補腎活血方對宮腔粘連子宮內膜ER、PR表達的影響*

劉碧星 賴玉華 羅頌平 陳 鵬 陳忠生

由于各種原因引起子宮內膜基底層受損，進而導致子宮壁相互粘連的病理現象稱為宮腔粘連。宮腔粘連對育齡期婦女生育能力危害極大，臨床主要表現有月經量少或閉經，不孕及習慣性流產。普通人群中宮腔粘連發生率為1.5%[1]，而不孕癥患者中發生率高達13%[2]。宮腔鏡下粘連分離術已被證實為一種安全有效的治療方法，但仍存在較高的復發率。宮腔粘連分離術后再粘連的預防是生殖醫學界的難題，也是研究的熱點。 有文獻顯示中醫補腎活血方可減少宮腔粘連術后復發的幾率，但是其原理尚未明確。筆者通過補腎活血方聯合雌孕激素用于宮腔粘連電切術后，研究宮腔粘連患者術前、術后雌孕激素受體及細胞增殖蛋白 Ki67的表達，擬了解補腎活血方的作用機理，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料本研究選擇婦科住院部符合納入標準的宮腔粘連患者22例，術前均對其進行中國宮腔粘連診斷分級評分，測定增殖期內膜厚度，所有患者均行宮腔鏡下粘連電切術+上環術，并在術中鉗取少許內膜組織測定ER、PR、Ki67，術后給予雌孕激素序貫治療3個月。22例患者按隨機數字表法分為治療組10例及對照組12例。2組年齡、孕產次、人流清宮次數、術前增殖期內膜厚度、術前評分等一般資料比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 診斷標準有宮腔操作手術史、月經過少或閉經，宮腔鏡下診斷為宮腔粘連者[3]。

1.3 納入標準1)宮腔鏡下診斷為宮腔粘連，擬行宮腔粘連電切術的患者診斷分級標準參考2015年中華醫學會婦產科分會《宮腔粘連臨床診療專家共識》[3]。2)根據最新的中國宮腔粘連診斷分級評分≥9分，評分標準見表1。3)年齡20～40歲。

表1 宮腔粘連評分標準

注：輕度：總分0～8分；中度：總分9～18分；重度：總分19～28分

1.4 方法

1.4.1 治療方法本研究采用前瞻性試驗性設計方案，遵循隨機對照的原則進行。對所有納入研究的患者進行術前評分及測定增殖期子宮內膜厚度，并行宮腔鏡下粘連電切術+上環術，術中取少許內膜組織測定ER、PR、Ki67的表達,術后進行3個月的藥物治療，藥物治療后在月經干凈2～7 d再次行宮腔鏡檢查并取環，再次評分及測定增殖期內膜厚度，并取少許內膜組織再次測定其ER、PR、Ki67的表達水平。治療組10例:給予補腎活血方+雌孕激素序貫治療。補腎活血方在非月經期口服，每日2次，連續3個周期。戊酸雌二醇2 mg每日2次×21 d(月經第5天開始服)+地屈孕酮10 mg每日2次×10 d(月經第16天開始服)，連續3個周期。對照組12例：給予雌孕激素序貫治療。戊酸雌二醇2 mg每日2次×21 d(月經第5天開始服)+地屈孕酮10 mg每日2次×10 d(月經第16天開始服)，連續3個周期。其中補腎活血方組成：菟絲子20 g，枸杞子15 g，覆盆子15 g，車前子(包煎)10 g，茺蔚子15 g，當歸10 g，赤芍10 g，熟地黃10 g，三七10 g，丹參10 g，香附10 g，淫羊藿10 g。戊酸雌二醇片1 mg×1盒,輝瑞制藥; 地屈孕酮片10 mg×1盒,雅培制藥。

1.4.2 觀察指標增殖期子宮內膜厚度、宮腔粘連評分、ER、PR、Ki67。

1.4.3 標本采集及結果判斷標準標本采集：手術時機選擇在月經干凈后2～7 d，閉經者手術時間不受限制。研究員于術中取適量粘連組織旁的子宮內膜組織，對于無明顯子宮內膜組織的重度患者取適量粘連組織。取出宮腔組織用福爾馬林固定，石蠟包埋，切片厚3～4 μm，置(60±5)℃的烤箱中烤干(約2 h)。 免疫組織化學檢測：雌孕激素受體檢測試劑盒(Dako，即用型)，克隆號為EP1及PgR636；兔抗多克隆抗體Ki67 Ab(NovocastraTM，即用型)，克隆號為MIB-1；PBS緩沖液(pH 7.4)、 0.01M檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)、EDTA抗原修復液(pH 8.0)、3%H2O2阻斷內源性過氧化物酶以上溶液由中杉金橋公司提供，并按其說明書配制使用。檢測系統：Dako EnVisionTM檢測系統。顯色劑：Dako REALTM DAB顯色劑。對標本預處理后進行脫蠟及抗原修復，按順序取出切片，擦干組織周圍的水，用免疫組化筆在組織塊周圍(離組織邊緣3 mm左右)畫一圓圈，放回蒸餾水中；相同方法依次對所有組織切片畫圈；移入PBS緩沖液沖洗3 min×3次；按順序取出待測組織切片，甩去玻片上多余的PBS，滴加相應抗體，放入孵育盒內；抗體的量以充分覆蓋組織塊為度，陰性對照片上滴加PBS緩沖液；切片加完抗體后，蓋上孵育盒蓋子，37℃孵育50 min；滴加PBS緩沖液沖洗，沖洗3 min×3次；將所有組織切片按順序逐一滴加二抗(Dako EnVisionTM檢測系統)，抗體的量以充分覆蓋組織塊為度，孵育盒中室溫孵育30 min；滴加PBS緩沖液沖洗，沖洗3 min×3次；顯色、復染、封片，取20 μl DAB原液和1 ml底物緩沖液混合均勻，一般使用前1 h內配制，按順序逐一取出組織切片，甩干組織周圍的多余的PBS，滴加已配好的DAB顯色液顯色2～5 min，同時在顯微鏡下觀察，根據染色強弱及背景顏色適時終止顯色。判斷標準：研究者在顯微鏡(400×)下觀察切片，根據陽性細胞所占比例及陽性細胞染色強度判定，在每個切片中選擇5個高倍鏡視野。 ER、PR結果判定標準：強陽性(+++，棕黃色細胞≥60%或深褐色細≥30%)，中度陽性(++，淺黃色細胞≥50%或20%≤棕黃色細胞，弱陽性(+，淺黃色細胞<50%或棕黃色細胞<20%)，陰性(-，無染色)。 Ki67結果判定標準： 陽性細胞數0～5%為(-)，6%～25%為(+)， 26%～50%為(++)，≥51%為(+++)。強陽性為4分，中度陽性為3分，弱陽性為2分，陰性為1分。

1.5 統計學方法全部數據采用χ2檢驗、t檢驗或Fishers Exact Test Pearson 相關分析檢驗，P<0.05 為差異有統計學意義，分析采用SPSS 10.0 統計軟件進行。

2 結果

2.1 2照患者組年齡、孕產次、人流清宮次數2組間年齡、孕次、產次和人流清宮次數均無統計學差異(P<0.05)。見表2。

表2 2組患者臨床資料比較 (例，

2.2 2組患者治療前后ER、PR、ki67表達評分比較2組間ER、PR、K-67表達治療前差異不顯著(P>0.05)，治療后兩組上述各指標均較治療前顯著上升(P<0.05)。除Ki67外，治療后治療組ER、PR評分均顯著高于對照組(P<0.05)。見表3。

2.3 2組患者治療前后內膜厚度、評分比較2組治療后內膜厚度均較治療前顯著上升(P<0.05)，評分顯著下降(P<0.05)，且治療組上述情況顯著優于對照組(P<0.05)。見表4。

表3 2組患者治療前后ER、PR、Ki67表達評分比較 (例，

注：與治療前比較(治療組：tER=2.741，P=0.013；tPR=2.685，P=0.015；tKi67=2.173，P=0.043；對照組：tER=2.137，P=0.044；tPR=3.130，P=0.005；tKi67=3.298，P=0.003),1)P<0.05；與對照組比較(tER=2.596，P=0.017；tPR=2.099，P=0.049)，2)P<0.05

表4 2組患者治療前后內膜厚度、評分比較 (例，

注：與治療前比較(治療組：t內膜厚度=3.327，P=0.004；t評分=6.870，P=0.000；對照組：t內膜厚度=3.426，P=0.002；t評分=7.179，P=0.000)，1)P<0.05；與對照組比較(t內膜厚度=2.265，P=0.035；t評分=2.171，P=0.042)，2)P<0.05

3 討論

宮腔粘連嚴重危害女性的生育力，并且治療后存在較高的復發率，其中重度粘連術后復發率可高達62.5%[4]。預防宮腔粘連術后復發目前是醫學難題，其中治療方法也在不斷推陳出新，而各家有各家的治法和經驗。總體上來說目前治療方法有以下3個方面：1)通過放置宮內節育器、宮腔球囊、防粘劑及防粘連膜等直接阻礙子宮內膜前后壁創面的接觸；2)通過用雌孕激素周期模仿正常人的激素改變來刺激殘余的子宮內膜生長并使術后創面重新上皮化；3)通過羊膜移植、子宮內膜干細胞移植等方法，然而這些方法尚在研究階段，沒有在臨床上廣泛應用。通過物理屏障防止宮腔粘連只是權宜之計，當物理屏障去除，粘連可能再次發生。而在臨床工作中我們發現大劑量的雌激素也并不能達到理想的效果，經過激素治療患者的月經量并沒有增加，內膜沒有增厚，生育問題依舊無法解決。 筆者假設大劑量雌孕激素無法起效的原因可能是宮腔粘連內膜損傷后導致雌孕激素受體表達下降，雌孕激素無法與足夠的受體結合，進而無法達到相應的生物效應。

張娟等[5]應用免疫組化SP法檢測30例子宮內膜各層中ER、PR的表達，結果提示功能層、基底層和淺肌層中ER和PR蛋白表達水平是依次降低的，由此可能提示子宮內膜不同損傷部位的 ER和 PR表達并不一致。杜艷芳等[6]檢測宮腔粘連組(實驗組)和非宮腔粘連組(對照組)子宮內膜組織中ER、PR和NF-кB的表達水平，結果顯示非宮腔粘連組子宮內膜中 ER和PR的表達均高于宮腔粘連組，在輕度粘連組的表達高于重度粘連組(P<0.05)。ER在輕度粘連組中的表達也高于中度粘連組(P<0.05)。由于ER和 PR主要在子宮內膜上皮細胞和間質細胞中有表達，一旦破壞了子宮內膜基底層，殘留的子宮內膜減少，ER和 PR的表達就相應降低，而雌孕激素對靶細胞的效應強弱與靶細胞中雌孕激素受體水平高低密切相關， ER和 PR的表達下降直接影響子宮內膜在雌孕激素作用下的增生和修復，從而影響宮腔粘連的治療效果。而Ki67是一種細胞增殖性抗原，維持細胞循環的新蛋白，被認為是細胞增殖的一個重要標志[7]。目前關于Ki67的研究主要集中在腫瘤學方面。宮腔粘連患者內膜功能層受損，內膜菲薄，是否與細胞增殖障礙有關呢？ 因此筆者在研究中將Ki67的表達加入本次研究的范疇。

本研究結果顯示治療前2組間ER、PR、Ki67表達差異不顯著(P>0.05)，治療后2組上述各指標均較治療前顯著上升(P<0.05)。除Ki67外，治療后治療組ER、PR評分均顯著高于對照組(P<0.05)。2組治療后內膜厚度均較治療前顯著上升(P<0.05)，評分顯著下降(P<0.05)，且治療組上述情況顯著優于對照組(P<0.05)。研究結果顯示補腎活血方及雌孕激素能均能提高雌孕激素受體及細胞增殖蛋白Ki67的表達，且加用補腎活血方比單用雌孕激素對提高雌孕激素受體的表達、增加術后增殖期內膜厚度及降低宮腔粘連評分的效果更優，而2組治療后細胞增殖蛋白Ki67的表達沒有明顯差異。

中醫古籍中并無“宮腔粘連”的記載，然宮腔粘連病位在胞宮，多是手術時胞宮、胞脈受損，腎精受損，沖任氣血不足,精血俱損，瘀血邪毒內蘊，胞脈閉塞所致，結合其月經過少、閉經的臨床表現，究其病因病機,多責之于腎虛血瘀。《證治準繩·女科·調經門》指出：“經水澀少,為虛為澀,虛則補之,澀則濡之。”故補腎活血為本病的治療大法。本病病機虛實錯雜，既不可妄行攻破，以免重傷精血，又不可一味填補，使瘀血不去，新血難生。本研究中補腎活血方由菟絲子、枸杞子、覆盆子、車前子、茺蔚子、當歸、赤芍、熟地黃、三七、丹參、香附、淫羊藿組成，該方以菟絲子和枸杞子為君藥，補肝腎之陰，覆盆子、熟地黃滋精生血為臣藥，淫羊藿溫補腎陽，助陰長，車前子微寒輕瀉腎中虛火為佐藥，茺蔚子入血分，善活血行氣，祛瘀通徑，香附行氣解郁，疏肝通經，當歸、赤芍、三七、丹參活血化瘀，助氣血運行，全方補中有通，攻補兼施，使精氣盛，沖任充，瘀血去，新血生，血海自能滿溢。學者們對補腎活血中藥的機理也從現代醫學的角度進行了相關的研究。陳媛媛等[8]的研究認為補腎中藥具有類雌激素樣作用，能調整腎-天癸-沖任-胞宮軸，改善盆腔內環境，促進子宮內膜腺體和間質的增殖與修復，從而促進子宮內膜雌孕激素受體的表達，以達到治療宮腔粘連的目的。賈金英等[9]認為活血化瘀藥物可以促進微循環功能,改善宮腔內組織缺血狀態,促進吞噬細胞的吞噬功能；能將纖維蛋白清除使間質細胞再生修復,從而促進局部瘀血的吸收，結締組織松解而達到生理性恢復粘連的目的。

綜上所述，補腎活血方聯合雌孕激素可有效預防宮腔粘連電切術后再粘連的發生，改善宮腔環境，增加內膜厚度，其作用機制可能通過提高雌孕激素受體的表達來完成。但該研究樣本量較少，需要更多的樣本支持及動物實驗研究來進一步證明。