固相萃取UPLCMS/MS法測定牛奶中氟蟲腈及其代謝物殘留量

張小剛，王 霞，馬穎清，豐東升，戴春風，陳美蓮

(上海市農產品質量安全檢測中心，農業部食品質量監督檢驗測試中心，上海 201708)

氟蟲腈(Fipronil)，商品名為銳勁特，是一種苯基吡唑類的廣譜殺蟲劑，廣泛用于農業生產。研究發現，氟蟲腈對生態環境具有潛在的危險性，并且具有慢性神經毒性；氟蟲腈在動物、植物、環境中會代謝生成與氟蟲腈毒性相當或更高的砜化物或亞砜化合物[1]。目前，氟蟲腈對環境、生態系統及人類健康的影響受到世界各國的普遍關注，并對其使用及殘留量作出明確規定。歐盟和日本規定了牛奶中氟蟲腈的殘留量限量值分別為0.005和0.02 mg/kg[2-3]。我國農業部第1157號公告規定：除衛生用、部分旱田種子包衣劑外，在中國境內停止銷售和使用用于其他方面的含氟蟲腈成分的農藥制劑[4]。我國《食品安全國家標準食品中農藥最大殘留限量》(GB 2763-2016)也有明確規定，氟蟲腈在農作物中的最大殘留量為0.1 mg/kg[5]，但尚未對動物源性食品中氟蟲腈的最大殘留限量作出規定。

目前，氟蟲腈及其代謝物的檢測方法主要有氣相色譜法[6-7]、氣相色譜-質譜法[8-9]、液相色譜法[10]和液相色譜-質譜法[11-13]。但是，這些方法多數針對蔬菜水果、環境水體中的氟蟲腈及其代謝物殘留檢測，針對畜禽產品的較少。本文采用乙腈提取，Oasis PRiME HLB固相萃取柱通過式凈化，UPLC-MS/MS測定分析，建立一種簡便、快速、準確測定牛奶中氟蟲腈及其代謝物殘留量的分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牛奶 購自超市；氟蟲腈、氟甲腈、氟蟲腈砜、氟蟲腈硫醚標準品 純度≥96.5%，德國Dr. Ehrenstorfer公司；甲醇、乙腈、丙酮 色譜純，美國Thermo Fisher Scientific公司；氯化鈉 分析純，國藥集團化學試劑有限公司；實驗用水 由Milli-Q純水機制得。

Xevo TQ-S超高效液相色譜-串聯質譜儀 美國Waters公司；MultifugeX1R冷凍離心機 美國Thermo Fisher Scientific公司；Milli-Q超純水儀 美國Millipore公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品前處理 準確稱取5 g(精確至0.01 g)牛奶樣品于50 mL聚丙烯塑料離心管中，加入20 mL乙腈振蕩提取10 min，再加入2 g 氯化鈉振搖1 min，8000 r/min冷凍離心5 min。取2 mL上清液過PRiME HLB固相萃取柱，收集流出液。流出液經0.22 μm有機濾膜過濾至進樣瓶中，供UPLC-MS/MS分析。

1.2.2 色譜條件 色譜柱：HSS T3柱(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)；進樣體積：2 μL；柱溫：40 ℃；流動相A為水，B為乙腈；流速：0.5 mL/min；梯度洗脫程序：0～0.2 min，80%A；0.2～2.5 min，80% A～5% A；2.5～3.0 min，5% A；3.0～3.1 min，5% A～80% A；3.1～5.0 min，80% A。

1.2.3 質譜條件 電噴霧離子(ESI)源；負離子掃描；多反應監測(MRM)；毛細管電壓：2.5 kV；錐孔電壓：30 V；脫溶劑溫度：500 ℃；脫溶劑氣流速:800 L/Hr；錐孔氣流速：150 L/Hr。離子源溫度：150 ℃。質譜采集參數見表1。

表1 氟蟲腈及其代謝物的質譜參數Table 1 Parameters for mass spectrometric analysis of fipronil and its metabolites

1.3 數據處理

MassLynxV4.1數據采集分析軟件。

2 結果與分析

2.1 提取試劑的篩選

本實驗分別選用甲醇、乙腈、丙酮作為提取試劑，在陰性牛奶樣品中添加4種化合物的混合標準溶液，添加水平為5 μg/kg，按本實驗建立的方法進行處理分析，結果見圖1。結果表明當使用甲醇作為提取劑時，4種化合物的回收率僅為12.4%～35.5%，而當使用乙腈、丙酮作為提取劑時的回收率分別為80.6%～87.5%、82.6%～89.7%，效率相當。由于長期使用丙酮會對反相色譜柱造成不良影響，因此，本實驗選用乙腈作為提取劑。

圖1 提取溶劑對氟蟲腈及其代謝物回收率的影響

2.2 凈化條件的篩選

牛奶中含有大量的脂肪、磷脂等物質，這些物質會對目標化合物的檢測產生干擾，影響測定的準確性。本研究采用柱通過式凈化方式，將2 mL提取溶液加載至Oasis PRiME HLB固相萃取柱，收集流出液。與常規的反相固相萃取凈化相比，整個凈化過程省略了活化、平衡、淋洗以及洗脫過程，明顯提高了前處理效率。本實驗考察了上樣量對目標化合物回收率的影響。分別選取1、2、3、4、5 mL不同的上樣體積，通過比較平均回收率優化最佳的上樣量。實驗結果表明，當上樣體積為2 mL時，氟蟲腈及其代謝物的回收率最高，因此本實驗選取2 mL為上樣體積。通過比較Oasis PRiME HLB柱凈化前后陰性牛奶樣品的色譜圖(圖2)可以看出，Oasis PRiME HLB凈化后的牛奶樣品基質成分明顯減少。

圖2 經Oasis PRiME HLB凈化前(A)和凈化后(B)的陰性牛奶樣品的總離子流圖

2.3 儀器條件的優化

2.3.1 色譜條件的優化 使用ESI-模式時，通常可采用甲醇-水溶液體系或者乙腈-水溶液體系，也可根據色譜峰形在流動相中加入適量的乙酸銨[14]。本文研究發現甲醇-水和乙腈-水組成的流動相在測定氟蟲腈及其代謝物時，都能得到較好的色譜峰形，且乙腈-水溶液體系下目標化合物的響應值要高于甲醇-水溶液體系。故本實驗選用乙腈-水作為流動相，氟蟲腈及其代謝物的總離子流圖見圖3。

圖3 氟蟲腈及其代謝物標準溶液(0.5μg/L)總離子流圖

2.3.2 質譜條件的優化 由于氟蟲腈及其代謝物在負離子模式下較易失去H+而得到分子離子，所以選擇負離子模式進行掃描。分別對0.5 mg/L的氟蟲腈及其代謝物標準溶液進行一級質譜全掃描，得到每種化合物的分子離子[M-H]-，然后對其進行二級質譜掃描，優化每種化合物的母離子和子離子所需碰撞能量和錐孔電壓，優化后的質譜參數見表1。

2.4 基質效應的評價

基質效應在液質聯用分析過程中普遍存在，由于基質效應的影響，目標化合物發生離子增強或抑制作用，從而影響檢測結果的準確性。本實驗采用(基質匹配標準溶液所作曲線的斜率/無基質標準溶液所作曲線的斜率-1)×100%的方法對氟蟲腈及其代謝物進行基質效應評價[15]。通常認為，基質效應在±20%內為不顯著[16]。由表2可以看出，氟蟲腈及其代謝物均存在一定的基質效應，但均不顯著。這也在一定程度上說明本實驗所建立的凈化方法具有較好的凈化效果。為了能更準確的測定目標化合物，本實驗采用基質匹配標準曲線進行定量。

表2 氟蟲腈及其代謝物的基質效應評價Table 2 Evaluation of matrix effects of fipronil and its metabolites

2.5 線性關系、檢出限與定量限

采用陰性樣品基質提取液配制濃度為0.05、0.2、0.5、2.0、5.0 μg/L的系列混合標準溶液，以質量濃度(x)為橫坐標，以峰面積(y)為縱坐標作標準曲線，得各目標化合物的線性回歸方程和相關系數(r)。結果表明，4種目標化合物在0.05～5.0 μg/L濃度范圍內呈良好的線性關系，相關系數r為0.9976～0.9997。以3倍和10倍信噪比(S/N)確定各化合物的檢出限(LOD)和定量限(LOQ)(見表3)。

表3 4種化合物的線性范圍、線性方程、相關系數、檢出限及定量限Table 3 Linear ranges,regression equations,correlation coefficients,limits of detection(LODs) and limits of quantitation(LOQs) of 4 compounds

2.6 方法回收率和精密度

為驗證本方法的準確度和精密度，取陰性牛奶樣品，分別添加3個濃度水平的4種待測物，進行6份平行樣品測試，方法回收率和精密度結果見表4。由表4表明，4種化合物在3個加標水平的平均回收率為80.6%～101%，相對標準偏差(RSD)為1.0%～6.1%，均滿足《實驗室質量控制規范食品理化檢測》(GB/T 27404-2008)對方法確認技術參數的要求。

表4 4種化合物的平均回收率和相對標準偏差 (n=6)Table 4 Average recoveries and the RSDs of the 4 compounds (n=6)

2.7 實際樣品的測定

采用本實驗建立的方法對20個牛奶樣品進行測定，結果均未檢出氟蟲腈及其代謝物。

3 結論

本實驗建立了超高效液相色譜-串聯質譜測定牛奶樣品中氟蟲腈及其代謝物殘留的技術方法。牛奶樣品經乙腈提取，采用通過式固相萃取凈化，整體實驗操作更簡便，耗時更短，適用于高通量樣品的篩查。該方法的檢出限為0.01 μg/kg，回收率為80.6%～101%，精密度小于10%，滿足多殘留檢測技術的要求，為保障食品安全提供技術支持。