察水平范圍。

圖3 液料比對總黃酮得率的影響

2.4.3 提取時間對總黃酮得率影響 由圖4可知，隨著提取時間的升高,總黃酮得率逐漸升高,90 min時達到最高值,并趨于平穩(wěn)。可能因為超聲波的空化作用加速植物細胞內(nèi)黃酮類化合物的浸出[22],隨著提取時間的增加,黃酮類化合物的浸出達到最高值,并趨于動態(tài)平衡。提取70 min與提取90 min總黃酮得率均大于1.3%，趨近于1.4%,考慮到在保證提取效率的基礎(chǔ)上又能節(jié)省提取時間,因此選擇70～90 min中間值80 min為提取時間最高考察水平， 40 min為最低考察水平，即選擇40～80 min為提取時間考察水平范圍。

圖4 提取時間對總黃酮提取率的影響

2.5 均勻設(shè)計優(yōu)化金線蓮總黃酮提取工藝試驗結(jié)果

基于上述單因素實驗結(jié)果,通過DPS14.50軟件設(shè)計4因素8水平的均勻試驗,均勻試驗設(shè)計方案與結(jié)果見表2。

表2 均勻試驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Design and results of uniform

表3 擬合回歸結(jié)果Table 3 Fitting regression results

表4 方差分析Table 4 Analysis of variance

2.5.2 工藝優(yōu)化驗證 精密稱取金線蓮(編號:S25)粉末0.5000 g,共3份,按優(yōu)化的提取工藝條件進行驗證實驗。金線蓮總黃酮得率分別為1.643%、1.645%、1.715%,平均得率為1.68%(RSD=0.27%,n=3),與預測值的相對誤差為8.2%,表明實測值與回歸方程預測接近,優(yōu)化后的提取工藝條件可靠,結(jié)果重現(xiàn)性好。

2.6 金線蓮總黃酮含量測定結(jié)果

南靖產(chǎn)尖葉、本地圓葉、本地野生品系金線蓮0～4月齡總黃酮含量見圖5,以及大圓葉、紅霞、本地尖葉品系金線蓮0～5月齡總黃酮含量見圖6。仙游產(chǎn)4～13月齡金線蓮尖葉品總黃酮含量見圖7。

圖5 1～4月齡不同品系金線蓮總黃酮含量比較

圖6 1～5月齡不同品系金線蓮總黃酮含量比較

圖7 4～13月齡金線蓮尖葉品總黃酮含量比較

由圖5和圖6可知,南靖產(chǎn)不同品系金線蓮總黃酮含量有一定差異,尖葉金線蓮總黃酮含量在種植2月下降,之后隨著栽培月齡的增加而增加;本地圓葉和本地野生金線蓮在3月齡總黃酮含量較低,4月齡達到高值;大圓葉、紅霞和本地尖葉金線蓮總黃酮含量均在2月齡較低,之后隨著栽培月齡的增加逐漸升高,在5月齡達到高值。栽培4月齡的金線蓮總黃酮含量由高到低為:大圓葉>尖葉>紅霞>本地尖葉>本地圓葉>本地野生;栽培5月齡金線蓮總黃酮含量由高到低為:大圓葉>本地尖葉>紅霞,其中本地尖葉和紅霞總黃酮含量較接近。組培金線蓮總黃酮含量為9.270～12.963 mg/g,栽培4月齡金線蓮總黃酮含量為11.572～17.521 mg/g,說明金線蓮總黃酮含量與品系和栽培月齡有關(guān)。由圖7可知,仙游產(chǎn)尖葉金線蓮在栽培4～7月齡,總黃酮含量先增加后降低,在5月齡達到最高值,可能與金線蓮中黃酮及其苷類成分的合成、分解轉(zhuǎn)化有關(guān);在栽培7～13月齡,尖葉金線蓮總黃酮含量在10月齡前呈上升趨勢,在10月齡達到最高值,在10月齡后呈降低趨勢,其原因可能是栽培10月以上金線蓮進入花期,黃酮類等次生代謝產(chǎn)物累積降低。總體上,金線蓮尖葉品總黃酮含量在5月齡和10月齡均達到19 mg/g以上,說明金線蓮總黃酮含量與栽培月齡不是簡單的線性正相關(guān),組培金線蓮經(jīng)土壤種植其次級代謝產(chǎn)物總黃酮含量呈逐漸累積狀態(tài),在5月齡達到最高值。

3 討論

3.1 金線蓮總黃酮提取工藝優(yōu)化

目前已有正交試驗[18]、響應面法[23]優(yōu)化金線蓮總黃酮提取工藝的報道,但未見均勻設(shè)計在金線蓮總黃酮提取工藝優(yōu)化的應用報道。均勻設(shè)計將實驗點在高維空間內(nèi)充分均勻分布,使實驗點具有更好代表性,適用于因素和水平較多的試驗[24],相對于正交等試驗設(shè)計法需要較少的試驗次數(shù)就能獲得更多信息,且能反映各因素間的交互作用,在水平范圍較大的情況具有明顯的優(yōu)越性。本實驗以總黃酮得率為指標,在預實驗的基礎(chǔ)上優(yōu)選超聲提取法和乙醇為提取溶劑,通過單因素考察乙醇濃度、液料比、提取時間確定因素水平范圍,對均勻試驗結(jié)果進行偏最小二乘二次多項式回歸(PLS)和二次多項式逐步回歸建模統(tǒng)計分析,優(yōu)選二次多項式逐步回歸模型對金線蓮總黃酮提取工藝的擬合結(jié)果,結(jié)果表明乙醇濃度和提取次數(shù)、液料比和提取時間存在交互作用,擬合值與實驗值接近,方差分析p<0.05,具有統(tǒng)計學意義。故本實驗優(yōu)化的金線蓮總黃酮超聲提取工藝方法穩(wěn)定、可靠,為金線蓮的總黃酮含量測定和開發(fā)利用提供參考。

3.2 不同月齡、不同品系金線蓮總黃酮含量比較分析

40批次金線蓮總黃酮含量均符合《地理標志產(chǎn)品永安金線蓮》(DB35/T 13882013)黃酮含量不低于0.8%(8.0 mg/g)的規(guī)定。但組培金線蓮和不同月齡栽培金線蓮總黃酮含量存在差異,各品系組培金線蓮總黃酮平均含量為11.091 mg/g,栽培4月齡和5月齡各品系金線蓮總黃酮平均含量分別為14.359和18.730 mg/g,說明土壤栽培有利于金線蓮次級代謝產(chǎn)物黃酮類化合物的積累[15-16]。此外,同月齡不同品系金線蓮總黃酮含量存在一定差異,表現(xiàn)為栽培4月齡大圓葉、尖葉和紅霞品系金線蓮總黃酮含量較高,均在16 mg/g以上,且5月齡大圓葉和尖葉金線蓮總黃酮含量最高,均達20 mg/g以上。比較栽培4月齡以上金線蓮尖葉品總黃酮含量,結(jié)果表明栽培5月齡和10月齡金線蓮總黃酮含量均能達到最高值,但金線蓮每年10月期間開花,開花后藥用價值降低,因此綜合考慮金線蓮品質(zhì)和經(jīng)濟效益,建議栽培大圓葉、尖葉、紅霞和本地尖葉品系金線蓮[25],栽培5月可采收。

4 結(jié)論

本實驗應用單因素結(jié)合均勻設(shè)計法優(yōu)化金線蓮總黃酮提取工藝,優(yōu)化最佳的工藝為乙醇濃度88%、液料比為40∶1 mL/g、超聲提取時間80 min、提取3次。總黃酮含量測定結(jié)果表明,金線蓮總黃酮含量與品系和栽培月齡有關(guān),組培金線蓮和栽培金線蓮總黃酮含量存在差異,已有研究也表明土壤栽培金線蓮黃酮類等成分[16]和微量元素含量[25]均比組培金線蓮高,土壤栽培有利于金線蓮有效成分的積累,因此組培金線蓮經(jīng)土壤栽培是必要的。總黃酮是金線蓮的主要有效成分之一,但不能用于區(qū)分組培金線蓮和不同栽培月齡金線蓮,應結(jié)合多成分及特征指紋圖譜進一步對不同月齡金線品質(zhì)進行研究。