太子參均一多糖對大鼠小腸α-糖苷酶活性影響

闞永軍 趙立 陳達(dá)煒

【摘 要】 目的：考察太子參均一多糖對大鼠小腸α-糖苷酶活性影響，探討其降血糖途徑。方法：由大鼠分離小腸α-糖苷酶，以對硝基酚-α-葡萄糖苷（pNPG）為底物，利用α-葡萄糖苷酶將其分解成pNP及葡萄糖，而pNP在堿性條件下顯色的原理測定酶活力，以考察太子參均一多糖對酶活性的影響。結(jié)果：太子參均一多糖HP0.5MSC-F和HPH-1-2，濃度為400μmol/L時(shí)對大鼠小腸α-糖苷酶活性抑制率分別為19.00%和28.07%。結(jié)論：兩種太子參均一多糖對α-葡萄糖苷酶活性具有一定的抑制作用。

【關(guān)鍵詞】 太子參;均一多糖;大鼠小腸;α-糖苷酶活性

【中圖分類號】R284.1 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號】1007-8517（2019）4-0018-03

Abstract：Objective To investigate the effect of homogenous polysaccharide of Pseudostellaria heterophylla on the activity of α-glucosidase in the small intestine of rats and to explore its hypoglycemic pathway. Methods The α-glucosidase was isolated from rat small intestine. The α -glucosidase was decomposed into pNP and glucose by α-glucosidase using p-nitrophenol α -glucoside （pNPG） as substrate， and the activity of pNP was determined by the principle of color development under alkaline conditions. The effect of homogeneous polysaccharide of Pseudostellaria heterophylla on enzyme activity was investigated. Results The α-glucosidase activity inhibitory rates of homopolysaccharide of HP0.5m and HPH-1-2 were 19.00% and 28.07% respectively at the concentration of 400μmol/L. Conclusion Two homogenous polysaccharides of Pseudostellaria heterophylla have a certain inhibitory effect on α-glucosidase.

Keywords：Pseudostellaria heterophylla; Homogenous Polysaccharide;Rat Small Intestine; α-glucosidase

國內(nèi)多名學(xué)者的研究結(jié)果表明太子參多糖具有抗糖尿病作用[1-3]。課題組前期，以閩產(chǎn)柘榮太子參為原料，提取粗多糖，醇沉得到分子量分布不同太子參多糖的四個(gè)級分區(qū)，并將四個(gè)級分區(qū)分別對1型及2型糖尿病大、小鼠進(jìn)行抗糖尿病藥效對比實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明50～200kDa分子量段的多糖可顯著降低2型糖尿病大鼠血糖，改善糖尿病一般癥狀[4]。進(jìn)而采用DEAE-纖維素、葡聚糖凝膠柱聯(lián)用將太子參多糖抗2型糖尿病有效部位進(jìn)行分級、純化，獲得均一多糖HPH-1-2及HP0.5MSC-F;集成UV、IR、NMR等多種波譜分析技術(shù)，表征其化學(xué)結(jié)構(gòu);通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明太子參均一多糖PHP0.5MSC-F及PHPH-1-2具有降糖活性[5-6]。本研究從大鼠小腸中分離α-糖苷酶，采用pNPG法、ELISA檢測，考察太子參均一多糖對α-糖苷酶活性影響，探討其降血糖途徑[7]。

1 儀器與材料

1.1 材料 SPF級雄性SD大鼠（200±5）g（上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限公司，許可證號SCXK（滬）2017-005）;HP0.5MSC-F、HPH-1-2，純度大于95%。

1.2 試劑 4-硝基-α-D-吡喃葡萄糖苷（批號：BCBH2918V，sigma公司）;磷酸氫二鈉（分析純，批號：20120330，國藥試劑）;二甲基亞砜（批號：SHBB9317V，sigma公司）;磷酸二氫鈉（分析純，批號：141121，國藥試劑）。

1.3 儀器 YP502N電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）;AE240S分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）;DK-420S水浴鍋（上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）;GNP-9080 恒溫培養(yǎng)箱（上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）;UV-3200紫外分光光度計(jì)（上海美譜達(dá)儀器有限公司）;Varioskan Flas多功能酶標(biāo)儀（美國熱電公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 基本原理 由大鼠分離小腸α-糖苷酶，以對硝基酚-α-葡萄糖苷（pNPG）為底物，利用α-葡萄糖苷酶將其分解成pNP及葡萄糖，而pNP在堿性條件下顯色的原理測定酶活力[8]。

2.2 實(shí)驗(yàn)步驟

2.2.1 磷酸鹽緩沖液的配制 精密稱取NaH2PO4·2H2O 15.7981g，Na2HPO4·12H2O 35.7990g，分別超聲溶解，定容至100mL，混勻，得到1M磷酸鹽貯存液。分別取貯存液NaH2PO4 54mL，Na2HPO4 46mL，定容至1L，即得pH=6.8 0.1M磷酸緩沖鹽溶液。

2.2.2 酶的提取 大鼠禁食不禁水12h后，脫頸椎處死，立即取出小腸，用冷生理鹽水沖洗，翻轉(zhuǎn)小腸后再漂洗，將洗凈的小腸置于培養(yǎng)皿上，用載玻片輕刮下小腸黏膜。加入適量的 4℃ pH=6.8的磷酸鹽緩沖液，勻漿后于 4℃，20000g/min離心20min，沉淀加適量的 4℃ pH=6.8的磷酸鹽緩沖液搖勻后，20000g/min離心20min ，合并上清液，加磷酸鹽緩沖液稀釋至20mL/每只大鼠，置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.3 底物溶液的配制 精密稱取0.01503g 4-硝基-α-D-吡喃葡萄糖苷，加入少量緩沖鹽溶液，超聲溶解，以緩沖鹽溶液定容至25mL。

2.2.4 阿卡波糖溶液的配制 精密稱取阿卡波糖12.86mg，加DMSO 50μL超聲溶解，純水定容至10 mL。即得2000μmol/L阿卡波糖溶液。去上述溶液500μL，純水定容至10 mL。即得100μmol/L阿卡波糖溶液。

2.2.5 試樣對α-糖苷酶抑制率 試驗(yàn)依次將磷酸鹽緩沖液、試藥入到96孔板內(nèi)，復(fù)孔3孔，37℃孵育10min，實(shí)驗(yàn)組加入30μL 底物溶液，混勻，37 ℃ 反應(yīng)30min后，隨后立即測定405nm吸光度。

2.2.6 藥物對α-糖苷酶抑制率的計(jì)算方法 將實(shí)驗(yàn)各組所得OD值代入下式計(jì)算太子參均一多糖對α-糖苷酶抑制率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值表示。抑制率的計(jì)算公式如下：

抑制率（%）=（1-樣品組OD值-樣品對照組OD值陰性組OD值-陰性組對照組OD值）×100%

2.3 結(jié)果 當(dāng)阿卡波糖濃度為55μmol/L時(shí)，其對大鼠小腸α-糖苷酶的抑制率為50.18%，表現(xiàn)出對大鼠小腸α-糖苷酶強(qiáng)抑制活性;HP0.5MSC-F、HPH-1-2、在濃度為400μmol/L時(shí)其抑制率依次為19.00%、27.43%。見表1。

3 討論

源于飲食的糖類化合物分解代謝是由一系列糖苷水解酶在小腸中完成的，這些酶包括直鏈淀粉酶、蔗糖酶及乳糖酶;酶水解產(chǎn)物主要為葡萄糖，透過小腸壁主動吸收進(jìn)入血液循環(huán)。對糖尿病人，減少葡萄糖吸收量從而阻抑血糖濃度的快速升高是一條十分重要的治療途徑。阿卡波糖就是糖水解酶抑制劑，阻止餐后血糖升高，療效確切、副作用小，臨床廣泛應(yīng)用;本研究考察太子參均一多糖對大鼠小腸α-糖苷酶活性影響，從一個(gè)側(cè)面探討太子參多糖的降血糖途徑。但實(shí)驗(yàn)中所用底物pNPG溶液室溫下易水解變質(zhì)，配置后應(yīng)放于4℃冰箱保存。

本研究以阿卡波糖作為陽性對照，ELSA法檢測太子參均一多糖對α-糖苷酶的抑制作用。PHP0.5MSC-F和PHPH-1-2兩種太子參均一多糖對α-葡萄糖苷酶活性具有一定的抑制作用。

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（收稿日期：2018-12-19 編輯：程鵬飛）