水稻葉形控制基因的挖掘及分析*

饒玉春， 胡 娟， 金哲倫， 胡錦春， 鄧琳杰， 周 純， 葉 珺

(浙江師范大學 化學與生命科學學院,浙江 金華 321004)

0 引 言

糧食是人類賴以生存的物質基礎，糧食的穩產、高產是社會穩定和經濟發展的先決條件[1].水稻(Oryzasativa. L)是中國的主要糧食作物，自從20世紀60年代半矮桿利用和70年代雜種優勢利用使我國水稻單產發生了2次革命性飛躍以后，在相當長的時間里，水稻產量的提高出現了瓶頸[2].楊守仁[3]于1996年提出了株型育種與雜種優勢利用相結合的超級稻育種技術路線，近20年的實踐證明，該作物育種方式進一步提升了水稻單產，已成為目前不斷挖掘水稻增產潛力，突破產量瓶頸的共識策略.近年來,隨著分子生物學和基因組學的不斷發展，新的技術手段和方法層出不窮，與產量等優異性狀相關的基因不斷地被挖掘、克隆與分析，并應用于具體的育種實踐中，展現出了巨大的增產潛力.

良好的個體株型是水稻高產的必備條件.水稻葉片作為光合作用的主要場所，對水稻的產量起著決定性作用.株型育種的核心思想之一就是盡可能地提高作物的葉面積指數，提高群體的光合效率和物質生產能力[4].目前，對于優良葉形性狀相關的遺傳和分子機理探索更是國內外株型育種研究的熱點.因此，不斷地挖掘與分析水稻葉形調控基因，并通過分子標記輔助選擇等技術手段，將其運用到作物育種研究中，具有十分重要的學術與應用價值[5].這里主要從水稻葉長、葉寬、葉面積及葉片卷曲度等4個方面綜述水稻葉形調控基因和數量性狀位點(quantitative trait locus,QTLs)的研究進展，對已經克隆的葉形基因和QTLs的功能進行了梳理和總結，并對其研究前景作出了展望，以期為挖掘水稻葉形控制基因和理想株型育種提供參考，進一步提高我國水稻的產量.

1 水稻葉形概述

葉片是水稻最重要的器官之一，葉形性狀關系到水稻的各項生理功能和最終產量.近年來,水稻葉形生理生化調控機制相關研究保持著較高的熱度，同時也為水稻理想株型育種研究提供新的思路與參考.以下較為簡略地綜述了水稻葉形的分類，葉形對水稻各項生理功能的影響及水稻葉形育種研究進展與趨勢，以表明葉形研究的意義與價值.

1.1 水稻葉形分類

水稻葉片形態包括葉長、葉寬、葉面積、葉周長、葉厚、葉片卷曲度、葉傾角等性狀[6-10].不同葉形性狀的調控基因共同參與到水稻葉片的形態結構建成和生理功能的發揮，并且不同的葉形性狀在生理形態表現和遺傳基礎上也存在一定的關聯性，如葉片窄而短的一般表現為直立葉，寬且長的則多為披垂葉，葉片卷曲有利于葉片的直立等[11-12].

1.2 葉形對水稻生理功能的影響

葉形的改變會影響到水稻的光合作用、蒸騰作用和抗逆性等多項生理功能，極大地影響到水稻的生長與產量[12].比如葉片主維管束(中脈)的發育情況直接影響到葉片的直立性和披垂度[13].葉片的挺拔度可以通過適當改良葉片寬度等性狀而得到改善，進而調整整個植株的受光狀態，有效增加葉面積指數，進一步挖掘出水稻的產量潛力.

1.2.1 葉形對水稻光合速率的影響

水稻葉片的光合作用受到多種葉形性狀共同影響.從光合有效輻射傳輸角度看，葉片卷曲會減小冠層上部的遮光葉面積，進而改善中、下部冠層的受光條件.從整個冠層結構來看，葉傾角和葉片卷曲度會使冠層的葉面積密度發生改變[14].葉片的適度卷曲能夠有效保證葉片的直立性，改善葉片的受光狀態，增強光合，延遲葉片衰老，有效解決葉長過長導致披垂度增加的問題.直立葉片兩面受光，透光率較披垂葉高，有效提升了葉面積指數，利于產量的增加.

松島省三等[15]提出的“理想稻”株型育種中便指出上部三葉要短、厚、直立，并通過研究發現直立葉群體比彎曲群體的光合效能要多出11%～17%.郎有忠等[16]對卷葉的研究得出，卷葉的群體光合速率在適宜的高密度條件時大大超出展葉.孫虎聲[17]的研究得出，卷葉的氣孔導度與胞間CO2濃度均大于展葉，卷葉的光合作用速率大于展葉.角田重三郎[18]曾證明，厚葉品種中含有更多的葉肉細胞和 RUBP 羧化酶，其光合強度明顯地高于薄葉品種.

1.2.2 葉形對水稻蒸騰速率的影響

葉形性狀對蒸騰作用的影響相關研究相對較少.孫虎聲[17]的研究表明，在齊穗前，卷葉與展葉的葉片蒸騰速率沒有顯著差異，但在齊穗后，卷葉的蒸騰速率一般都比展葉大.其原因可能是，齊穗后的水稻卷葉品種葉片的生理活動比展葉強，蒸騰速率相應偏高，且卷葉可能使其蒸騰作用對外界環境條件變化更敏感.通過蒸騰速率對光強的響應實驗表明，當光強較小時，展葉的氣孔導度和蒸騰速率均小于卷葉；當光強較大時，展葉氣孔導度和蒸騰速率則超過卷葉，且隨光強上升的速率也比卷葉快.

1.2.3 葉形對水稻抗逆性的影響

水稻葉形性狀中，葉片厚度對抗風性有一定影響，葉片較厚，其韌性較強，因而葉片厚度適當的葉片具有比薄葉片表現為更強的抗風性，不易折斷.卷葉水稻品種比展葉品種更耐高溫、更耐旱[18].也有研究提出，卷葉對延緩葉片衰老進程、延長葉片功能期，尤其是中下部葉片功能期具有一定的作用.

1.3 水稻葉形育種

葉形是株形的重要組成部分，在水稻育種領域，先后有多位育種專家提出了水稻高產理想株型模式，無一例外都提及葉片形態的選育.Donald[19]于1968年首次提出理想株型育種的概念，隨后水稻理想株型研究日趨深入.袁隆平院士提出的上部三葉(劍葉、倒二葉、倒三葉)要“長、直、窄、凹、厚”，這些葉片形態特征意味著能夠產生足夠的同化物，是超高產的基礎[20].楊守仁[3]于1996年提出了采用株型育種與雜種優勢利用相結合的超級稻育種技術路線.株型改良與雜種優勢相結合的作物育種方式經過20多年的育種實踐檢驗，已充分證明其可行性與正確性.中國的超級雜交水稻育種計劃目前已進入第5期育種攻關，目標產量指標 16 t/hm2，水稻葉形改良育種正不斷助力于水稻增產潛力挖掘[20].

2 水稻葉形控制基因遺傳研究

水稻葉形控制基因的相關研究對于剖析水稻葉形性狀的分子遺傳機理具有重要的研究價值，并且通過對葉形控制基因的定位和克隆，應用分子標記輔助選擇等技術手段，能夠有效聚合有利基因，培育出包含葉形在內的眾多優良農藝性狀的水稻新品種.近年來，水稻葉形控制基因遺傳研究領域已取得了較大的進展，因此，接下來較為詳細地綜述了當前水稻葉形控制基因遺傳分析和葉形控制基因/QTLs定位研究進展情況，篩選并舉例陳述一些已克隆的葉形性狀控制基因及其功能，以期為將來葉形控制基因挖掘與分析和育種研究提供參考.

2.1 葉形控制基因遺傳分析

已有遺傳研究結果表明，水稻葉形相關性狀，如葉長、葉寬、葉面積、葉卷曲度、葉傾角等都顯示為典型的數量性狀，且易受到生長環境的影響[21-22].夏仲炎[23]和馬達鵬等[24]報道了粳稻劍葉長、葉寬和葉面積等性狀是由微效多基因控制的數量性狀，且具有較高的遺傳力.晏月明等[25]研究了11個秈稻雜種劍葉性狀的遺傳特點，認為劍葉長、寬和葉面積至少受2對基因控制，其遺傳力為60%～90%.曾建平[22]檢測到控制水稻葉形性狀相關QTLs位點44個，有7個QTLs的貢獻率大于15%，只有1個QTLs的貢獻率超過20%，因而所研究的性狀都為典型的數量性狀，由多個微效基因控制.蔡晶[26]分別以日本晴、TN1、II-32B與田間自主發現的突變體為親本，利用F2代分離群體，分別對劍葉的長、寬性狀進行了遺傳分析.結果表明：在卷葉/日本晴的F2群體中，突變體的卷葉性狀應由一個不完全顯性基因控制；在超長劍葉/TN1的F2代群體中，超長劍葉可能是由一個不完全顯性基因控制；通過超寬劍葉突變體分別與日本晴、TN1和II-32B構建的F2代群體的遺傳分析表明，該超寬劍葉性狀表現為連續變異，受多基因控制.

2.2 葉形控制基因及QTLs定位研究進展

迄今為止，國內外的研究者利用各種不同類型的遺傳群體，已實現較多的葉形性狀QTLs定位及部分基因的克隆.根據www.Gramene.org網站提供的QTLs定位信息，目前已定位到較多水稻葉形性狀相關的QTLs，其中葉長112個、葉寬111個、葉面積39個、葉卷曲度39個、葉傾角27個等.

2.2.1 葉長基因及QTLs定位研究進展

水稻葉片(倒一葉、倒二葉、倒三葉)長度是受多基因控制的復雜數量性狀.根據國家水稻數據中心網站 www.ricedata.cn 公布的數據，目前已成功克隆了控制水稻葉長性狀相關基因16個，分別位于1,3,4,5,6,9,12號染色體上.Koumoto等[27]通過研究分蘗芽生長受到抑制的水稻單孽突變體moc2，發現這是由于Tos17逆轉座子插入到編碼胞質果糖-1,6-二磷酸酶(FBP1)的第4外顯子中，導致移碼而提前產生終止信號.moc2突變體是FBP1功能缺失突變體.在蔗糖合成途經中，胞質FBP酶活性缺失會導致蔗糖供應不足，很可能因此導致moc2突變體分孽芽生長受到抑制，進一步導致植株矮化，葉色淡綠，葉片短而窄，穗子小、穗粒數減少等性狀.Fang等[28]從EMS處理的粳稻品種中花11群體中分離得到了一個水稻莖部發育提前終止的突變體，命名為mini1.利用分離群體分組分析和圖位克隆方法，Mini1基因最終被精細定位在9號染色體上48.6 kb的區間內.序列分析表明在這個區域內有一個堿基G突變為A，導致表達的氨基酸由甘氨酸(Gly)突變為天冬氨酸(Asp).與野生型相比，mini1的莖尖分生組織(SAM)分裂停止，并導致地上部生長停止，而根部沒有明顯變化，葉片和葉鞘變短，葉尖枯萎，突變體在灌漿后一段時間停止生長并死亡.已克隆的Mini1基因與MOC2基因在分子作用機理上存在共通之處，都是通過抑制分蘗芽或莖尖生長，導致地上部生長停止，都作為控制葉長和葉寬的微效基因，參與到葉片大小形態建成過程中(見表1).

表1 葉長QTLs定位研究進展

2.2.2 葉寬基因及QTLs定位研究進展

水稻葉片(倒一葉、倒二葉、倒三葉)寬度也是由多基因控制的復雜數量性狀，國內外研究者通常將葉長和葉寬同時作為研究對象，因此已定位到的QTLs數目也與葉長比較接近.根據國家水稻數據中心網站 www.ricedata.cn 公布的數據，目前已成功克隆了控制水稻葉寬性狀相關基因28個，12條染色體上均有分布.Chen等[36]利用粳稻品種D50(窄葉)和秈稻品種HB277(寬葉)構建重組自交系，共鑒定到5個控制劍葉寬的QTLs.并將主效QTLsqFLW4精細定位在 RM17 483-RM17486 之間74.8 kb的區間內，該區間包含窄葉基因NAL1.nal1突變體相比野生型而言，葉片縱脈數目減少，葉片變窄，葉片長度則沒有差別，而倒3，4，5節間變短，倒1，2節間長度沒有差異，整體植株矮小.Li等[37]從T-DNA插入的轉基因水稻中分離出一株窄葉突變體nal9.突變體在整個生長時期都表現出窄葉、苗期葉片淺綠色、株高矮化、穗變小及分蘗增加等表型.遺傳分析表明，該突變體表型受單個隱性基因控制，并通過潮霉素抗性實驗表明突變并不是由于T-DNA插入引起.利用圖位克隆的方法分離到了NAL9基因，將NAL9基因初步定位在3號染色體上靠近分子標記RM156的位置.同時，基于秈稻和粳稻序列差異，設計RM156附近新的INDEL分子標記.通過染色體步移的方法，最終將NAL9基因定位在BAC片段OJ1212_C05上的分子標記V239B和V239G之間69.3 kb的范圍內(見表2).

表2 葉寬QTLs定位研究進展

2.2.3 葉面積基因及QTLs定位研究進展

水稻葉面積指數的大小直接影響到水稻的光合作用、蒸騰作用等各項生理活動和最終產量，是理想株型育種的重要指標之一.葉片大小包括了葉長、葉寬、葉厚、葉周長和葉面積等性狀[38]，但基因具有多效型，大部分調控葉長、葉寬的基因也影響到葉面積的大小.目前，已在除11號染色體以外的其他染色體上定位到了較多的葉面積QTLs，但有關葉面積調控基因的克隆卻鮮有報道.根據國家水稻信息中心網站公布的數據，只有2號染色體上的KRP1基因已被克隆.過量表達KRP1基因的轉基因植株表現出葉面積稍微變小，葉片稍微變短，葉表面細胞數減少但細胞變大，飽滿種子少，種子產量降低等性狀.表型分析表明,KRP1過表達的植株其發育的葉片中細胞分裂減少，但被細胞增大得以部分補償[39],具體見表3.

表3 葉面積QTLs定位研究進展

2.2.4 葉卷曲度基因及QTLs定位研究進展

水稻葉片的卷曲可分為內卷和外卷.卷葉的形成需要經過葉片模式建成、葉片極性建立及細胞特化等環節[41].卷葉發生的機制主要有2種：特化細胞的變異導致卷葉或者葉片泡狀細胞的改變引起葉片卷曲[38].例如，Zhang等[42]報道的SLL1突變體部分出現泡狀細胞異常，并且SLL1基因可通過調控葉片遠軸面厚壁組織細胞的程序性死亡從而調控葉片卷曲.又如CFL1基因在葉片特化表皮細胞處過表達，可使葉片角質層受損從而導致卷葉[43].

目前已克隆的水稻卷葉相關基因已有23個，除5號染色體以外，其他染色體上均有克隆到的基因(www.ricedata.cn).徐靜[44]篩選獲得一株水稻卷葉突變體erl1，從苗期到成熟期都穩定表現出葉色加深、葉片極度內卷，株型矮小等性狀.通過與秈稻品種TN1,ZF802,NJ06配制雜交組合，F1葉片全部為半卷葉，F2呈現“極卷葉∶半卷葉∶平展葉=1∶2∶1”的分離比，因而推斷該卷葉性狀為半顯性單基因控制的質量性狀.借助于圖位克隆的手段，將ERL1基因定位于水稻第12染色體上51 kb的物理區間內.Hibara等[45]通過分離水稻adl1內卷葉突變體，發現ADL1基因編碼一個半胱氨酸蛋白酶，通過促進恰當的表皮發育，在葉片和胚胎模式形成中發揮重要作用，并在整個胚胎、維管系統、葉原基、葉邊緣和SAM中等組織中都有較強表達，具體見表4.

表4 葉卷曲度QTLs定位研究進展

3 總結與展望

水稻是我國主要的糧食作物，隨著經濟社會的不斷發展，人口、環境壓力與日俱增，為了保障糧食安全，確保我國水稻的穩產、高產，唯有提高水稻的單產.葉片是水稻最主要的光合器官，且與蒸騰作用和抗逆性等生理功能密切相關，是水稻產量提升的關鍵要素.

3.1 水稻葉形基因在育種中的應用

從水稻葉形及其調控基因角度入手改良水稻的葉形、株型，利用分子標記聚合水稻優質葉形、生理活性相關的有利基因，結合目前日益發展的分子生物學研究手段，精準設計和改良水稻新品種，將株型改良與雜種優勢相結合，培育出新的性狀優異、產量提升明顯的水稻新品種，應用于生產實踐，這是當前最有效的促進水稻產量提升的方法之一.Sakamoto等[50]研究發現，利用對油菜素內酯(BR)不敏感或與BR信號傳導有關的葉片直立的矮稈突變體，可以大大提高種植密度，提高生物產量，其生物產量可比野生型增加50%.Chen等[51]培育出的高耐鹽性“海水稻”——海稻86(SR 86)通過全基因組測序與比較轉錄組分析，發現SR 86是一個相對古老的秈亞種，擁有42 359個獨有的高影響變異，并存在大量鹽誘導基因，這對于水稻耐鹽基因的挖掘與分析，以及更優異的耐鹽性水稻育種研究具有十分重大的研究價值.但在利用分子標記輔助選擇的方法改良現有的優異親本，將良好葉形基因導入到優異親本的過程中，須克服導入與優異葉形控制基因連鎖或者不連鎖的其他不利基因的問題，這樣才能夠行之有效地塑造理想葉形，提高水稻單產.

3.2 水稻葉形QTLs定位研究重、難點

水稻葉形相關性狀大多是由多個微效基因控制的數量性狀，目前已挖掘、定位和克隆所得的主效QTLs和葉形控制基因相對較少.并且基因具有多效型，同一個基因往往影響多種葉形的相關性狀，如LPA1基因是目前已克隆在3號染色體上的一個調控分蘗角度和葉角的基因，同時也參與調控水稻節間寬度與厚度，莖細胞壁的厚度，谷粒和葉片的長、寬及葉面積等性狀[50].QTLs定位易受遺傳背景和環境的影響[29]，因此有必要在不同環境條件下挖掘不同群體的QTLs.目前對于水稻葉形控制基因和QTLs的相關研究已取得了較大程度的進展，在不同環境和群體中都能檢測到的QTLs表明了它們的穩定表達，而另一些QTLs則只有在某些環境下或群體中才能被檢測到.另一方面，由于所使用的遺傳群體和親本材料遺傳背景的差異性，以及基因組覆蓋面、標記疏密程度和具體標記類型等方面的不同，QTLs定位結果往往難以直接比較，不利于進一步開展QTLs的精細定位和基因克隆.

目前葉形各性狀，各種多效基因之間組合而成的復雜調控網絡的剖析及相關分子遺傳機理研究相對較少.因此，葉形相關性狀的QTLs定位和基因克隆研究仍需更進一步地深入挖掘與分析，借助于日益發展的分子生物學與基因組學的研究手段與方法，有望實現新的突破.