番茄種子消毒方法探究

劉昊,楊雨晴,邵一飛,高偉,陳永臣,姚宇峰

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番茄種子消毒方法探究

劉昊1,楊雨晴1,邵一飛1,高偉2*,陳永臣1,姚宇峰2*

1. 北京林業大學生物科學與技術學院, 北京 100083 2. 北京林業大學理學院, 北京 100083

番茄種子表面常常帶有病原微生物，故在培養番茄無菌苗時，需要進行消毒。傳統番茄種子的消毒劑是氯化汞，而其較大的毒性和消毒原理限制其在實驗室及實際生產上的應用。因此，本研究開發出一套新的采用無毒或低毒試劑的消毒方法來制備番茄無菌苗，從而消除重金屬離子對蛋白質的變性作用，并排除雜菌污染，進而為探究蛋白類物質對番茄的促生作用做前期實驗方法的研究鋪墊。對氯化汞、次氯酸鈉和過氧化氫三種消毒劑采用正交實驗，選取各自合適的濃度和時間梯度聯合洗衣粉和75%乙醇消毒效果進行最佳消毒條件的摸索。結果表明，20%次氯酸鈉消毒5 min以及8%次氯酸鈉消毒+1%吐溫20消毒1 min的消毒效果較好，但吐溫20對幼苗的苗重有一定的抑制作用。運用單因素實驗設計對正交實驗結果進行驗證和進一步摸索消毒條件，結果表明，次氯酸鈉消毒對種子萌發率影響不大，次氯酸鈉濃度在10%~40%的差異不顯著，故最佳的消毒方式為10%次氯酸鈉消毒5 min。通過蛋白質溶液進行消毒條件的驗證，最終表明，建立的番茄種子消毒方法可以用于研究活性物質對番茄的生理作用，且消毒效果較好。

種子消毒; 番茄

番茄（）作為一種模式植物，被用于研究植物生理、發育、遺傳等多項領域。番茄種子表面常常帶有病原微生物，被認為是許多作物病害發生的初侵染源[1,2]，所以在培養番茄無菌苗時，需要先進行消毒。在傳統番茄種子消毒的方法中，常使用氯化汞。然而氯化汞處理后種子萌發時間晚，且硝酸銀和氯化汞處理會導致番茄苗的向地性消失[3]。氯化汞較大的毒性和其消毒原理限制了其在實驗室及實際生產中的應用。從文獻角度來看，次氯酸鈉、過氧化氫和乙醇等是常用的消毒劑。然而次氯酸鈉滅菌時間長，效果不夠理想，但是從萌發率和污染率綜合考慮認為3～4%次氯酸鈉的效果較好[4,5,6]。由于番茄種子表面有微絨毛，不易消毒徹底。可以采用加入吐溫20的方法提高效果，此外，在培養過程中，還可以采用添加蔗糖、無機鹽等方法促進壯苗的形成[7]。

本研究采用三因子三水平正交實驗設計，減小工作量，增大探索范圍，對氯化汞、次氯酸鈉和過氧化氫三種消毒劑進行條件摸索。采納文獻報道的最佳條件作為中間水平，氯化汞處理作為陽性對照，滅菌水處理作為陰性對照；且一并探索最佳的氯化汞處理條件。

本研究旨在探索一套采用無毒或低毒試劑的化學消毒方法并適用于番茄種子消毒的實驗方法，既消除重金屬離子對蛋白質的變性作用，也可排除雜菌對番茄的作用，并為探究蛋白類物質對番茄的促生作用做前期實驗方法的研究鋪墊[2]。

1 材料與方法

1.1 材料

市面購買的佳紅5號番茄種子；挑選無霉變的種子，并隨機分組。

1.2 實驗方法與設計

1.2.1 實驗方法

1.2.1.1 番茄種子培養方法培養介質選用濾紙或1.3%的瓊脂溶液；在自然濕度下，28 ℃全光照培養。通過照度計（型號TA8131，產自中國蘇州特安斯電子有限公司）測量光照情況，光強范圍為365~665 Lux，接受光照距離251 mm~324 mm。

1.2.1.2 番茄種子消毒方法稱取0.7~0.8 g番茄種子（通常0.7~0.8 g質量的佳紅5號番茄種子約為25粒），置于2 mL離心管中，加入1 mL洗衣粉溶液，震蕩約10次，用移液器吸出液體，更換槍頭注入1 mL滅菌蒸餾水，震蕩充分，用移液器吸出液體，重復4~5次；再加入1 mL 75%乙醇，消毒30 s，用移液器吸出液體，更換槍頭，加入1 mL滅菌蒸餾水，如上述沖洗4~5次；加入消毒劑處理，如需加入吐溫20，則優先加入吐溫20溶液；再用滅菌水沖洗4~5次；最后統一加入1 mL滅菌水，離心管置于50 ℃水浴鍋浸種15 min。流程見圖1。

圖1 種子消毒流程圖

1.2.2 測定指標每日監測污染率、萌發率兩項指標，并在萌發率穩定三天后測定苗總重，其中污染的種子可能萌發也可能未萌發。各指標計算方法如下：污染率（%）=污染數（個）/接種數（個）*100%；萌發率（%）=萌發數（個）/接種數（個）*100%。

1.2.3 實驗設計

1.2.3.1 不同介質對番茄種子萌發的影響將0.6~0.7 g種子（約25~30粒）接種于濾紙或1.3%瓊脂培養基上，每種處理進行兩組重復，每天記錄萌發率及污染率，萌發率穩定3 d后對莖長和根長做測量并記錄，并實時記錄培養過程中的定性情況。用滅菌水浸種作為對照，水面稍沒過種子即可。

1.2.3.2 不同消毒劑、消毒劑濃度、消毒時間及吐溫20含量對番茄種子消毒效果的影響采用三因子三水平正交實驗設計，各組水平依消毒劑種類不同而定。每種處理接種約10粒，重復3次。每天統計各組萌發率，3 d后，對總萌發質量做測量并記錄。對照1為用滅菌水代替消毒劑，其余處理同其他實驗組，對照2為所有處理均改用滅菌水。三種消毒劑的正交實驗因子水平表如表1。

1.2.3.3 驗證實驗采用單因素隨機區組實驗設計，對正交實驗所得的最優消毒組合進行實施，并對其中一個因素進行三水平梯度單因素實驗，并與空白對照組進行比較，檢驗該最佳配比的可靠性。

1.2.3.4 番茄種子表面觀察利用體視顯微鏡觀察并拍照干燥的蒸餾水和吐溫20溶液震蕩前與蒸餾水和吐溫20溶液震蕩后的對比狀態下番茄種子的表面情況。以解釋吐溫20溶液對消毒過程的影響。

1.2.3.5 實例驗證實驗將本實驗室分離純化得到的一種能夠促進植物根系生長的蛋白質處理最佳方法消毒的番茄種子，觀察其消毒效果及消毒是否對蛋白質的功能有所影響。

表 1 三種消毒劑的正交實驗因子水平表L9(34)

備注：陰性對照1：采用滅菌水代替消毒劑，其余與實驗組處理一致；陰性對照2：完全滅菌水處理。

Note: Negative control 1: using sterile water instead of disinfectants and the rest is the same as experimental group; Negative control 2: completely sterile water treatment

1.3 數據處理方法

應用DPS v7.05版數據處理系統進行實驗設計、數據處理。多重比較方法均采用LSD法，種子萌發率、污染率均采用反正弦平方根數據轉換處理。應用matlab 7.1進行作圖。

2 結果與分析

2.1 培養介質對種子萌發效果的影響

從圖2和圖3可以看出，培養介質有利于番茄種子的萌發和污染率的降低。從表2來看，濾紙和瓊脂兩介質的不同對番茄種子萌發的影響不顯著；同時對番茄種子萌發后的莖長影響不顯著而對根長影響顯著，瓊脂更利于幼苗的根發育。此外，瓊脂作為介質有透明性好，柔軟易于根測量等優點。因此，使用瓊脂作為介質進行后續實驗更為恰當。

圖2 培養介質對種子萌發率的影響

圖3 培養介質對種子污染率的影響

表2 培養介質對種子的影響情況

備注：大寫字母表示1%極顯著水平，小寫字母表示5%顯著水平。

Note:The capital letter indicates the 1% extreme level, the small letter indicates the 5% significant level.

2.2 不同消毒劑、消毒劑濃度、消毒時間及吐溫20含量對番茄種子消毒效果的影響

從兩個對照組來看，采用洗衣粉和酒精處理對番茄種子的消毒效果有極顯著的提高。對照組1和對照組2的萌發率分別為77%和73%，污染率為37%和63%。且污染導致幼苗整體生長不佳。從表3幼苗質量的方差分析來看，洗衣粉和酒精處理能夠極顯著地提高番茄種子萌發后的幼苗質量。

從表4表5表6可見，氯化汞組的最佳組合為0.05%氯化汞+1%吐溫20消毒2 min；次氯酸鈉組的最佳組合為20%次氯酸鈉消毒5 min以及8%次氯酸鈉消毒+1%吐溫20消毒1 min；過氧化氫組的最佳組合為2%或者10%過氧化氫+1%吐溫20消毒10 min。從污染率而言，次氯酸鈉組和氯化汞組均無污染現象，從幼苗質量而言，次氯酸鈉組的整體效果優于氯化汞組和過氧化氫組，故采用次氯酸鈉組的結果進行驗證。此外，吐溫20對三種消毒劑的消毒效果均有促進作用，但與次氯酸鈉聯合使用時，會降低幼苗的質量，故在驗證時，采用20%次氯酸鈉消毒5 min。

表 3 對照組方差分析與字母表示法

表4 氯化汞組正交實驗結果

表5 次氯酸鈉組正交實驗結果

2.3 正交實驗驗證

從表7可見，用次氯酸鈉消毒和用滅菌水消毒對消毒結果的影響極顯著。次氯酸鈉消毒劑濃度對番茄種子的消毒效果影響不顯著。這與正交結果略有差異，但由于差異并不顯著，采用10%~40%次氯酸鈉均可。

表6 過氧化氫組正交實驗結果

表7 驗證實驗多重比較

2.4 番茄種子表面觀察

A為干燥條件下的番茄表面：可以看見番茄種子的表面遍布絨毛，這些絨毛會成為附著細菌和真菌的地點，且容易在液體消毒的過程中產生大量氣泡，阻礙了消毒劑與表面接觸，從而阻礙消毒劑作用于番茄表面。

B和C為滴加吐溫20與蒸餾水后的番茄表面情況：可以看見加入吐溫20的情況和加入蒸餾水的情況并無太大差異，顯微鏡下吐溫20的番茄表面氣泡略少于蒸餾水。

D和E為模擬消毒過程（離心管震蕩20 s）后的番茄表面情況：與滴加時的情況相近。

圖 4 種子消毒過程的觀察

2.5 實驗結果驗證

根據表8的實驗結果可知該蛋白對番茄的根長的作用呈低促高抑，方差分析表明抑制、促進作用差異極顯著。說明該方法對蛋白質促進番茄種子根長的作用不會有影響，可以用于研究蛋白質對番茄種子的作用。

表8 蛋白質功能實驗的多重比較

3 討 論

三種消毒劑在消毒過程中表現不同，但各有優劣。氯化汞的優點為消毒快、徹底、作用廣泛，用量少，物質穩定，保質期長；缺點是毒性大，對種子損傷大，不易處理，有劇毒，管制。次氯酸鈉的優點是消毒快、徹底、作用廣泛，毒性低；缺點是物質不穩定，有效物質濃度會降低、有機物會降低消毒效果、有一定的腐蝕性。過氧化氫的優點是無污染；缺點是消毒需要濃度高、有腐蝕性[5-9]。

由于氯化汞的消毒機理,故在研究外源性物質對幼苗的作用時,不能采用氯化汞做消毒劑。Mickai等首次報道分別采用0.05%氯化汞、5%或1%硫酸、0.5%磺胺乙汞三種消毒劑消毒番茄對幼苗無傷害作用，但本文中的實驗現象否定了該結論，并與魏麗麗等的氯化汞消毒后會使幼苗喪失向地性的結果一致。在實驗過程中，次氯酸鈉和過氧化氫均對種皮有褪色作用[3,10]，這與吳華等的實驗現象一致[11]。種皮在褪色透明后，清晰可見番茄種皮內部的子葉與胚的形態，但并不影響其萌發率。過氧化氫的氧化性能夠促使種皮腐蝕，使胚根容易伸出，在本研究中，過氧化氫組的萌發速度在各消毒劑組中是最快的，側面印證胡重怡等的實驗結論[12]。也說明過氧化氫作為消毒劑具有良好的開發潛力，有待進一步探索其條件。近年國外并無對番茄種子消毒的研究，但國外對種子的消毒更多采用次氯酸鹽，表明實驗室中采用次氯酸鹽消毒效果較好，可能是一種趨勢。結果也與之相符[13-15]。

吐溫20是一種非離子型表面活性劑，它使消毒劑與材料能夠充分接觸。番茄種子表面有大量的絨毛，在加入表面活性劑之后能夠加強消毒效果[7,16]。董飛等在研究大蔥無菌苗的培養消毒條件時，加入了吐溫20能夠明顯提高大蔥種子的萌發勢、萌發率，降低其污染率[16]；這與本文的探究結果相一致，但本研究中還發現加入吐溫20會降低番茄幼苗的苗重。

利用無菌苗進行后續實驗，可以避免微生物的影響：在研究一些物質對植物的作用或植物對某物質的吸收時，需要避免微生物對該物質的分解或避免微生物的代謝物質對植物的作用。或者在研究微生物與植物的相互作用時，需要避免其他微生物對該體系的影響，故需要無菌苗的制備[2]。

4 結 論

在本研究的探索范圍內，最佳的消毒方式為20%次氯酸鈉消毒5 min不加吐溫20。整體的消毒步驟為：洗衣粉清洗→滅菌水沖洗4~5次→75%乙醇消毒30 s→滅菌水沖洗4~5次→8%次氯酸鈉+5 min→滅菌水沖洗4~5次→50 ℃滅菌水浸種15 min。吐溫20對消毒劑的消毒效果有增強作用。

通過驗證實驗發現，次氯酸鈉的濃度對消毒效果沒有顯著性影響，但使用次氯酸鈉消毒和不使用差異極顯著。同時，本研究中發現，吐溫20有一定的增加消毒劑消毒效果的功效，但對番茄幼苗的生長有一定的抑制作用，而對萌發率沒有抑制作用。

[1] 楊華,崔元玗,孫曉軍,等.加工番茄種子帶菌檢測與種子消毒處理試驗研究[J].新疆農業科學,2005,42(5):345-348

[2] 葛體達,宋世威,姜武,等.不同甘氨酸濃度對無菌水培番茄幼苗生長和氮代謝的影響[J].生態學報,2009,29(4):1994-2002

[3] 魏麗麗,劉國軍,王瑞剛.表面消毒劑對番茄無菌苗生長及其內源IAA的影響[C].呼和浩特:培養創新型人才、推進科 技創新、推動轉變經濟發展方式——內蒙古自治區第六屆自然科學學術年會優秀論文集,2011

[4] 楊嵐,唐琳,劉建國,等.番茄種子兩種滅菌法效果評價[J].貴州醫藥,2008,32(1):26-28

[5] 劉思言,王丕武,關淑艷,等.番茄種子消毒方法及愈傷組織誘導的初步研究[J].河南農業科學,2012,41(3):113-115

[6] 唐琳,劉建國,馬欣榮.兩種滅菌方法對番茄種子滅菌效果的評價[J].種子,2008,27(9):17-18

[7] 吳志剛,宋明,王志敏,等.番茄組織培養中無菌苗培養條件的優化[J].中國農學通報,2006,22(4):335-337

[8] 魯黎明,安影.不同消毒劑對煙草種子消毒效果及萌發的影響[J].種子,2012,31(4):93-95

[9] 雷天翔,蔡曉劍,周黨衛,等.三種茄科植物種子無菌苗繁殖體系的初建[J].中藥材,2015,38(3):447-450

[10] Kasselaki AM, Goumas D, Tamm L,. Effect of alternative strategies for the disinfection of tomato seed infected with bacterial canker (subsp.)[J]. NJAS - Wageningen Journal of Life Sciences, 2011,58(3-4):145-147

[11] 吳華,高志鵬,陳高,等.不同消毒處理對豇豆種子無菌培養的效應[J].江漢大學學報:自然科學版,2015,43(5):389-392

[12] 胡重怡,鄭少清,陳興江,等.煙草無菌苗培養前的種子消毒技術研究[J].中國煙草科學,2007,28(2):45-46

[13] Lindsey BE, Rivero L, Calhoun CS,. Standardized Method for High-throughput Sterilization of Arabidopsis Seeds[J]. Journal of Visualized Experiments, 2017(128):1-7

[14] Mickail KY, Bishay F, Farag NS,. Tomato seed treatments and seed storage to control bacterial spot or scab[J]. Agricultural Research Review, 1970,48:323-327

[15] Siviero P. Tomato seed disinfection from bacteria and Tom MV[J]. Informatore Agrario, 1991,47(5):61-74

[16] 董飛,陳運起,劉世琦,等.種子消毒方法對大蔥無菌苗培養的影響[J].中國蔬菜,2011(18):74-76

Exploration for the Disinfectant Method of Tomato Seed

LIU Hao1, YANG Yu-qing1, SHAO Yi-fei1, GAO Wei2*, CHEN Yong-chen1, YAO Yu-feng2*

1.100083,2.100083,

There are pathogenic microorganisms on the surface of tomato seeds, so it is necessary to sterilize for cultivating the aseptic seedlings of tomato. The traditional disinfectant for tomato seed is mercuric chloride, but its toxicity and sterilization principle limit the application in the laboratory and practical production. Therefore, this study developed a set of new sterilization method by using non-toxic or low-toxic disinfectants in order to eliminate the denaturation effect of heavy metal ions on proteins and exclude the microbial contamination, thus preparing for the exploration of growth-promoting effect of protein on tomato. We used the orthogonal experiment, selected the suitable concentration and time gradient of three kinds of disinfectants, mercuric chloride, sodium hypochlorite and hydrogen peroxide and explored the best sterilization conditions with the combination of washing powder and 75% alcohol. Results show that 20% sodium hypochlorite sterilization 5 minutes or 8% sodium hypochlorite and 1% Tween20 sterilization 1 minutes is better, but Tween20 has certain inhibition to the weight of seedlings. Using the single factor experimental design to verify the results of orthogonal experiment and further explore the sterilization conditions, the results show that the sodium hypochlorite sterilization has little effects on seed germination rate and the concentration of sodium hypochlorite in 10% ~ 40% has no significant difference. So the best way of sterilization is 10% sodium hypochlorite sterilization 5 minutes. The verification of sterilization conditions by using protein solution finally indicates that this established tomato seed sterilization method can be used to study the physiological function of active substances to tomato and the sterilization effect is better.

Seed sterilization; tomato

S641.2

A

1000-2324(2019)03-0393-06

10.3969/j.issn.1000-2324.2019.03.008

2018-01-08

2018-03-07

中央高校基本科研業務費專項資金資助(2018ZY18);北京林業大學創新創業訓練項目(X201710022144)

劉昊(1996-),男,本科生,專業方向:微生物與植物相互關系. E-mail:liuhao1996@bjfu.edu.cn

Author for correspondence.E-mail: w_gao@bjfu.edu.cn;yaoyufeng@126.com