類風濕關節炎中醫證型與ＩＬ－１７及其相關炎癥因子表達的研究

侯雷 元曉龍 曾蘋

【摘 要】 目的：探討類風濕關節炎患者外周血中白細胞介素17（IL-17）及其相關炎癥因子的表達水平與不同中醫證型的相關性。方法：選取符合中醫診斷標準的濕熱痹阻證、寒濕痹阻證、痰瘀痹阻證、肝腎虧虛證的RA患者及健康對照組各30例作為研究對象，采用流式細胞術檢測外周血中IL-17細胞的表達，ELISA法檢測血清中IL-4、IFN-γ、IL-6、IL-17、IL-22、IL-23和TGF-β1的濃度。結果：流式細胞術結果顯示：與健康對照組比較，RA各證型IL-17細胞的表達率均顯著升高（P<0.05）;且濕熱痹阻證的表達率最高（P<0.05）;ELISA法結果顯示：IL-6、IL-17、IL-22、IL-23、IFN-γ的濃度由高到低依次為濕熱痹阻證、寒濕痹阻證、痰瘀痹阻證、肝腎虧虛證，而IL-4、TGF-β1的濃度則與前相反，各證型間兩兩比較有顯著統計學差異（P<0.05）。結論：RA不同中醫證型患者血清中IL-17及其相關炎癥因子表達水平不同，其中濕熱痹阻證RA患者血清中的促炎因子表達水平最高。

【關鍵詞】 類風濕關節炎;中醫證型;IL-17;炎癥因子

【中圖分類號】R593.22 【文獻標志碼】 A【文章編號】1007-8517（2019）3-0081-06

Abstract：Objective To investigate the correlation between the expression levels of interleukin-17（IL-17）and its related inflammatory factors in peripheral blood of patients with rheumatoid arthritis（Rheumatoid arthritis，RA）and different TCM syndromes. Methods Thirty patients with RA and healthy controls who were in accordance with the diagnostic criteria of TCM，such as dampness and heat stasis syndrome，cold dampness and stasis syndrome，phlegm stasis syndrome，liver and kidney deficiency syndrome，were selected as the study subjects. Flow cytometry was used for detection. The expression of IL-17 cells in peripheral blood was detected by ELISA. The concentrations of IL-4，IFN-γ，IL-6，IL-17，IL-22，IL-23 and TGF-β1 in serum were detected by ELISA. Results The results of flow cytometry showed that the expression rates of IL-17 cells in RA were significantly higher than those in healthy controls（P<0.05），and the expression rate of damp-heat syndrome was the highest（P<0.05）. The results of ELISA showed that the concentrations of IL-6，IL-17，IL-22，IL-23 and IFN-γwere from high to low，followed by dampness and heat stasis syndrome，cold dampness and stasis syndrome，and stagnation syndrome. Liver and kidney deficiency syndrome，while the concentration of IL-4 and TGF-β1 was opposite to the former，and there was a statistically significant difference between the two syndromes（P<0.05）. Conclusion The expression levels of IL-17 and its related inflammatory factors in serum of patients with different TCM syndromes are different. The expression of proinflammatory cytokines in serum of patients with damp-heat stagnation syndrome is the highest.

Keywords：rheumatoid arthritis;TCM syndrome;IL-17;inflammatory factor

類風濕關節炎（Rheumatoid arthritis，RA）是一種以侵犯關節及關節周圍軟組織為主要特征的全身性自身免疫病。RA在全球的患病率為0.5%～1.0%，是臨床常見的難治性疾病，嚴重影響著患者的生活質量[1-2]。目前RA發病機制仍不清楚，近來研究發現RA的發病與體內白介素17（interleukin 17，IL-17）的表達有關[3-4]。IL-17是近年來新發現的一個白介素家族成員，其參與了RA的發病及病情進展，主要由Th17細胞分泌而產生，具有強大的致炎作用，在RA的發病及病情進展過程中發揮重要作用，成為近年來研究的一個熱點[5-7]。IL-17具有很強的促炎作用，能誘導IL-6、IL-22、IL-23等炎癥因子的產生，加強炎癥的表達，而這些炎癥因子反過來又能進一步促進Th17的活化[8]。Th1細胞主要產生干擾素γ（interferon γ，IFN-γ）等細胞因子，可以抑制Th17細胞，從而起到抗炎的作用;但IFN-γ的促炎效應及抑炎效應均有報道，故其屬于促炎因子還是抗炎因子仍存在一定的爭議[9]。調節性T細胞（regulatory T cells，Treg）主要產生IL-4、轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）等抗炎因子，在調節免疫紊亂，維持免疫耐受等方面發揮作用[10-11]。

RA屬中醫“痹證”、“歷節”、“尪痹”、“白虎病”等范疇。有研究發現不同中醫證型的RA患者，其在年齡、病程、地域、實驗室檢驗及檢查等方面存在差異[12-13]，但RA患者IL-17及其相關炎癥因子與中醫證型之間關系的研究卻寥寥無幾。因此，本研究通過檢測RA不同中醫證型患者血清中IL-17及其相關炎癥因子表達水平，探討IL-17及其相關炎癥因子與RA中醫證型之間的內在聯系，以期為RA的臨床辨證分型及治療提供參考依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 健康對照組來源于貴陽中醫學院第二附屬醫院體檢中心，已排除高血壓、糖尿病等長期慢性疾病，且實驗室檢測各項指標均在正常范圍的健康志愿者外周血標本30例，其中男性11例、女性19例，年齡18～60歲，平均年齡（46.25±14.55）歲。選取2017年6月至12月在貴陽中醫學院第二附屬醫院風濕免疫科住院RA患者120例，其中男性9例、女性111例，年齡21～70歲，平均年齡（52.32±10.17）歲，病程1個月至26年，平均病程（59.73±11.28）月。

1.2 診斷標準 120例RA患者均符合2010年ACR/EULAR中對RA的診斷標準[14]，并根據《中藥新藥臨床研究指導原則（試行）》[15]將RA患者分為濕熱痹阻、寒濕痹阻、痰瘀痹阻、肝腎虧虛4個證型各30例。

1.3 納入標準 符合RA西醫診斷標準和中醫診斷標準;年齡在18～70歲的患者;未伴有其它影響治療和檢測指標的疾病;近3個月未應用非甾體抗炎藥、慢作用抗風濕藥、糖皮質激素及免疫抑制劑治療;愿接受檢測治療者，并簽訂知情同意書。

1.4 排除標準 不符合納入標準者;嚴重心腦肝腎功能不全及伴隨其它惡性腫瘤者;患者不能合作者。

1.5 實驗試劑 PharmingenTM FITC Mouse Anti-Human CD3（美國BD公司，批號：5320730）;PharmingenTM PerCP-CyTM5.5 Mouse Anti-Human CD8（美國BD公司，批號：7096834）;PharmingenTM Leukocyte Activation Cocktail，with BD GolgiPlugTM（美國BD公司，批號：7030717）;PharmingenTM Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human IL-17A（美國BD公司，批號：7132681）;Fixation/Permeabilization Solution Kit RUO（美國BD公司，批號：6292704）;人白介素4（IL-4）酶聯免疫ELISA試劑盒96T（武漢華美生物科技有限公司，批號：N26015213）;人白介素6（IL-6）酶聯免疫ELISA試劑盒96T（武漢華美生物科技有限公司，批號：N26011217）;人白介素17（IL-17）酶聯免疫ELISA試劑盒96T（武漢華美生物科技有限公司，批號：N26015431）;人白介素22（IL-22）酶聯免疫ELISA試劑盒96T（武漢華美生物科技有限公司，批號：N27147789）;人白介素23（IL-23）酶聯免疫ELISA試劑盒96T（武漢華美生物科技有限公司，批號：N28015215）;人干擾素γ（IFN-γ）酶聯免疫ELISA試劑盒96T（武漢華美生物科技有限公司，批號：N26011127）;人轉化生長因子β（TGF-β）酶聯免疫ELISA試劑盒96T（武漢華美生物科技有限公司，批號：N24015112）。

1.6 實驗儀器 臺式低速離心機（長沙平凡儀器儀表有限公司，TDL8M）;BD FACSCantoTM II型流式細胞儀（美國BD公司，V33947300248）;電熱恒溫水浴箱[北京醫療設備廠，（S）HHW21];無菌流式管（貴州泰思騰生物科技有限公司，922746）;CO2培養箱（上海華連醫療器械公司，DH25000）;酶標分析儀（深圳市凱特生物醫療電子科技有限公司，YZB/粵0198-2012）;洗板機（深圳市凱特生物醫療電子科技有限公司，KWP-100A）。

1.7 外周血淋巴細胞（PBMC）中IL-17表達檢測 采用流式細胞術檢測。取2mL新鮮抗凝血與PBS液2mL混勻，加入4mL人淋巴分離液中，2000r離心20min，吸取乳白色單核細胞層即為PBMC，加入1mLPBS液洗滌1次，配置250μLPBMC;加入250μL RPMI 1640細胞培養液，加入250xBD PharmingenTM Leukocyte Activation Cocktail， with BD GolgiPlugTM （刺激阻斷劑）2μL，震蕩混勻，放入37℃ 5%CO2培養箱4～6h;加入20μL BD PharmingenTM FITC Mouse Anti-Human CD3及5μL BD PharmingenTM PerCP-CyTM5.5 Mouse Anti-Human CD8，混勻，室溫避光30min;加入Fixation/Permeabilization Solution Kit RUO（破膜劑）1mL，室溫避光30min;加入PBS液1mL，1500r離心5min，棄上清;加入PBS液1mL，將細胞懸液分為兩份，分別加入20μL BD PharmingenTM Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human IL-17A及Alexa Fluor 647 Mouse IgG1 K Isotype control，4℃避光孵育30min;再加入1mL流式染色緩沖液洗滌1次，1500r離心5min，棄上清;加入PBS液500μL重懸后上機檢測，用流式細胞儀分析外周血CD3+CD8-IL-17+表達的百分率。

1.8 血清IL-6、IL-17、IL-22、IL-23及IFN-γ的水平檢測 采用ELISA法檢測。RA患者及健康對照組清晨空腹抽取外周靜脈血，離心后取血清，按照ELISA試劑盒說明書上的步驟檢測血清IL-6、IL-17、IL-22、IL-23及IFN-γ的濃度。