白肉番石榴總黃酮提取工藝優化及體外抗氧化活性分析

張婉君,馮 彬,謝筆鈞,孫智達

(華中農業大學食品科技學院,湖北武漢 430070)

番石榴(PsidiumguajavaL.),又稱為芭樂,俗名雞矢果、撥子,是一種熱帶水果。原產于美洲熱帶,現在在全球廣泛分布,全球最大的生產國家是印度,其次是中國和泰國。根據果肉的顏色可以將其分為紅肉及白肉番石榴兩大類。紅肉番石榴多為野生,白肉番石榴為人工選育栽培的新品種。其中珍珠番石榴更是白肉番石榴中的優等品種,是支持南方農業經濟的大宗水果之一[1]。根據我國藥典記載,番石榴葉、皮具有開胃消食、止瀉通便、收斂、止癢、提高機體免疫力、消炎、治療糖尿病、保肝護肝等多重功效[2]。研究發現番石榴中含有維生素A、B、C以及鈣、磷、鉀、鐵等元素[3-5]。番石榴中還含有多種活性成分,主要有黃酮、類胡蘿卜素、揮發油、萜類和三萜等。其中黃酮是番石榴中重要的生物活性成分,具有良好的抑菌、抗氧化、抗腫瘤等功效。

目前對番石榴黃酮研究主要集中在紅肉品種的葉及全果上,關于白肉品種番石榴研究較少。且研究局限于番石榴的單一部位,對于番石榴不同部位的黃酮提取及抗氧化活性的比較幾乎為零,而使皮、果肉等其他部位黃酮物質被忽略[6-8]。

因此,本研究將選用珍珠番石榴(白肉)為原料,而其中番石榴葉及番石榴皮為工業生產的副產物,并且黃酮含量較高,具有進行提取工藝優化的價值,則對番石榴葉、皮中的總黃酮進行提取工藝優化。再對番石榴果肉總黃酮進行提取,探討番石榴葉、皮、果肉中黃酮的體外抗氧化活性差異,以增加番石榴不同組成部分的綜合利用價值,同時為開發天然的抗氧化劑提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

珍珠番石榴(白肉) 購自廣東珠海;2,2-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)、水溶性維生素C Sigma公司;蘆丁等 國產分析純。

EL104電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;UV2100紫外可見分光光度計尤尼柯(上海)儀器有限公司;DK-98-ⅡA電熱恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司;KX-100型高速多功能粉碎機 浙江武義鼎藏日用金屬制品廠;5084高速冷凍離心機 德國艾本德。

1.2 實驗方法

1.2.1 番石榴總黃酮的提取 番石榴葉的預處理:將番石榴葉置于溫度為40 ℃的烘箱中烘干直至恒重,粉碎至60目于干燥器內保存。番石榴果皮的預處理:將番石榴的果皮使用液氮低溫研磨成粉放置在-20 ℃下保存。分別準確稱取1.0 g番石榴葉、皮粉末,按照一定的料液比加入一定濃度的乙醇溶液,在一定的設定溫度下水浴浸提一定的時間。常溫條件下以5000 r/min離心5 min,收集上清液,使用一定體積分數的乙醇溶液定容至50 mL棕色容量瓶中。

1.2.2 單因素實驗

1.2.2.1 乙醇濃度對總黃酮提取量的影響 設定料液比為1∶5 (g/mL),提取溫度為40 ℃,提取時間為60 min,考察乙醇濃度為20%、40%、60%、80%、100%時對番石榴葉、皮總黃酮提取量的影響。

1.2.2.2 提取溫度對總黃酮提取量的影響 設定乙醇濃度為60%,料液比為1∶5 (g/mL),提取時間為60 min,考察提取溫度為40、50、60、70、80 ℃時對番石榴葉、皮總黃酮提取量的影響。

1.2.2.3 料液比對總黃酮提取量的影響 設定乙醇濃度為60%,提取溫度為60 ℃,提取時間為60 min,考察料液比1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25 (g/mL)對番石榴葉總黃酮提取量的影響。

設定乙醇濃度為60%,提取溫度為50 ℃,提取時間為60 min,考察料液比1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25 (g/mL)對番石榴皮總黃酮提取量的影響。

1.2.2.4 提取時間對總黃酮提取量的影響 設定乙醇濃度為60%,料液比為1∶20 (g/mL),提取溫度為60 ℃,考察提取時間為60、90、120、150、180 min對番石榴葉總黃酮提取量的影響。

設定乙醇濃度為60%,料液比為1∶10 (g/mL),提取溫度為50 ℃,考察提取時間為60、90、120、150、180 min對番石榴皮總黃酮提取量的影響。

1.2.3 正交實驗 根據單因素實驗結果,進行正交試驗設計,優化番石榴葉、皮黃酮的提取工藝。

表1 番石榴葉總黃酮正交實驗因素水平設計Table 1 Factors and levels of orthogonal test of total flavonoids from guava leaves

表2 番石榴皮黃酮正交實驗因素水平設計Table 2 Factors and levels of orthogonal test of total flavonoids from guava peel

1.2.4 總黃酮含量的測定 采用硝酸鋁比色法測定總黃酮含量[9]。吸取0.8 mL番石榴葉、皮總黃酮提取液于10 mL具塞試管中,加入0.4 mL 5% NaNO2,混勻后常溫放置5 min,再加入0.4 mL 10%的Al(NO3)3,混勻常溫放置5 min,后加入2 mL 4%的NaOH,混勻常溫放置10 min后用70%乙醇溶液定容至5 mL。于510 nm處測定吸光值。另以0.2～0.8 mg/mL的蘆丁標準液代替樣品繪制標準曲線,線性回歸方程為:y=0.8126x-0.0037(R2=0.9998),根據標準曲線計算得到番石榴葉、皮中總黃酮含量(mg/mL)。

1.2.5 黃酮提取量的計算 根據以下公式計算番石榴葉、皮總黃酮的提取量。

式中:C為根據標準曲線計算出的黃酮的質量濃度(mg/mL);V1為測定時的定容體積(mL);V2為提取液定容體積(mL);M為稱取的樣品質量(g);V0為用于測定的提取液體積(mL)。

1.2.6 番石榴葉、皮、果肉總黃酮體外抗氧化活性測定 根據單因素正交結果得出的最優總黃酮提取條件分別對番石榴葉、皮中的總黃酮進行提取。參照番石榴皮的處理及總黃酮的提取方式對番石榴果肉進行預處理并對總黃酮進行提取。使用體積分數為60%、50%、50%的乙醇溶液分別對番石榴葉、皮、果肉總黃酮溶液進行稀釋,得到不同濃度的黃酮提取液。

1.2.6.1 清除ABTS自由基能力的測定 參照白海娜等的方法,并作部分修改[10]。ABTS原液可與過硫酸鉀溶液反應生成ABTS+·,供氫抗氧化劑具有清除ABTS+·的作用。分別取0.2 mL不同濃度的番石榴葉、皮、果肉黃酮溶液與2.4 mL ABTS+·工作液混合避光反應10 min,在734 nm處測定吸光度。空白組以樣品溶劑(70%乙醇)代替樣品液,對照組以蒸餾水代替ABTS+·工作液。并以VC作為參照比較效果。按以下公式計算ABTS+·清除率:

式中:A-樣品組吸光值;A0-空白組吸光值;A1-對照組吸光值。

ABTS+·工作液的獲取:將7 mmol/mL的ABTS原液與2.45 mmol/mL的過硫酸鉀溶液等體積混合,常溫避光反應12～16 h。使用前用蒸餾水稀釋ABTS+·溶液使其在734 nm處的吸光值為0.70±0.02,得到ABTS+·工作液。

1.2.6.2 清除羥基自由基能力的測定 當H2O2與FeSO4混合反應,會產生·OH。水楊酸的加入可結合·OH產生在510 nm處有特殊吸收的2,3-二羥基苯甲酸。若向以上反應體系中加入具有清除羥基自由基的抗氧化劑,就會減少有色化合物的產生,降低體系吸光值[11]。本實驗利用以上原理使用水楊酸法評估樣品清除羥基自由基的能力并與VC對比。在10 mL具塞試管中分別加入2 mL不同濃度的番石榴葉、皮、果肉黃酮溶液,然后加入2 mL 6 mmol/L的FeSO4溶液,再與2 mL 6 mmol/L的H2O2混合,搖勻常溫靜置10 min。之后加入6 mmol/L的水楊酸溶液2 mL,搖勻常溫靜置30 min。于510 nm處測定吸光值。空白組以樣品溶劑代替樣品溶液。對照組以蒸餾水代替H2O2。按以下公式計算羥基自由基清除率:

式中:A-樣品組吸光值;A0-空白組吸光值;A1-對照組吸光值。

1.2.6.3 鐵還原能力的測定 抗氧化劑可將鐵氰化鉀還原為亞鐵氰化鉀,亞鐵氰化鉀再與三氯化鐵反應可產生普魯士藍(Fe4[Fe(CN)6]3),此物質在700 nm處有最大吸收[12]。因此可通過以上反應原理測定樣品的還原能力大小,并以VC為參照比較效果。分別取2.5 mL不同濃度的番石榴葉、皮、果肉黃酮溶液與2.5 mL的磷酸緩沖液(NaH2PO4與Na2HPO4,0.2 mol/L,pH=6.6)混合,并加入2.5 mL 1%的鐵氰化鉀溶液,充分混勻后在50 ℃條件下水浴20 min,快速冷卻后加入2.5 mL 10%三氯乙酸終止反應,常溫條件下以3000 r/min離心10 min,取1 mL上清液與0.5 mL 1%的三氯化鐵溶液混合,常溫靜置10 min后于700 nm處測定吸光值,吸光值越高樣品的還原能力越強。

1.2.6.4 總抗氧化能力的測定 本實驗使用磷鉬絡合法測定樣品的總抗氧化能力[13]。Mo(VI)在抗氧化劑存在的情況上可將其還原為Mo(V)產生在695 nm處具有最大吸收的綠色化合物(磷鉬化合物)。因此可通對其吸光度的差異來對比樣品的抗氧化性強弱,并與VC作比較。向具塞試管中加入1.0 mL 3.0 mol/L的H2SO4溶液、1.0 mL的0.14 mol/L的Na3PO4溶液和1 mL 0.02 mol/L的鉬酸銨溶液,充分混勻后分別加入1 mL不同濃度的番石榴葉、皮、果肉黃酮溶液,用蒸餾水定容至5 mL。加塞后于90 ℃下水浴90 min。取出冷卻于695 nm處測定吸光度。

1.3 數據處理

實驗結果均表示為平均值±標準差,使用SPASS 18.0軟件進行顯著性分析,Origin 8.0軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 乙醇濃度對番石榴葉、皮中總黃酮提取量的影響 由圖1可知,當乙醇濃度逐漸升高時,番石榴葉及番石榴皮中的總黃酮提取量逐漸升高。當乙醇濃度到達60%時,番石榴葉及番石榴皮中總黃酮的提取量達到最高,分別為(72.41±2.34)、(39.49±0.53) mg/g。隨后乙醇濃度繼續增加,番石榴葉及番石榴皮中總黃酮提取量反而降低。這可能是由于乙醇濃度影響了黃酮類及其他醇溶性物質的溶解性,在乙醇濃度為60%時,黃酮類物質的溶出量達到最大并達到飽和,當乙醇濃度再增大時,會使得其他醇溶物的溶出量也增加[14]。因此,番石榴葉、皮總黃酮的提取中乙醇提取分數選擇60%。

圖1 乙醇濃度對黃酮提取量的影響

2.1.2 提取溫度對總黃酮提取量的影響 由圖2可知,番石榴葉中總黃酮的提取量隨著提取溫度的升高而升高,在溫度達到60 ℃時,總黃酮提取量達到最大(112.11±1.39) mg/g。當提取溫度繼續升高,番石榴葉中總黃酮提取量反而降低。這可能是由于溫度過高時黃酮因氧化被破壞[15]。因此,番石榴葉中總黃酮的提取溫度選擇60 ℃。同理分析可知,在提取溫度為50 ℃,番石榴皮中總黃酮提取量達到最大(46.38±0.21) mg/g。番石榴皮總黃酮提取溫度應選擇50 ℃。

圖2 提取溫度對總黃酮提取量的影響

2.1.3 料液比對總黃酮提取量的影響 由圖3可知,隨著提取料液比的增加,番石榴葉中總黃酮的提取量也增加,當料液比為1∶20 (g/mL)時,番石榴葉總黃酮提取量達到最大(166.96±4.40) mg/g。再繼續加大提取料液比,番石榴葉中總黃酮的提取量降低。在料液比為一個合適范圍時,隨料液比的增加會促進黃酮物質的溶出,而料液比過高時,會加大其他雜質的溶出,使得黃酮提取量降低[14,16]。因此,番石榴葉中總黃酮提取的料液比選擇1∶20 (g/mL)。同理,當提取料液比為1∶10 (g/mL)時,番石榴皮中總黃酮提取量達到最大(53.46±1.11) mg/g,因此番石榴皮總黃酮提取料液比應選擇1∶10 (g/mL)。

圖3 料液比對總黃酮提取量的影響

2.1.4 浸提時間對總黃酮提取量的影響 由圖4可知,隨著提取時間的延長,番石榴葉中的總黃酮溶出量也逐漸加大,當提取時間在150 min時,番石榴葉總黃酮含量達到最大(181.43±0.75) mg/g。再延長提取時間,總黃酮含量則呈下降趨勢。這可能是由于當提取時間過長時會使黃酮類物質分解或者使得其他雜質溶出增多[17]。因此,番石榴葉總黃酮提取的時間選擇150 min。同理,當提取時間為90 min時,番石榴皮中總黃酮提取量達到最大(49.97±1.14) mg/g。番石榴皮中總黃酮提取時間應選擇90 min。

圖4 提取時間對總黃酮提取量的影響

2.2 正交實驗結果

根據單因素的結果,設計四因素三水平正交試驗,番石榴葉試驗結果見表3,由R值分析可知,四因素對番石榴葉總黃酮提取量的影響大小為A>C>B>D,即乙醇濃度>料液比>提取溫度>提取時間。根據k值分析可得番石榴葉總黃酮最優提取工藝組合A1B3C2D1。即乙醇濃度為50%,提取溫度為65 ℃,料液比為1∶20 (g/mL),提取時間為135 min。按以上理論最優工藝進行提取,番石榴葉總黃酮提取量為(188.66±0.23) mg/g,顯著高于正交表中9個組合的番石榴葉總黃酮提取量(p<0.05)。

番石榴皮總黃酮的提取結果見表4,四因素對番石榴皮總黃酮提取量影響大小為A>B>C>D。其最佳工藝組合為A2B1C1D3,即乙醇濃度為60%,提取溫度為45 ℃,料液比為1∶7 (g/mL),提取時間為105 min。按照以上理論最優工藝進行提取,番石榴皮總黃酮提取量為(48.03±0.16)mg/g,顯著高于正交表中9個組合的番石榴皮總黃酮提取量(p<0.05)。番石榴葉及番石榴皮總黃酮的提取工藝均得以驗證。

表4 番石榴皮總黃酮正交實驗設計及結果Table 4 Orthogonal test design and result of total flavonoids from guava peel

因番石榴果肉與番石榴果皮連接較為緊密,且其生長周期及所處環境等條件較番石榴葉來說更為相近。所以在提取番石榴果肉黃酮時采用的是番石榴皮黃酮提取最佳工藝條件。其中番石榴果肉在此提取條件下的黃酮提取量10.65 mg/g,遠低于番石榴葉及皮的黃酮提取量,因此本文對番石榴果肉黃酮的提取工藝不作探討。而用番石榴皮黃酮的最佳工藝條件進行提取,目的是下一步探討番石榴葉、皮、果肉黃酮的體外抗氧化能力。

2.3 番石榴葉、皮、果肉中總黃酮的體外抗氧化活性評價

2.3.1 對ABTS+·的清除作用 番石榴葉、皮、果肉黃酮對ABTS+·的清除作用如圖5所示。隨著樣品濃度的增加,對ABTS+·清除率也隨之升高,在樣品濃度為0.05 mg/mL時,番石榴葉、皮、果肉黃酮對ABTS+·清除率分別高達84.30%±0.12%、60.87%±0.26%、50.70%±0.12%。相同濃度下(0.02～0.05) mg/mL比較,三種黃酮樣品對ABTS+·清除能力均為番石榴葉黃酮>番石榴皮黃酮>番石榴果肉黃酮,并存在顯著性差異(p<0.05)。與陽性對照VC相比,番石榴葉黃酮對ABTS+·的清除率顯著高于VC(p<0.05),而VC又顯著優于番石榴皮及果肉黃酮。三種黃酮濃度與ABTS+·清除率呈現良好的劑量效應關系。

圖5 番石榴葉、皮、果肉黃酮濃度對ABTS+·的清除作用

2.3.2 對·OH的清除作用 番石榴葉、皮、果肉黃酮對·OH的清除作用如圖6所示。在0.2～1.6 mg/mL范圍內,·OH清除率隨番石榴葉黃酮濃度的增加而增加,在其濃度為1.6 mg/mL時,對·OH清除率為(76.55±0.05) mg/mL,隨濃度繼續增高,清除率未有顯著性增長。當番石榴皮、果肉黃酮濃度逐漸升高時,·OH的清除率也隨之增高。且陽性對照VC對·OH的清除能力顯著高于番石榴葉、皮、果肉黃酮(p<0.05)。四者間清除·OH能力排序為VC>番石榴葉黃酮>番石榴皮黃酮>番石榴果肉黃酮。

圖6 番石榴葉、皮、果肉黃酮濃度對·OH清除作用的影響

2.3.3 鐵還原力分析 番石榴葉、皮、果肉黃酮的鐵還原力如圖7所示。在鐵還原力測定實驗中,吸光值越大,代表鐵還原力越強[18-19]。隨著樣品濃度的增加,三種黃酮還原力逐漸提高,并呈現明顯的劑量效應關系。當樣品濃度為0.06 mg/mL時,番石榴葉、皮、果肉黃酮及VC樣品對應的吸光值為1.33±0.01、0.86±0.02、0.79±0.03、1.69±0.03。三種黃酮樣品及VC還原力強弱排序為VC>番石榴葉黃酮>番石榴皮黃酮>番石榴果肉黃酮,并且樣品間還原力強弱具有顯著性差異(p<0.05)。

圖7 番石榴葉、皮、果肉黃酮濃度對鐵還原力的影響

2.3.4 總抗氧化能力分析 番石榴葉、皮、果肉黃酮的總抗氧化能力如圖8所示。在總抗氧化能力測定實驗中,吸光值越高,抗氧化力越強[20-21]。番石榴葉、皮、果肉黃酮隨濃度的增加抗氧化能力也逐漸增加。比較相同樣品濃度作用下的吸光值,可知三種黃酮的總抗氧化能力強弱順序為番石榴葉黃酮>番石榴皮黃酮>番石榴果肉黃酮,且這三種黃酮的濃度均與抗氧化能力間存在良好的劑量效應關系。在樣品濃度范圍為0.02～0.05 mg/mL時,番石榴葉、皮黃酮的總抗氧化能力均優于VC,番石榴果肉黃酮總抗氧化力略低于VC。當樣品的濃度為0.06 mg/mL時,VC組對應吸光值高于番石榴皮黃酮組,與低濃度范圍(0.02～0.05) mg/mL所得規律不同,這可能與樣品濃度有關,還需進一步探究。

圖8 番石榴葉、皮、果肉黃酮濃度對總抗氧化能力對影響

番石榴葉、皮、果肉黃酮對ABTS+·及·OH均具有良好的清除作用,也具有較好的鐵還原能力及總抗氧化能力。綜合以上抗氧化實驗結果,可知三種黃酮的體外抗氧化能力強弱為番石榴葉黃酮>番石榴皮黃酮>番石榴果肉黃酮。可能是由于番石榴葉與番石榴果皮、果肉中黃酮組分及含量存在差異,從而影響了其抗氧化活性。而對于番石榴皮黃酮與番石榴果肉黃酮來說,盡管兩者采用相同的提取工藝,但原料本身黃酮組分可能存在不同,所以產生了抗氧化活性的差別。

3 結論

番石榴葉葉、皮為番石榴工業應用中的副產物,具有對其總黃酮提取工藝優化價值。因此本實驗采用有機溶劑浸提法對珍珠番石榴(白肉)葉、皮黃酮的提取工藝進行了優化對比。番石榴葉黃酮最佳提取工藝為:乙醇濃度50%、提取溫度為65 ℃,料液比為1∶20 (g/mL),提取時間為135 min。番石榴皮黃酮最佳提取工藝為乙醇濃度60%、提取溫度為45 ℃,料液比為1∶7 (g/mL),提取時間為105 min。在最優工藝條件下,番石榴葉、皮黃酮的提取量分別為(188.66±0.23)、(48.03±0.16) mg/g。通過ABTS+·清除實驗、·OH基清除實驗、鐵還原力的測定及總抗氧化能力的測定,發現三種黃酮樣品的體外抗氧化能力大小為番石榴葉黃酮>番石榴皮黃酮>番石榴果肉黃酮。且番石榴葉黃酮在ABTS+·清除能力及總抗氧化能力上顯著優于陽性對照VC。由此可見,白肉番石榴黃酮可作為良好的抗氧化劑的天然來源。