木犀草素固體分散體的制備和優化

吳 春,陳金慧

(哈爾濱商業大學食品工程學院,黑龍江哈爾濱 150076)

木犀草素是一種極具代表性的黃酮類化合物,在自然界分布廣泛[1]。具有抗氧化、消炎、抗癌、增強免疫、抗腫瘤、鎮咳、祛痰、保護神經系統等多種生理功能[2-4],木犀草素曾被報道可用于食品防腐[5],更被國外確認為是一種法律允許的食品色素[6],其豐富的生理功能吸引了眾多學者的研究及重視,但其水溶性差的缺點在很大程度上限制了它的應用。

固體分散體(SD)是指原料(粒徑0.001～0.1 μm)以一定狀態均勻分散于載體中形成的一種分散體系,具有明顯改善難溶性原料的溶出速率與溶解度、提高活性物質的生物利用度或減少不良反應、實現復方多組分的同步釋放、延緩活性物質的水解和氧化、掩蓋不良氣味、提高原料的穩定性的優點,且制備方法較為簡便[7]。本研究選擇將木犀草素制備為目前尚無報道的木犀草素固體分散體,并采用響應曲面分析法優化其最佳制備工藝,以改善木犀草素的水溶性,提高其生物利用率。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

木犀草素(98%) 寧波德康生物制品有限公司;大豆卵磷脂(98%)、PVP K30(99%) 天津市光復精細化工研究所;無水乙醇(分析純) 天津市百世化工有限公司;三氯甲烷(分析純) 上海浦順進出口有限公司;異丙酮(分析純) 天津市新精細化工開發中心。

FA2004N型電子天平 上海精密科學儀器有限公司;UV-5100B型紫外分光光度計 上海元析儀器有限公司;DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鞏義市予華儀器有限責任公司;HZS-H型恒溫水浴振蕩器 哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司;DHG-9123A型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海一恒科學有限公司;HH.S11-2數顯式恒溫水浴鍋 天津市歐諾儀表有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 木犀草素固體分散體的制備 將一定量的木犀草素溶于無水乙醇,充分溶解后形成澄清透明的乙醇相溶液。另取適量比例的載體PVP K30于水浴鍋充分熔融。再將乙醇相溶液與PVP K30混合,通過磁力攪拌將木犀草素、PVP K30、無水乙醇充分融合。水浴蒸發除去無水乙醇后,真空干燥得到微黃色固體,即為木犀草素固體分散體[8-9]。

1.2.2 標準曲線的繪制 精確稱取0.005 g 木犀草素標準品,以無水乙醇定容于50 mL容量瓶,搖勻,準確吸取該木犀草素-乙醇標準液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL,無水乙醇定容至10 mL,得到系列濃度梯度的木犀草素工作液。以無水乙醇作為空白樣,于353 nm(木犀草素的最大吸收波長)處分別測OD值繪制標準曲線。

1.2.3 累積溶出度的測定 室溫下,將磁力攪拌器轉速調整至100 r/min,以蒸餾水為溶出介質(溶出介質溫度恒定在37±5 ℃)。取木犀草素固體分散體置于溶出杯中,接觸介質溶出時開始轉動并記錄時間,分別于5、10、15、20、25、30 min時取樣10 mL(并及時補加10 mL等溫蒸餾水),經0.45 μm微孔濾膜濾過,取澄清濾液,于353 nm波長處測定吸光度,結合公式與標準曲線回歸方程,求得累積溶出度,并繪制溶出曲線。

式(1)

式(2)

式中:n:溶出木犀草素的總物質的量,mol;m:木犀草素固體分散體的投入量,mg;V為溶出介質體積,mL;Ci為取樣時間點處木犀草素的濃度,mg/mL;Vi為取樣體積,mL。

1.2.4 載體的選擇 在其他制備因素相同的條件下(原料用量35 mg、原料-載體質量比3∶1、乙醇體積分數50%、制備時間20 min、制備溫度50 ℃),分別以PVP K30、PEG 6000、PEG 8000、PEG 10000為載體,制備木犀草素固體分散體,測定并計算其累積溶出度。

1.2.4.1 單因素實驗 以累積溶出度為評價指標,通過測定木犀草素在不同溶出時間下的溶出度,分別考察原料用量、載體與原料比例(質量比)、乙醇體積分數、制備時間及制備溫度對固體分散體溶出度的影響,確定最佳制備工藝。

1.2.4.2 最佳原料用量的確定 以PVP K30為載體,在載體與原料比例3∶1、無水乙醇、制備時間30 min、制備溫度60 ℃的條件下,分別制備木犀草素用量30、35、40、45、50 mg的固體分散體,測定并計算其累積溶出度。

1.2.4.3 最佳載體與原料比例的確定 以PVP K30為載體,在原料用量40 mg、無水乙醇、制備時間30 min、制備溫度60 ℃的條件下,分別制備載體與原料比例1∶1、3∶1、5∶1、7∶1、9∶1的固體分散體,測定并計算其累積溶出度。

1.2.4.4 乙醇體積分數的確定 以PVP K30為載體,在原料用量40 mg、載體與原料比例7∶1、制備時間30 min、制備溫度60 ℃的條件下,分別制備乙醇體積分數50%、60%、70%、80%、90%的固體分散體,測定并計算其累積溶出度。

1.2.4.5 最佳制備時間的確定 以PVP K30為載體,在原料用量40 mg、載體與原料比例7∶1、乙醇體積分數80%、制備溫度為60 ℃的條件下,分別制備反應時間20、25、30、35、40 min的固體分散體,測定并計算其累積溶出度。

1.2.4.6 最佳制備溫度的確定 以PVP K30為載體,在原料用量40 mg、載體與原料比例7∶1、乙醇體積分數80%、制備時間為30 min的條件下,分別制備反應溫度50、60、70、80、90 ℃的固體分散體,測定并計算其累積溶出度。

1.2.5 Box-Behnken響應面優化實驗 根據單因素實驗及Box-Behnken中心組合設計原理,選取原料用量、載體與原料比例、制備時間、制備溫度四個單因素與木犀草素固體分散體累積溶出度進行響應面優化設計實驗。Box-Behnken試驗因素水平見表1[10-11]。

表1 響應曲面因素水平表Table 1 Analytical factors and levels of response surface methodology

1.3 數據處理

每次實驗重復操作三次,取平均值,計算標準誤差并制圖分析。根據Design-Expert 8.05b軟件進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的繪制

以木犀草素標準品濃度(μg/mL)為橫坐標,吸光度為縱坐標繪制標準曲線,得到回歸方程y=0.0414x+0.0511,相關系數R2=0.999。

圖1 木犀草素標準曲線

2.2 載體的選擇

由圖2可見,載體種類對固體分散體的累積溶出度的影響較大,累積溶出度從大到小的順序依次為:PVP K30>PEG 10000>PEG 8000>PEG 6000,其中,以PEG為載體時,相對分子質量較高的載體更利于固體分散體的溶出,但三者效果均弱于PVP K30,故本實驗選擇PVP K30作載體制備木犀草素固體分散體。

圖2 不同載體對累積溶出度的影響

2.3 單因素實驗結果

2.3.1 原料用量對累積溶出度的影響 由圖3中的累積溶出度曲線可見,五條梯度曲線在0～5 min時上升趨勢較快,5 min后,溶出的速率較為平緩,說明載體包被的原料在5 min內的溶出量較大,5 min之后剩余的原料漸漸從體系中溶出。隨著木犀草素用量的增加,木犀草素固體分散體的累積溶出度差異較大。原料用量為30 mg時,木犀草素固體分散體在30 min的累積溶出度為37.28%,當木犀草素用量為40 mg時,30 min的累積溶出度達到最大值54.01%,根據累積溶出度,選擇原料用量35～45 mg作為響應曲面實驗參數范圍。

圖3 木犀草素用量對累積溶出度的影響

2.3.2 載體與原料比例對累積溶出度的影響 由圖4中的累積溶出度曲線可見,載體與原料比例的變化對木犀草素固體分散體的溶出度有明顯影響。當載體與原料比例為1∶1時,木犀草素固體分散體在30 min的累積溶出度為33.07%,隨著載體在體系中所占比例的增加,當載體與原料比例為7∶1時,溶出度達最佳狀態,繼續增加載體在體系中所占比例時,溶出度呈下降趨勢,可能是由于木犀草素已能夠充分分散在載體中,且當載體在體系中所占比例過高時，有效作用被削弱,根據實驗結果,選擇載體與原料比例5∶1～9∶1作為響應曲面實驗參數范圍。

圖4 載體與原料比例對累積溶出度的影響

2.3.3 乙醇體積分數對累積溶出度的影響 由圖5中的累積溶出度曲線可見,乙醇體積分數的變化對木犀草素固體分散體溶出度的影響較小,但仍可看出,隨著體積分數的增加,溶出度呈現先增加后下降的趨勢,當乙醇體積分數為80%時,溶出度達到最佳狀態。故選擇體積分數80%的乙醇進行實驗。

圖5 乙醇體積分數對累積溶出度的影響

2.3.4 制備時間對累積溶出度的影響 由圖6中的累積溶出度曲線可見,隨著制備時間的增長,木犀草素固體分散體的溶出度呈現先增加后降低的趨勢。當制備時間為30 min時,溶出度達到最大值,繼續增加制備時間,溶出度開始下降,表明當制備時間為30 min時,木犀草素與載體已能夠達到充分反應的狀態,繼續增加制備時間使原料與載體之間的平衡狀態受到破壞,導致溶出度下降。因此,根據累積溶出度,選擇制備時間25～35 min作為響應曲面實驗參數范圍。

圖6 制備時間對累積溶出度的影響

2.3.5 制備溫度對累積溶出度的影響 由圖7中的累積溶出度曲線可見,隨著制備溫度的升高,木犀草素固體分散體的累積溶出度隨之增大,溫度過低不利于木犀草素固體分散體的制備,當制備溫度升高至70 ℃時累積溶出度達到最佳值,繼續升高制備溫度,體系中的乙醇損失過快,固體分散體的制備受到影響,累積溶出度呈下降趨勢。因此,根據累積溶出度,選擇制備溫度60～80 ℃作為響應曲面實驗參數范圍。

圖7 制備溫度對累積溶出度的影響

2.4 響應曲面實驗結果分析

2.4.1 響應面實驗數據 以單因素實驗結果為基礎,根據 Box-Behnken 中心組合實驗設計原理,選擇以原料用量、載體與原料比例、制備溫度、制備時間為主要影響因素,以木犀草素固體分散體的累積溶出度為響應值(Y),設計四因素三水平(共29個實驗點)的響應面分析實驗。實驗方案及結果見表2。

表2 Box-Behnken試驗方案及響應值Table 2 Box-Behnken test scheme and response value

利用Design Expert 軟件,對表2中木犀草素固體分散體累積溶出度的數據進行多元回歸擬合,得到回歸方程:Y(%)=83.71-1.40A+2.56B+1.56C1.00D-1.45AB-2.90AC-2.33AD+2.60BC+3.51BD-1.33CD-9.67A2-16.59B2-6.52C2-7.25D2

表3 回歸模型的方差分析表Table 3 Variance analysis table of regression model

2.4.2 響應面分析 根據響應曲面軟件分析得到的具有一定顯著性的各因素的響應面圖以及等高線圖見圖8。響應面圖是響應值對各實驗因素所構成的三維空間曲面圖,可直觀的反應各因素的交互作用[15]。如果一個響應曲面坡度相對平緩,表明其可以忍受處理條件的變異,而不影響到響應值的大小相反,如果一個響應曲面坡爬非常陡峭,表明響應值對于處理條件的改變非常敏感[16]。由等高線中心位置向邊緣延伸,表示累積溶出度逐漸降低,中心位置表示累積溶出度最高。分析圖8e可得出,載體與原料比例與制備溫度的交互作用顯著,且載體與原料比例曲面坡度較陡峭,固定其他因素不變,改變載體與原料比例對累計溶出度的影響更大,同理,固定其他因素不變,改變載體與原料比例對累計溶出度的影響比改變原料用量及制備溫度大,與二元回歸方程系數相吻合。等高線的形狀越趨于圓形,表明兩因素的交互作用不顯著,越趨于橢圓形,則交互作用越顯著,趨于橢圓形,且橢圓與兩軸之間形成一定的角度,則交互作用高度顯著[17-19],分析上述響應面,各交互作用等高線圖均趨于橢圓形,因此交互作用極顯著,各交互作用的等高線圖均不與兩軸成一定角度,因此不存在交互作用高度顯著項,這與方差表結果一致。

圖8 各因素交互作用響應面及等高線

2.5 驗證實驗

通過軟件分析及擬合方程計算得到最佳實驗條件為:原料用量39.43 mg,載體與原料比例3∶20,制備時間30.78 min,制備溫度70.98 ℃,此時溶出度達86.10%。考慮到實際操作的便利性,將最佳實驗參數修正為:原料用量39.5 mg、載體與原料比例7∶1,制備時間31 min,制備溫度80 ℃,進行三次平行試驗,最終得到溶出率為84.72%。

3 結論

木犀草素具備黃酮類化合物的一系列生物活性,在食品及藥學領域均有著廣泛的開發利用前景,本研究針對木犀草素水溶性差的缺點,將其進行改性并以優化木犀草素固體分散體制備條件為目的,通過響應面分析得到最佳工藝參數:原料用量39.5 mg、載體與原料比例7∶1,制備時間31 min,制備溫度80 ℃,此條件下制備的木犀草素固體分散體的累積溶出度達84.72%。目前,尚鮮有關于木犀草素固體分散體的相關報道,本文的實驗結果可為木犀草素在更多領域的開發及利用提供可行性依據。