五種藥食同源花提取物體外協同抗氧化作用

余祥雄,梁澤明,肖性龍,余以剛

(華南理工大學食品科學與工程學院,廣東廣州 510641)

五花茶是一種廣東人喜歡的傳統涼茶之一,配方通常包含金銀花、葛花、代代花、白扁豆花、木棉花、菊花、槐花或雞蛋花等。隨著中醫藥理論的發展及人們健康意識的提高,“藥食同源”越來越受到關注。根據中醫藥理論,提高體質和預防疾病有時比后期治療更加重要,因此人們常把藥食同源的中藥開發成飲料或保健品[1-2]。上述茶中葛花和木棉花不是藥食同源材料,不能用作普通食品原料。金銀花、菊花、槐花、白扁豆花和代代花均為藥食同源中藥材,無毒,可作為普通食品原料。來源于植物原料的天然抗氧化成分主要有黃酮、類胡蘿卜素和維生素,通常表現出廣泛的生物效應,如抗菌、抗病毒、抗衰老和抗癌[3]。金銀花含有綠原酸和木犀草素等藥理活性成分,具有抗菌消炎和清熱解毒等功效[4-5];菊花具有平肝明目、散風清熱、消咳止痛和抗黑色素生成的功效[6-7];槐花具有清熱涼血和抗菌消炎等功效,被用于治療與出血有關的疾病,如便血、痔漏和痢疾等[8-9],且槐米是一種提取蘆丁的重要原材料;代代花具有理氣寬胸、開胃止嘔、抗凝血、抑菌和抗腫瘤等功效[10-11];白扁豆花能夠改善人體的脾虛濕盛的情況[12]。這五種藥食同源花組合成的涼茶對清除體內自由基具有較好的作用[13]。

目前,主要有三種評價抗氧化作用協同效應的方法[14]。一是加和法,即先將單一抗氧化劑抗氧化能力值按貢獻率進行加和,然后將所得理論抗氧化能力值與復配物實測抗氧化能力值相比較,從而判斷是否有協同效應[15];二是直接比較法,在相同濃度條件下,比較單一抗氧化劑抗氧化能力與復配物抗氧化能力的大小,從而判斷是否有協同效應[16];三是響應曲面法,該方法從數學水平上分析抗氧化作用的協同效果,能夠通過量化的方式清晰的看到多種因素之間的關系[17]。

本研究通過DPPH自由基清除試驗和AAPH誘導紅細胞溶血試驗分別評價樣品的抗氧化效果,采用直接比較法與加和法判斷五種藥食同源花提取物之間的協同作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菊花、金銀花、槐花、代代花、白扁豆花 廣州志寧藥業有限公司;抗凝羊血 鴻泉生物科技有限公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)、福林酚試劑、沒食子酸、蘆丁 Sigma公司;抗壞血酸 上海源聚生物科技有限公司;2,2-偶氮二(2-甲基丙基咪)二鹽酸鹽(2,2-azobis-(2-amidinopropane)dihydrochloride,AAPH) 阿拉丁試劑上海有限公司;其他試劑 均為分析純。

T1000型電子天平 常熟市雙杰測試儀器廠;MK3酶標儀 廣東環凱微生物科技有限公司;UV-2550紫外-可見分光光度計 日本島津公司;HH-2數顯恒溫水浴鍋 常州奧華儀器有限公司;JW-3021HR高速冷凍離心機 安徽嘉文儀器裝備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 原料處理 分別稱取一定量干燥的金銀花、菊花、槐花、白扁豆花、代代花,以料液比1∶100 (g/mL),在90 ℃水浴的條件下提取100 min。提取完畢后減壓抽濾得到濾液。濾液在55 ℃條件下進行減壓蒸餾,濃縮液經真空冷凍干燥得到提取物粉末。根據實驗室前期感官評價試驗所得復配物的優化配方[18],將提取物粉末進行復配:菊花50%、槐花18%、白扁豆花15%、代代花12%、金銀花5%。多酚、黃酮含量檢測時,白扁豆花、代代花提取所得濾液直接用于檢測,金銀花、菊花、槐花提取所得濾液稀釋10倍后進行檢測。

1.2.2 多酚含量檢測 參考Singleton等[19]的方法稍作改進,采用Folin-Ciocalteu法測定1.2.1中所得濾液的多酚含量。取15 mL具塞比色管,依次加入0.5 mL樣品溶液、0.5 mL Folin-Ciocalteau試劑、2 mL ddH2O,混勻,反應6 min,加入5.0 mL Na2CO3溶液(70 g/L)和4 mL ddH2O,室溫暗處放置90 min后于760 nm波長處檢測吸光度。標準曲線以沒食子酸為標準物(25、50、75、100、125、150、175 μg/mL)。重復3次,結果以沒食子酸當量(Gallic acid equivalents)表示,單位為μg GAE/mL。試驗步驟中以蒸餾水替代Folin-Ciocalteau試劑,作為對應的空白背景試驗。以多酚含量為橫坐標,吸光值為縱坐標,所得標準曲線方程為y=0.0036x+0.054(R2=0.9991)。

1.2.3 黃酮含量檢測 參考Enayat等[20]的方法并加以改進,檢測1.2.1中所得濾液的黃酮含量。在15 mL具塞比色管中加入1 mL樣液、4 mL ddH2O、0.3 mL NaNO2溶液(0.05 g/mL),混勻,25 ℃放置5 min。加入0.3 mL AlCl3溶液(0.1 g/mL)。6 min后,加入2 mL NaOH溶液(1 mol/L)和2.4 mL ddH2O。于490 nm波長處檢測吸光度。標準曲線以蘆丁為標準物(200、300、400、500、600、700 μg/mL)。重復3次,結果以蘆丁當量(Rutin equivalent)表示,單位為μg RE/mL。試驗步驟中以蒸餾水代替NaOH溶液加入,作為相應的空白背景試驗。以黃酮含量為橫坐標,吸光值為縱坐標,標準曲線方程為y=0.0017x-0.1375(R2=0.9988)。

1.2.4 DPPH自由基清除能力的測定 參考Jiang等[21]的方法并加以改進。分別取1 mL樣品溶液,加入5 mL DPPH乙醇溶液(0.005% W/V),立即混勻,30 min后用蒸餾水作參比在517 nm波長處測定其吸光度。

按公式(1)計算各樣品的DPPH自由基清除率。

式(1)

式中:A對照:1 mL ddH2O加5 mL DPPH乙醇溶液吸光度;A樣:1 mL樣品稀釋液加5 mL DPPH乙醇溶液吸光度;A空白為1 mL樣品稀釋液加5 mL乙醇吸光度。

1.2.5 抑制AAPH誘導的紅細胞溶血作用測定 羊血紅細胞懸浮液的制備參考Wang等[22]的方法進行,將含有肝素鈉抗凝劑的羊全血在2000 r/min、4 ℃下離心10 min,去除上層的血清,得到紅細胞沉淀。用PBS(pH7.4)至少沖洗三次,直至上清液澄清為止,以充分去除殘留的血清。取紅細胞沉淀適量,用PBS(pH7.4)配成20%的紅細胞懸浮液,4 ℃冰箱保存。

參考張虹等[23]的方法進行AAPH誘導羊血紅細胞氧化溶血試驗。首先,將200 μL細胞懸浮液與200 μL樣品或PBS緩沖液混勻,然后在37 ℃下輕微震蕩孵育30 min。孵育結束后,加入400 μL AAPH(200 mmol/L)或PBS緩沖液。混合液在37 ℃下,繼續震蕩孵育2 h。結束后,加入5 mL PBS,在2000 r/min、4 ℃下離心10 min,在540 nm處測定上清液吸光值,吸光值為A。將5.6 mL超純水加入到200 μL細胞懸浮液中,達到完全溶血,其吸光值為B。正常組用PBS代替AAPH和樣品;損傷組用PBS代替樣品;毒性試驗組用PBS代替AAPH。

樣品的溶血抑制率通過公式(2)計算:

式(2)

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 多酚、黃酮含量檢測結果

五種藥食同源花中的多酚和黃酮含量檢測結果見表1。

表1 五種藥食同源花中的多酚和黃酮含量Table 1 Contents of polyphenols and flavones in five kinds of medicine food homology flowers

由表1可知,五種藥食同源花原料的總多酚含量由高到低為:槐花>金銀花>菊花>代代花>白扁豆花。總黃酮含量由高到低為:槐花>金銀花>菊花>白扁豆花>代代花。槐花、菊花和金銀花總黃酮含量均大于總多酚含量,而白扁豆花和代代花總黃酮含量均小于總多酚含量。這一結果與嚴和平等[24]所得結果一致,有些花卉黃酮含量高于多酚含量,而有些花卉黃酮含量則低于多酚含量。而且,張建勇等[25]也測得菊花中的黃酮含量大于多酚含量。

2.2 五種藥食同源花提取物及復配物的DPPH自由基清除能力

分別檢測五種藥食同源花提取物及復配物的DPPH自由基清除能力,結果見圖1。

由圖1可知,五種藥食同源花的提取物及復配物對DPPH自由基的清除率與濃度成量效關系,在一定濃度范圍內，濃度越大對DPPH自由基的清除率越大。當濃度在50～150 μg/mL范圍時,復配物和槐花提取物清除DPPH自由基的效果與濃度程線性關系,回歸方程分別為y=0.5911x-7.8289,R2=0.9927和y=0.5688x-6.0989,R2=0.9975。復配物和槐花提取物的DPPH自由基清除率在濃度為150 μg/mL時分別為79.36%±0.87%和78.41%±0.68%,在濃度為500 μg/mL時達到最大,分別為89.20%±0.44%和86.82%±1.25%;當濃度在50～200 μg/mL范圍時,菊花和金銀花提取物清除DPPH自由基的效果與濃度程線性關系,回歸方程分別為y=0.3825x-3.8516(R2=0.9964)和y=0.3487x-1.0326(R2=0.9944)。菊花和金銀花提取物均在500 μg/mL時DPPH自由基清除率達到最高,分別為87.59%±0.59%、91.13%±1.84%;當濃度在50～900 μg/mL范圍時代代花和白扁豆花提取物對DPPH自由基的清除率呈現較好的線性關系,回歸方程分別為y=0.0761x-1.5718,R2=0.9976和y=0.0745x-2.2628,R2=0.9982,但是在較低濃度時對DPPH自由基清除效果較差。

根據線性回歸方程可計算出各提取物的IC50值,大小順序為復配物(97.83 μg/mL)<槐花(98.63 μg/mL)<菊花(140.79 μg/mL)<金銀花(146.35 μg/mL)<代代花(692.24 μg/mL)<白扁豆花(701.51 μg/mL)。IC50值越小則其抗氧化能力越強,從而可判斷各提取物對DPPH自由基清除能力的強弱。復配物的DPPH自由基清除能力最大,相對于其他提取物,復配物減少了單一品加入的量,而DPPH自由基清除能力明顯增加,表明五種提取物之間存在明顯的協同作用。

按照優化后的配方,當復配物濃度為300 μg/mL時,此時溶液中菊花、槐花、白扁豆花、代代花和金銀花提取物濃度分別為150、54、45、36和15 μg/mL。菊花和槐花提取物濃度在線性范圍內,可根據回歸方程分別算出清除DPPH自由基的貢獻率。由圖1及上述分析可知,在較低的一定范圍濃度下,白扁豆花、代代花和金銀花清除DPPH自由基能力與濃度有較好的線性關系,由此可根據回歸方程分別算出清除DPPH自由基的貢獻率。加和五種藥食同源花提取物清除DPPH自由基的貢獻率為84.54%。由圖1可知,復配物濃度為150 μg/mL時,DPPH自由基清除率已達到79.36%±0.87%,大于此濃度時，已超過線性范圍,復配物濃度為300 μg/mL時,DPPH自由基清除率實測值為87.54%±0.85%,這說明五種藥食同源花之間產生了明顯的協同效果。

圖1 五種藥食同源花提取物及復配物的DPPH自由基清除能力

藥食同源材料中多酚或黃酮含量與其抗氧化能力有較大關系,一般來講多酚或黃酮含量越高,原料的抗氧化能力越強。菊花提取物中的多酚和黃酮含量均比金銀花提取物低,但其抗氧化性略高于金銀花,從而說明試驗所用的粗提物中,除了主要物質多酚、黃酮在起作用外,還可能有其他一些成分在起作用,如萜類、皂苷和多糖等。

2.3 五種藥食同源花提取物及其復配物對AAPH誘導紅細胞溶血的抑制作用

紅細胞氧化模型是通過添加抗氧化劑來抑制自由基誘發紅細胞損傷,測定反應終體系中溶血抑制率來評價保護劑細胞內抗氧化活性的一種方法。AAPH是一種水溶性的偶氮類(R-N=N-R)自由基引發劑,在37 ℃、酸堿中性條件下會分解,產生的自由基可以誘導膜組織上的脂質和蛋白質產生過氧化反應,導致細胞膜破壞、紅細胞溶血[26]。紅細胞結構簡單、氧化應激反應靈敏,是評價抗氧化活性比較理想的模型[27]。五種藥食同源花提取物及其復配物對AAPH誘導紅細胞溶血的抑制作用檢測結果見圖2。

圖2 五種藥食同源花提取物及其復配物對AAPH誘導紅細胞溶血的抑制作用

根據圖2,通過差異顯著性分析,五種藥食同源花提取物自身對紅細胞溶血有一定的影響,但不顯著(p>0.05),說明五種藥食同源花的提取物及復配物對羊血紅細胞沒有毒性作用。當劑量在50～500 μg/mL之間時,槐花提取物和復配物表現出很強的溶血抑制作用,而白扁豆花、金銀花、菊花和代代花在濃度為50～500 μg/mL之間未表現出很強的溶血抑制效果,在500 μg/mL時溶血抑制率分別為52.73%±1.76%、43.98%±3.17%、49.55%±4.95%和42.63%±0.17%。除金銀花外,其他幾種提取物隨著劑量增加,抑制溶血效果均有不同程度的增大。金銀花提取物中含有促進溶血的成分和抑制溶血的成分,當促進溶血的成分和抑制溶血的成分濃度達到平衡時,出現提取物劑量增加但溶血抑制效果變化不明顯的現象。黃娜等[28]研究表明,金銀花有一定的溶血風險,有效部位溶血作用的相對強弱為金銀花總皂苷>總酚>總環烯醚萜。

槐花提取物和復配物各劑量組對紅細胞溶血的抑制作用與損傷組之間存在顯著差異(p<0.05),表明槐花提取物和復配物對AAPH誘導的紅細胞體外氧化溶血反應均具有抑制作用,且呈現劑量依賴關系,隨著劑量的增加,抑制率也會增加。劑量在50～300 μg/mL之間時槐花提取物對紅細胞的溶血抑制率小于復配物,當劑量達到300 μg/mL時,槐花提取物和復配物對紅細胞的溶血抑制率分別為77.83%±1.85%和80.94%±1.46%。相對于五種藥食同源花的提取物,復配物減少了單一品加入的量,而增加了對AAPH誘導紅細胞溶血的抑制作用,表現出明顯的協同效果。

劑量在50～300 μg/mL之間時，槐花提取物對紅細胞的溶血抑制率隨著濃度而增大。當劑量大于300 μg/mL時,濃度的變化對紅細胞的溶血抑制率的影響不明顯,當劑量大于400 μg/mL時,濃度對紅細胞的溶血抑制率接近最大值,而且由于在飲料實際生產中槐花提取物和復配物的濃度均小于300 μg/mL,故分析五花茶協同效果時主要考慮劑量在50～300 μg/mL之間對紅細胞的溶血抑制率的影響。

3 結論

根據DPPH自由基半數清除率(IC50)實驗結果,在DPPH體系中,各提取物抗氧化能力大小順序為復配物>槐花>菊花>金銀花>代代花>白扁豆花。使用單一原料時,槐花對DPPH自由基清除效果最好。當復配物濃度為300 μg/mL時,復配物DPPH自由基清除率以貢獻率加和值84.54%作為預測值,小于實際測得值87.54%±0.85%,五種提取物發揮出明顯的協同效果。在AAPH誘導紅細胞溶血體系中,復配物和槐花提取物表現出很強的溶血抑制作用,而金銀花、菊花、代代花以及白扁豆花提取物僅表現出較弱的抑制作用。劑量在50～300 μg/mL時，槐花提取物對紅細胞的溶血抑制率小于復配物,當劑量達到300 μg/mL時,復配物對紅細胞的溶血抑制率大于槐花提取物,分別為80.94%±1.46%和77.83%±1.85%,復配物同樣表現出一定的協同效應。以DPPH自由基清除試驗和AAPH誘導紅細胞溶血試驗對五種藥食同源花的水提物及其復配物進行抗氧化能力評價,在兩個體系中均能發現五種提取物之間具有協同抗氧化效應。