茶多酚蛋白質相互作用的研究進展

姚其鳳,吳正奇,陳小強，周 呤，黃 煌

(湖北工業大學生物工程與食品學院,湖北武漢 430070)

茶葉,含有豐富的功能活性成分,隨著人們對健康的重視,對茶飲品及其相關食品的研究逐漸增加。茶多酚(Tea Polyphenols,TP)是綠茶等茶類中主要的品質和活性成分,在干茶中含量可達18%～36%,具有治療和預防肥胖、癌癥與心血管疾病等功效[1-3]。茶多酚類分屬于兒茶素(黃烷醇類);黃酮、黃酮醇類;花青素、花白素類;酚酸及縮酚類等。以兒茶素為主體的黃烷醇類占多酚類總量的70%～80%,其中兒茶素結構如圖1所示。目前已有大量茶多酚與不同種類蛋白質相互作用的研究,表沒食子兒茶素沒食子酸酯(Epigallocatechin gallate,EGCG)是主要的兒茶素單體[4],對牛α-乳清蛋白[5]、大豆分離蛋白[6]和β-乳球蛋白[7]等膳食蛋白具有強親和力。

圖1 兒茶素結構示意圖

在茶多酚的開發應用過程中,通過共價和非共價鍵與蛋白質相互作用形成可逆或不可逆的復合物,影響茶食品的品質和口感,因此茶多酚-蛋白質相互作用被食品學術界廣泛研究。如Monteleone等[8]認為多酚與唾液蛋白結合導致澀味和苦味;Georgiades等[9]發現茶多酚與胃和十二指腸粘蛋白相互作用導致沉淀和凝膠化,進而影響人體對茶食品在消化過程中的吸收;Wu等[10]指出EGCG使脂肪酶的催化活性喪失等。

本文介紹了茶多酚-蛋白質相互作用對蛋白質功能性的影響、二者相互作用機理及影響因素,主要對二者相互作用研究方法的進展進行了綜述,為茶多酚和蛋白質相互作用研究的方法提供了理論依據和方法。

1 茶多酚與蛋白質相互作用對蛋白質的功能特性的影響

蛋白質的功能特性是指食品體系在加工、貯藏、制備和消費期間影響蛋白質在食品體系中性能的物理和化學性質[11]。蛋白質作為食品中主要的基礎功能成分,其功能性大多數影響著食品的感官品質,對食品加工或儲存過程中的物理特性起重要作用。目前對于茶多酚與蛋白質相互作用對蛋白質的功能性質造成影響的研究主要集中在蛋白質的起泡性、溶解性、凝膠作用、乳化作用等。且隨著蛋白質的種類、茶多酚的濃度、反應條件[12]的不同,對蛋白質功能性質的影響也各不相同。

Wu等[13]發現在1.0%(w/v)的雞蛋蛋白溶液中加入0.25%(w/v)的綠茶茶多酚可以使雞蛋蛋白的發泡能力和發泡穩定性增加4～5倍。覃思等[14]認為這是由于活性羥基或羧基的存在使得蛋白質有更大的形成氫鍵的能力,能夠形成更多的有一定機械強度的薄膜,從而更大降低液相的表面張力,提高了發泡能力和泡沫的穩定性。據郭興鳳等[15]的單因素實驗及響應面試驗結果,確定茶多酚在大豆分離蛋白中的添加量及添加條件為:濃度為1%大豆分離蛋白溶液中茶多酚濃度0.088%,混合溫度為21.6 ℃,pH為4.85時,蛋白質溶解性提高。Staszewski等[16]發現茶多酚的存在加速了β-乳球蛋白和酪蛋白巨肽的凝膠化,并且主要影響β-乳球蛋白凝膠的粘彈性。曹艷蕓[17]認為EGCG和沒食子酸均顯著提高了乳清蛋白冷凝膠的凝膠強度,是由于茶多酚與蛋白質的疏水相互作用、以及茶多酚引起的蛋白質結構去折疊化和分子交聯均有利于蛋白質的聚集。劉澤宇等[18]添加0.05%以上茶多酚能顯著提高草魚魚肉蛋白質的乳化穩定性,并延緩乳化能力的降低。

然而,Hu等[19]的研究結果表明,添加茶多酚可明顯降低小麥面筋的發泡性和溶解度。這主要是由于茶多酚與相對松散的谷蛋白和茶多酚-谷蛋白交叉的結合,形成了相互穩定的連接網絡結構,從而減少了蛋白質在水中的溶解。此外,添加多酚已經破壞了谷蛋白的柔韌性,這使得谷蛋白失去其發泡性質。曹艷蕓[17]研究了在中性pH(7.0)和室溫環境下,EGCG和沒食子酸對天然乳清蛋白和熱變性乳清蛋白起泡性質的影響有所不同,二者都能顯著提高天然乳清蛋白的起泡性質,但是熱變性乳清蛋白起泡性質的變化與多酚濃度有關,多酚濃度過高時會降低熱變性乳清蛋白的起泡性質。曹云剛[20]等發現當EGCG濃度為50～200 mg/L時,對于肉蛋白的乳化性和凝膠性無顯著影響;當其濃度為500和1000 mg/L時,顯著降低了肉蛋白的乳化性和凝膠性。

2 茶多酚與蛋白質相互作用機理及影響因素

2.1 茶多酚與蛋白質相互作用機理

茶多酚多與蛋白質通過疏水作用、范德華力、氫鍵和離子相互作用等非共價相互作用發生可逆性結合[21-22]。其中,疏水作用和氫鍵是兩者結合的最主要的作用力[23-24]。Avi等[25]研究發現EGCG與β-乳球蛋白通過疏水相互作用和氫鍵進行結合。Frazier等[26]通過研究四種不同茶多酚與明膠相互作用,認為氫鍵是主要作用力。Yang等[4]研究結果表明,EGCG通過兩步機制自發結合牛乳鐵蛋白且氫鍵總是參與二者復合物的形成。

茶多酚還可與蛋白質通過共價鍵發生不可逆結合[21]。茶多酚通過氧化或親核加成形成醌或半醌自由基結構與蛋白質形成共價結構,且茶多酚的結構直接影響了共價鍵的形成。研究表明共價和非共價結合可以共存[20],如綠原酸與蛋白質的結合[22,27]。

2.2 影響因素

目前對影響茶多酚與蛋白質相互作用的主要因素的研究包括多酚/蛋白質比例[28]、多酚的結構和分子量[29]、溫度[30]與蛋白質的種類[31]等。Wang等[28]研究發現,隨著EGCG/β-淀粉樣蛋白比率的增大,二者的主要相互作用逐漸從氫鍵轉變為疏水相互作用,導致結合從焓驅動到熵驅動的轉變。Jia等[29]通過研究β-乳球蛋白與牛乳鐵蛋白、阿魏酸和EGCG之間的相互作用,探究了酚酸酯與酚酸結合蛋白質的機理,發現酚酸與蛋白質主要通過氫鍵和范德華相互作用結合;酚酸酯則主要通過疏水相互作用與蛋白質結合。酚酸酯較酚酸與蛋白質的結合能力強。Kanakis等[30]研究結果表明ECG和EGCG相較于C和EC對蛋白質構象的改變更明顯,說明了較大分子量的多酚對蛋白質二級結構的影響較大。Chanphai等[31]的研究發現不同種類蛋白質對茶多酚的親和能力不同,蛋白質對茶多酚的親和能力的順序為β-酪蛋白>α-酪蛋白>β-乳球蛋白。Zhao等[32]通過研究溫度對ECG與牛血清蛋白體系的影響發現溫度的升高可以顯著改善二者的穩定性,從而導致結合常數的上升和結合位點的數量的提高。不同因素對茶多酚與蛋白質相互作用的影響都有差異,這些差異是通過二者相互作用的熱力學參數、作用力、結合常數等方面體現出來的。

3 茶多酚與蛋白質相互作用研究方法

3.1 紫外-可見吸收光譜(UV-vis)

UV-vis主要通過比較吸收帶的位置及強度的變化來判斷蛋白質與多酚是否發生相互作用。此方法具有操作簡單、重現性好以及分析速度快等優點。其原理是利用蛋白質的吸收光譜顯示出兩個主要的吸收峰:200 nm處蛋白質的典型構架構象以及280 nm處芳香族氨基酸。茶多酚的芳香環上π型分子軌道之間的電子躍遷使其在紫外-可見光范圍內有特征吸收[33-34],茶多酚的芳香環上π型分子軌道之間的電子躍遷使其在紫外-可見光范圍內有特征吸收。

Ye等[35]以紫外-可見光譜的變化探究了紅茶多酚和綠茶多酚與牛奶蛋白的相互作用。發現隨著牛奶添加量的增加,紅茶多酚-牛奶體系和綠茶多酚-牛奶體系的紫外吸收強度逐漸增加。推測是茶多酚的酚羥基與乳蛋白的酰胺基團之間形成了氫鍵,增加了在多酚的芳香環上的π電子云的強度,導致增色效應[36]。除此之外,還可以通過紫外光譜計算多酚-蛋白的結合常數[34,37],根據Beer-Lambert定律可推導出方程(1)。Kanakis等[38]和Liu等[6]通過此方程分別成功計算出了類黃酮-人血清蛋白復合物的結合常數及不同溫度下茶多酚與大豆分離蛋白的結合常數(K),進而表明茶多酚改變了空間結構中芳香族氨基酸殘基的微環境和大豆分離蛋白的構象。

式(1)

式中：C茶多酚表示茶多酚的分析濃度,A0和A分別是在茶多酚存在和不存在下280 nm處蛋白質的吸光度。ε蛋白質和εB分別是蛋白質和茶多酚的摩爾消光系數。

然而,該技術通過峰位移,吸收光譜及其強度提供蛋白質與茶多酚相互作用的定性信息[39-40],不足以對茶多酚蛋白質復合物進行相對全面的分析。

3.2 熒光發射光譜

熒光發射光譜在多酚和蛋白質相互作用的研究中應用廣泛[41-43]。此方法提供茶多酚與蛋白質相互作用導致的蛋白質三級結構變化的詳細信息,具有光譜簡化、光譜帶寬減少和避免多種干擾效應等優點。其基本原理為某些蛋白質構象的轉變、底物的結合和發色團分子環境的變化會導致其固有熒光的變化。通過研究熒光的改變可以幫助理解茶多酚與蛋白質的結合位置[44]并可以通過分析熒光猝滅過程進一步推斷二者的結合過程。

Liang等[43]發現原花青素B3可以與溶菌酶相互作用,猝滅其固有熒光。通過Stern-Volmer方程分析處理熒光猝滅數據后,發現雙分子猝滅常數值(kq)均高于生物分子的擴散限制速率常數(kd)[43-46],說明兒茶素誘導蛋白質熒光猝滅的機理為靜態猝滅。線性Stern-Volmer圖通常指示蛋白質中的單一類熒光團,當kq較高時,蛋白質和猝滅劑之間形成了復雜的結合。此時線性Stern-Volmer圖不再適用,為了分析此種情況下的蛋白質多酚結合過程,Liang等對Stern-Volmer方程進行了改進。通過修正的Stern-Volmer方程進一步分析原花青素B3對溶菌酶的熒光猝滅過程,證實了靜態猝滅機理,并通過計算淬滅常數發現B3的結合能力可以改變溶菌酶的三級結構并促進溶菌酶/B3復合物的形成。通過熒光分析還可以得到配體與蛋白質相互作用的結合常數Kb,結合位點的數量n。其中,n和Kb可以通過log(F0-F)/F對log(1/([Qt]-(F0-F)[Pt]/F0))繪圖獲得[47]。 Bose[46]主要利用熒光技術得到不同兒茶素衍生物與血清白蛋白的Kb值,并對其大小進行了分析,發現Kb值隨著沒食子酰基部分的增加而增加,而n值總是接近于1,表示多酚和蛋白質1∶1絡合。

熒光發射光譜分析存在一些局限,作為一種局部信號,在蛋白質折疊研究中,熒光無法提供詳細的結構信息,需要將熒光變化與圓二色譜、FTIR或NMR信號進行共同分析得到結論[48]。而熒光內濾效應(IFE)可能會影響熒光測量,需在不同條件下檢查激發和發射波長處的總吸光度以排除IFE干擾[49]。

3.3 圓二色光譜(CD)

物質的左旋和右旋圓偏振光的 吸收差異產生圓二色性,遠紫外圓二色光譜常用于估算蛋白的二級結構含量,如α-螺旋、β-折疊、γ-轉角和無規卷曲含量等[50-51]。近紫外CD光譜則能反映蛋白質中色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)殘基及二硫鍵所處微環境的擾動,因而能用于研究蛋白質三級結構的精細變化,還能用于輔基結構表征。當茶多酚與蛋白結合后,蛋白質的CD譜的波峰會發生移動,移動方向一般由蛋白質及多酚的類別決定。

Roqanian等[52]研究發現茶多酚的添加使雞蛋白溶菌酶的CD譜的波峰發生藍移,且在280和285 nm之間的橢圓率會發生一定變化。而Wallace等[53]則發現原花青素B3與溶菌酶結合會導致208 nm處的波峰紅移。通過圓二色光譜可以得到蛋白質在222 nm處的摩爾橢圓率值([θ]222),通過公式fH=-([θ]222+2340)/30300可算出α-螺旋含量(fH)。研究表明,相同條件下茶多酚與不同種類蛋白質相互作用會誘導蛋白質的二級結構含量發生不同的變化[54]。徐潔瓊[7]研究發現,相同條件下,β-LG加入溶液中,α-螺旋含量降低、β-折疊及無規卷曲含量增加;而當β-酪蛋白加入溶液中,α-螺旋及β-折疊含量明顯降低,轉角及無規卷曲含量增加。

CD光譜具有樣品耗量少且數據處理量小等特征,可用于研究不同溶劑、溫度、pH、鹽度及輔助因子下的蛋白質構象。CD光譜也常常與其他技術聯用來研究多酚與蛋白質的結合過程中的結構變化。

3.4 傅里葉變換紅外光譜法(FTIR)

FTIR作為一種無損檢測手段,可有效提供有關多酚-蛋白質復合物中蛋白質鏈構象和疏水性結合的信息,因而可用于對多酚-蛋白質分子相互作用機制的深入探究。其原理是利用蛋白質二級結構如α-螺旋、β-折疊、γ-轉角等的酞胺Ⅰ帶、Ⅱ帶伸縮振動在紅外光譜上表現為特征吸收來觀測多酚-蛋白質互作過程中蛋白質二級結構的變化[55-56]。FTIR應用于茶多酚與蛋白質相互作用分析,此方法不需要對蛋白質進行特定標記,在檢測過程中不會對原始蛋白質造成干擾,能對整個蛋白質的特定位點同時進行檢測[57]。

Kanakis等[30]采用紅外光譜法研究了茶多酚-β-乳球蛋白復合物的形成過程。當少量茶多酚被加入進蛋白溶液中后,多酚能與蛋白質結構中的C=O,C-N和N-H基團發生親水相互作用,使蛋白質酰胺I帶和酰胺II帶強度增加。另外,他們認為隨著多酚濃度增加,蛋白質α-螺旋和β-片層結構增加,導致酰胺I帶的光譜強度隨之增加。類似地,使用具有二階導數分辨率增強和曲線擬合程序的紅外自解卷積也被用于確定存在茶多酚時的蛋白質二級結構[58]。Al-Hanish等[5]研究發現EGCG可使牛α-乳白蛋白的酰胺I帶(1600～1700 cm-1)發生變化,通過對組分條帶的積分面積進行計算與分析,發現結合前后蛋白的α-螺旋含量從36.8%下降到28.9%,而β-折疊含量從20.0%增加至26.7%,表明在多酚與蛋白反應后,蛋白的α-螺旋轉變為β-折疊。

FTIR可適用于分析不同大小和不同種類的蛋白質,相較于其他方法應用范圍更廣。但是由于FTIR技術得到峰值擬合結果不夠準確,因而很少單獨用來表征二級結構,常與CD光譜連用對多酚蛋白質復合物的二級結構進行分析。

3.5 核磁共振波譜法(NMR)

最簡單、最早應用的NMR方法是化學位移滴定法,它可以很容易地檢測配體是否與其靶蛋白結合,其中解離常數的測量響應于配體滴定反應中的蛋白質的化學位移變化[62]。同時蛋白質表面上的結合位點也可以通過化學位移數據得到。Cala等[63]通過比較單寧添加前后肽的1H化學位移變化再結合公式(2)計算得出了蛋白與單寧的解離常數及結合位點數。

式(2)

式中,Aobs:化學位移變化;Δδi:擴散系數變化ΔDobs;Amax:化學位移差Δδmax或 D單獨蛋白質和多酚飽和化學位移之間的擴散差ΔDmax;Kd:解離常數(M);[Ti]:固定肽的多酚的總濃度;[P0]:肽(M)的總濃度;n:多酚結合位點數。

3.6 等溫滴定量熱法(ITC)

量熱技術是獲取體系中分子間相互作用熱力學信息的直接方法,能夠揭示分子間相互作用的存在和相互作用的性質。ITC可通過直接測量兩種分子間反應過程中產生的熱量,獲得包括平衡結合常數K、結合的化學計量數n、吉布斯自由能變化ΔG、焓變ΔH、熵變ΔS在內的多種熱力學參數[64]。由于結合熱是一種自發生的現象,ITC不需要對反應物進行化學修飾或固定化[65-66],同時測量的反應物的分子量不會影響信號的強度。ITC的這些優點使得其被大量應用在茶多酚和蛋白質互作分析中。

研究表明,在茶多酚與蛋白質結合的過程中,當ΔS和ΔH均小于零,表明主要驅動力是氫鍵和范德華力[67-68];當ΔS大于0,則通常被認為是疏水相互作用的典型特征[69];當ΔG和ΔH均小于零,表明相互作用過程是自發和放熱的,但某些直接的靜電相互作用也會引起放熱效應[70]。Li等[71-72]利用ITC研究了兒茶素與兩種蛋白的相互作用,結果表明,兒茶素與牛血清蛋白的結合由焓和熵驅動,并且主要驅動力是靜電相互作用和疏水相互作用。兒茶素與人血清蛋白的結合則是由正焓和負熵驅動的,并且主要驅動力是氫鍵和范德華力。最近Bose等[46]利用ITC觀察到EGCG-人血清蛋白復合物的形成伴隨著負焓變、正熵變以及負的ΔG,因此認為EGCG與人血清蛋白的結合是自發性的,并且對于EGCG-人血清蛋白系統,ΔG的大小主要與ΔH有關,蛋白質和配體的部分固定發生在疏水結合的過程中。

另外,ITC也存在著一些缺點,包括耗時,難以實現自動化及高通量篩選,樣品需求量大等。

4 總結與展望

茶多酚和蛋白質相互作用被廣泛應用于食品加工、機體保健等方面,對于二者間相互作用的研究也日漸增多。然而,由于茶多酚與蛋白質相互作用受多種因素的影響且受限于各種分析方法,所以對于二者相互作用的機理仍不夠明確。多種分析方法用于研究茶多酚與蛋白質可逆的非共價相互作用,所有這些方法都提供的證據不夠全面,因此有必要將它們結合起來以便于了解。另外,茶多酚與蛋白質共價相互作用受到的關注較少,從二者相互作用的幾種可能性來說,共價反應產物似乎是最重要的部分,因為它們不可逆地影響蛋白質和多酚的性質。茶多酚與蛋白質相互作用在機體營養和食品加工等方面受到越來越多的關注,其研究方法的改進是必然趨勢,為了建立穩定可靠研究方法,多種檢測方法的聯用為發展方向。