MC4R和NR6A1基因與大白豬×清平豬F2黑色群體的經濟性狀關聯分析

熊琪 陳文娟 彭健

摘要：選擇MC4R和NR6A1基因分別對大白豬與清平豬雜交群體F2后代中黑色個體的胴體和生長進行關聯性分析，以期為生產實踐中對清平豬雜交品系的選育提供理論依據。結果表明，MC4R的優勢基因為G等位基因，不同基因型明顯影響背膘厚，AA型個體的平均日增重與AG型個體差異顯著（P<0.05），與GG型個體差異極顯著（P<0.01），其有利基因型為GG型;NR6A1的優勢基因為A等位基因，不同基因型對背膘厚的影響差異明顯，其對胴體和生長性狀的有利基因分別為A和G等位基因。

關鍵詞：清平豬;候選基因;胴體性狀;生長性狀;關聯性分析

中圖分類號：S828? ? ? ? ?文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2019）05-0088-04

MC4R）屬于跨膜G蛋白耦聯受體（G-Protein Coupled Receptor，GPCRs）家族，是在下丘腦中合成的一種多肽類物質[1]。MC4R大量存在于中樞神經系統中，其與配體結合后通過G蛋白提高腺苷酸環化酶（Adenylyl cyclase，AC）的活性，再激活蛋白激酶（Protein kinase A，PKA）調控細胞內cAMP的濃度[2，3]。因此MC4R能調節動物的脂肪沉積與物質代謝，維持體內能量的動態平衡，在影響動物采食量、體重以及能量穩態方面發揮著重要的調控作用[1，4]。Kim等[3]首次報道豬MC4R基因高度保守區內發生了一個錯義突變Asp298Asn，并指出該位點的多態性與背膘厚和生長速度有關。李星潤等[1]對杜洛克、長白、大白共569頭豬的MC4R基因進行了研究，結果表明在杜洛克和大白豬中對生長和胴體性狀有利的基因型分別為GA型和AA型，而長白豬中不同基因型差異不顯著。李慶崗等[5]研究發現淮豬新品系豬群中GG型與AA型相比，生長速度更快，活體背膘更薄。MC4R基因是公認的對豬生長和胴體性能有影響的主效基因之一，很多研究結果證明，豬MC4R基因的多態性與生長率、背膘厚和采食量呈強相關，是畜禽生長性狀的重要候選基因之一[1，5-7]。

生殖細胞核因子（Nuclear receptor subfamily 6 group A member 1，NR6A1）屬于核受體超家族，該家族是一組配體激活的，通過在信號分子與轉錄應答間建立聯系的轉錄因子家族。NR6A1位于SSC1與椎骨數量變化相關的QTL區域，能調節細胞的生理過程，尤其是胚胎干細胞的生長和分化，影響生殖與神經系統的發育，與脂肪沉積、產仔數和豬的脊椎數等性狀有關[8-10]。Rubin等[11]對豬的全基因組進行了測序，分析發現豬的體長性狀和椎骨數目的變化與NR6A1、PLAG1和LCORL基因顯著相關。Yang等[12]檢測了3個西方豬種和7個中國豬種共519頭豬NR6A1（c.575T>C）位點等位基因的頻率，結果表明T等位基因在西方豬種中基本固定，中國豬種里岔黑豬中T等位基因頻率達到0.585，他們推測里岔黑豬中可能引入了西方豬種的血液，且里岔黑豬較高的椎體數量（平均脊椎數為21.5個）與NR6A1基因的多態性有關。范家萌等[13]對東北民豬和荷包豬進行了NR6A1基因單核苷酸多態性檢測，結果顯示NR6A1基因與體尺性狀相關，并指出其是調節民豬生長性狀的功能基因。

清平豬是國家級保護目錄品種，繁殖性能好，但其生長速度較外來豬種慢。目前黑色豬肉在市場上被認為是地方優質豬肉的一個顯著標志。因此，期望利用分子標記早期輔助選擇的手段，培育出兼具清平豬和外來豬種優良特性的毛色為純黑清平豬新品系。對一些影響清平豬胴體與生長的關鍵基因進行關聯分析，可以為后期高效利用分子標記早期輔助選擇，加快培育出新清平豬品系奠定基礎。

1? 材料與方法

1.1? 試驗樣品

所有的試驗豬群均來自湖北省當陽市清平種豬場，其中F1為清平豬（♀）與法系大白豬（♂）的雜交后代，F2群體是F1群體橫交后所選留的黑色個體。用于基因型頻率分析的F2群體黑豬個體約600頭。在全部黑色F2群體中，主要記錄了219頭雌性個體的眼肌面積和100 kg背膘厚等胴體性狀，以及83頭雌性個體的平均日增重和達100 kg日齡等生長性狀。利用常規的酚/氯仿抽提法提取基因組DNA，DNA 樣品被稀釋成50 ng/μL備用。

1.2? 試驗所需試劑

PCR擴增引物由奧科生物技術公司合成，引物詳細信息見表1。Taq酶等分子生物學試劑購自TaKaRa。試驗中常規試劑購自華中農業大學設備科。

1.3? MC4R基因G158A突變位點與NR6A1基因A200G突變位點的測序分型

根據候選基因測序引物信息（表1），交測序公司合成測序引物。以樣品的全基因組DNA為模板，配制候選基因的PCR反應體系，進行PCR擴增。吸取10 μL樣本送往武漢基諾賽克公司進行多態性測序，測序步驟包括：①首先使用捕獲引物捕獲各目標位點的DNA序列，然后回收產物并質檢合格后依據Illumina文庫構建流程完成Paired-end（PE）測序文庫的構建。②取各個樣本等量DNA構建一個PE文庫并在Illumina Hiseq測序儀上進行PE150測序。③對于下機的原始數據，首先進行數據質控，得到高質量的cleandata，然后使用BWA軟件將cleandata分解到各目標位點，得到SAM格式的比對結果，再使用軟件samtools將SAM格式的文件轉換成BAM格式，接著使用Picard工具中的SortSam對BAM文件中的reads進行排序，得到最終的BAM文件。最后，使用GATK確定各目標位點的基因型以及測序深度。

1.4? 統計分析

利用Excel表格對候選基因進行基因型頻率和基因頻率的計算。不同基因型對繁殖性狀值的最小二乘分析使用SAS（8.0版）的GLM（General linear model）軟件包進行，關聯分析的模型為Y=總體均值+基因型效應+殘差，其中Y為性狀表型值。加性效應=（XBB-XAA）/2，顯性效應=XAB-（XAA+XBB）/2，其中XAA、XAB和XBB分別表示AA型個體、AB型個體和BB型個體對應的表型數據的平均值。用t檢驗進行顯著性分析，確定有利基因和有利基因型。

2? 結果與分析

2.1? 候選基因多態性位點的基因和基因型頻率的統計分析

候選基因的基因和基因型頻率見表2，由表2可知，用測序方法共檢測了1 257頭F2群體的MC4R基因的多態性，其中F2黑豬318頭，其3種基因型頻率趨勢均為AG>GG>AA，優勢基因均為G等位基因;F2群體中NR6A1基因具有多態性，其A等位基因和G等位基因的基因頻率分別為0.579 3和0.420 7，優勢基因為A基因。

2.2? MC4R不同基因型與胴體性狀的關聯性分析

MC4R不同基因型與F2群體胴體性狀的關聯性分析結果如表3所示。MC4R基因的AA型個體和AG型個體的眼肌面積比GG型的分別高0.38 cm2和0.91 cm2，但是3種基因型之間差異不顯著。MC4R不同基因型對100 kg背膘厚的影響為AA>AG>GG，加性效應為1.35 mm，且AA型個體與AG型和GG型個體差異均顯著（P<0.05）。

2.3? MC4R不同基因型與生長性狀的關聯性分析

MC4R不同基因型與F2群體生長性狀的關聯性分析結果如表4所示。MC4R基因不同基因型對平均日增重的影響趨勢為GG>AG>AA，GG型和AG型個體比AA型個體分別高0.06 kg和0.05 kg，且AA型個體和AG型個體差異顯著（P<0.05），與GG型個體差異極顯著（P<0.01）。3種基因型對達100 kg日齡的加性效應為2.61 d，其中GG型個體比AG型個體短4.1 d，3種基因型差異不顯著。

這些結果表明MC4R GG基因型的背膘最薄，日增重最大，且不同基因型之間的差異明顯，因此該基因的多態性位點可以作為F2群體選育的指標之一。

2.4? NR6A1不同基因型與胴體性狀的關聯性分析

NR6A1不同基因型與F2群體胴體性狀的關聯性分析結果如表5所示。NR6A1不同基因型對眼肌面積的影響趨勢為AA>AG>GG，加性效應為0.19 cm2，3種基因型差異均不顯著。NR6A1對100 kg背膘厚的影響為AA

2.5? NR6A1不同基因型與生長性狀的關聯性分析

NR6A1不同基因型與F2群體生長性狀的關聯性分析結果如表6所示。NR6A1 3種基因型對平均日增重的影響為AG>GG>AA，AG型和GG型個體的平均日增重比AA型的分別高0.053 kg和0.037 kg，且AA型與GG型差異接近顯著水平（P≈0.05）。NR6A1不同基因型對達100 kg日齡的影響為GG

3? 小結與討論

MC4R不同基因型與背膘厚相關性的研究結果并不一致，本試驗發現MC4R基因的GG型和AG型個體背膘厚比AA型平均薄2.70 mm和2.53 mm，二者均與AA型差異顯著（P<0.05），與李慶崗等[5]對淮豬新品系的研究結果相符。MC4R基因對眼肌面積的影響為AG>AA>GG，差異不顯著。結合文獻報道，推測MC4R基因的GG型能降低背膘厚，從而提高胴體瘦肉率。目前對NR6A1基因多態性的研究主要集中于肋骨數、體長和體尺等性狀[11，13]，對該基因與胴體性狀的關聯分析研究較少。本試驗研究發現NR6A1基因的AA型比AG型和GG型的平均眼肌面積分別高0.22 cm2和1.18 cm2，平均背膘厚分別薄0.19 mm和2.25 mm，且3種基因型對背膘厚的影響差異明顯，推測NR6A1基因的AA型個體可能具有更優良的胴體性能，即GG突變型個體對脊椎數等生長性狀有利，但是可能與某些胴體性狀負相關，這一結果與Huang等[14]在PIC豬上的發現相符。因此在進行清平豬雜交后代胴體性狀的選育時，可以選擇性淘汰部分NR6A1基因的GG型個體和MC4R基因的AA型個體，篩選出AA-GG（NR6A1-MC4R）個體，從而提高有利基因在群體中的頻率。同時需要擴大胴體性狀分析的樣本容量，對候選基因繼續進行驗證，以確定其對群體的選育是否有準確的指導作用。

MC4R基因不同基因型對平均日增重的影響趨勢為GG>AG>AA，3種基因型對達100 kg日齡的加性效應為2.61 d，推測MC4R對生長性狀的有利基因為G等位基因，該基因可能能提高豬的生長速度，降低育種周期，這與李慶崗等[5]、韓雪蕾等[15]、肖石軍等[16]的研究結果相符，表明MC4R基因對不同豬種的影響可能具有一致性，因此可以將其作為清平豬雜交群體生長性狀選育的候選基因。

根據試驗結果，對F2群體胴體和生長性能的選育工作提出如下建議：①NR6A1基因的AA野生型對胴體性能有利，但是大量文獻報道其突變型GG與脊椎數正相關，因此需要針對具體的育種目標對群體的NR6A1基因進行選育。②MC4R基因對胴體和生長性狀的有利基因均為G等位基因，因此在進行F2群體的選育時應保留GG型個體，從而在降低群體背膘厚的同時提高生長速度。

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