汶香附中生物堿類物質(zhì)的提取及其體外抗氧化研究

吳會晗，韓 晨，丁麗雪，方永晟，王學(xué)震,何 珊

(山東中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250300)

香附為莎草科植物莎草(Cyperus rotundus) 的干燥根莖， 味辛、微苦、甘，性平，具有疏肝解郁、調(diào)經(jīng)止痛、理氣調(diào)中的功效，是中醫(yī)常用婦科藥。香附主要成分為揮發(fā)油類物質(zhì)，也包括多種萜類化合物及其氧化物等[1]。香附還含有糖類、黃酮類、生物堿類等各種化合物， Jeong 等[2]從香附中分離鑒定出了 3 個生物堿化合物，分別為羅通定 A(rotundine A) 、羅通定 B(rotundine B)、羅通定 C(rotundine C)，其結(jié)構(gòu)骨架是基于一種新的倍半萜烯類型[3]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

醋香附：購自濟(jì)南宏濟(jì)堂(北園路藥店)，產(chǎn)地山東泰安；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基(南京建成生物科技有限公司)、2,2-聯(lián)氮基雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)自由基(ABTS+)(上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司)；95%乙醇、甲醇、鹽酸、氨水、雷氏銨鹽、二氯甲烷、無水硫酸鈉、丙酮、過硫酸鉀均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2000型紫外可見分光光度計；FA2004B型十萬分之一電子分析天平：賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；粉碎機(jī)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；水浴鍋。

1.3 試驗方法

1.3.1 香附生物堿制備

取一定量醋香附，洗凈，烘干并用粉碎機(jī)研成粉末得到醋香附干粉。精確稱取70.00 g香附粉末于索氏提取器中，用200 mL 95%乙醇進(jìn)行索氏提取2 h。將乙醇倒出，取少部分等量溶液于兩個小試管中，用5%的鹽酸溶液酸化至pH值至5～6，各滴加改良碘化鉍鉀溶液與雷氏銨鹽試液兩滴進(jìn)行生物堿的定性實驗。將剩余乙醇溶液放置于蒸餾燒瓶中，蒸出乙醇直至燒瓶中僅剩20 mL液體，此時將液體倒入磨口錐形瓶中，加入100 mL 1%鹽酸溶液，放置過夜后，抽濾，用氨水調(diào)節(jié)濾液pH值至9～10，用75 mL二氯甲烷萃取，分離有機(jī)相，用氨水調(diào)節(jié)上層清液pH值至 9～10，再用50 mL二氯甲烷萃取2次。合并所有萃取液，用40 g無水硫酸鈉脫水1 h，將萃取液置于蒸餾燒瓶中，蒸出二氯甲烷，直至燒瓶內(nèi)液體近干，再加10 mL丙酮溶液將殘留物溶出，放置于磨口錐形瓶中。再于60℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，刮下生物堿提取物以供下述實驗用。

1.3.2 香附生物堿抗氧化能力的測定

1.3.2.1 樣品溶液制備

精確稱取香附生物堿提取物0.06 g，使用甲醇溶液作為溶劑，配置質(zhì)量濃度為4.0 mg/mL樣品液。再使用甲醇將上述溶液分別稀釋至0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 mg/mL。

1.3.2.2 DPPH自由基清除率的測定

DPPH自由基為暗紫色棱柱狀結(jié)晶，是一種很穩(wěn)定的氮中心自由基，其醇溶液呈紫色，在波長520 nm左右有一強(qiáng)吸收。在DPPH自由基清除試驗中，DPPH自由基與受試物給出的氫原子結(jié)合，使反應(yīng)溶液的顏色變淺，吸光度變小。受試物的抗氧化活性可以根據(jù)實驗組溶液吸光度的變化來判定。

參考單虹宇[4]方法，用無水乙醇配置0.1 mmol/L的自由基溶液，無光下保存該溶液，并使溫度保持在5℃左右。取1.3.2.1中不同濃度的香附生物堿溶液2 mL與配置好的2 mL DPPH自由基溶液，混合兩種溶液并充分振搖，避光條件下反應(yīng)25 min，在520 nm波長處測定吸光度。按照下公式計算DPPH自由基的清除率。重復(fù)測定3次。

DPPH 自由基清除率(%) = (1-(As-Ab)/Ac)×100

式中：

As為樣品組的吸光度值；

Ab為本底組的吸光度值；

Ac為空白組的吸光度值。

1.3.2.3 ABTS自由基清除率的測定

ABTS在氧化劑的作用下氧化成為綠色的自由基陽離子ABTS+·，ABTS+·易溶于水和酸性乙醇溶液，最大吸收值在734 nm左右。在ABTS自由基清除試驗中，加入抗氧化物質(zhì)后，部分ABTS+·自由基被清除，溶液的吸光度降低，得到香附提取物對ABTS+·的清除效果。在室溫避光條件下將7 mmol/LABTS+水溶液和2.45 mmol/L的過硫酸鉀反應(yīng)15 h，制得ABTS+·自由基標(biāo)準(zhǔn)溶液。取該溶液適量，用蒸餾水將其稀釋至OD734nm=0.700±0.005，制得ABTS+·自由基工作液。將0.1 mL ABTS+·自由基工作液3.9 mL與1.3.2.1中不同濃度的香附生物堿溶液混合并且充分振搖，避光條件下反應(yīng)4～6 min，在波長734 nm處測定吸光度[5-6]。計算ABTS+·自由基的清除率并重復(fù)測定3次。

ABTS+清除率(%)=(1-(As-Ab)/Ac)×100

式中：

As為樣品組的吸光度值；

Ab為本底組的吸光度值；

Ac為空白組的吸光度值。

2 結(jié)果與分析

2.1 香附生物堿對DPPH自由基清除率的測定

香附中生物堿對DPPH自由基有一定的清除作用，如圖1為香附生物堿提取物對DPPH自由基的清除率。(生物堿對DPPH自由基的清除能力在(0.5～1) mg/mL內(nèi)增加的幅度最大)，回歸方程為：Y=0.7358 + 0.0807 X(式中X為樣品濃度，Y為清除率)，半抑制率(IC50值)為0.173688 mg/mL。

表1 不同濃度生物堿的清除作用Table 1 Scavenging effects of different concentrations of alkaloids

圖1 不同濃度生物堿的清除作用
Fig.1 Scavenging effects of different concentrations of alkaloids

2.2 香附生物堿對ABTS+自由基清除率的測定

由圖2可見香附生物堿提取物對ABTS+有一定清除作用，且回歸方程為Y=0.1838X+0.3466(式中X為樣品濃度，Y為清除率)，半抑制率(IC50值)為 0.56383 mg/mL。

表2 不同濃度生物堿的清除率Table 2 Clearance of different concentrations of alkaloids

圖2 不同濃度生物堿的清除率
Fig.2 Clearance of different concentrations of alkaloids

3 結(jié)論

本文探究了香附中生物堿提取的方法，以及其抗氧化活性，生物堿的定性實驗結(jié)果表明，索氏提取可以提取出香附中的生物堿，并且提取出的生物堿具有一定的抗氧化能力，其清除ABTS+·自由基和DPPH自由基的IC50值分別為0.5638、0.1737 mg/mL。香附藥用價值較高，分布廣泛，香附中生物堿在目前研究還較少，可以對香附中生物堿進(jìn)行進(jìn)一步的研究。