川南地區乳腺癌患者HER-2基因狀態及其蛋白表達與臨床病理特征的關系分析*

李 昕，阮思蓓，唐曉琴，羅斯譯，高子清，楊志惠，，肖秀麗，，劉 勇，，唐明希△

(1.西南醫科大學，四川瀘州 646000；2.西南醫科大學附屬醫院病理科，四川瀘州 646000)

人表皮生長因子受體-2(human epidermal growth factor receptor-2，HER-2)是定位于人染色體17q11.2～q12、編碼Her-2/neu蛋白的基因，正確評估HER-2狀態與判斷乳腺癌的分子分型、生長、侵襲、轉移及患者的治療預后密切相關[1-2]。目前，使用最普遍的方法是熒光原位雜交(fluorescence in situ hybrizization,FISH)和免疫組織化學(immunohistochemistry,IHC)法。本文根據《乳腺癌HER-2檢測指南(2014版)》再次評價FISH和IHC檢測的一致性、相關性及與乳腺癌患者臨床病理特征的關系，為臨床正確評估HER-2狀態提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2010年11月至2018年2月瀘州、內江、宜賓、自貢等四川南部地區來西南醫科大學附屬醫院病理科進行FISH和IHC檢測的898例浸潤性乳腺癌患者的石蠟標本。所有病理均有完整的IHC[雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)、Her-2/neu、Ki-67]及臨床病理特征(患者年齡、腫瘤大小、淋巴結轉移、腫瘤分級)資料，通過復閱切片及FISH報告分別統計新舊標準下FISH結果及其差異。

1.2試劑與探針 IHC中ER、PR和Her-2/neu檢測使用羅氏公司抗體(ER克隆號：SP1；PR克隆號：1E2；Her-2/neu克隆號：4B5)；Ki-67使用北京中杉金橋公司生物技術有限公司產品(克隆號：MIB.I)。FISH檢測使用北京金普嘉公司HER-2基因擴增試劑盒。

1.3方法

1.3.1FISH法 FISH法按北京金普嘉公司HER-2基因擴增試劑盒說明書操作，參考文獻[3]。

1.3.2IHC法 IHC采用EnVision法，ER、PR及HER-2蛋白表達如PANIWANI等[4]所述。

1.4結果判定

1.4.1FISH結果判定 參考ASCO-CAP檢測指南[2]所建議的方法進行再評價：(1)浸潤癌區域HER-2信號連接成簇狀，判讀為陽性；(2)隨機計數20個浸潤癌細胞的紅綠雙色信號數目。陽性：HER2/CEP17 Ratio≥2.0或者HER2/CEP17 Ratio<2.0，平均HER2拷貝數/細胞大于或等于6.0；陰性：HER2/CEP17 Ratio<2.0且平均HER2拷貝數/細胞小于4.0；可疑：HER2/CEP17 Ratio<2.0且平均HER2拷貝數/細胞≥4.0～<6.0；可疑狀態的判定需要增加細胞計數或者另一位判讀者單獨計數細胞且結果一致。

1.4.2IHC結果判定 根據《乳腺癌HER-2檢測指南(2014版)》[5]進行評價。

1.5統計學處理 使用SPSS19.0軟件進行統計學分析，兩種方法檢測的一致性分析采用Kappa檢驗，HER-2基因狀態及Her-2/neu蛋白表達與各臨床病理特征關系分析的組間比較用秩和檢驗及Speaman等級相關分析，以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1IHC與FISH檢測HER-2的結果比較 在898例浸潤性乳腺癌病理標本中，IHC染色結果為-，+，++，+++(圖1)。FISH新舊標準下與IHC檢測結果的一致性見表1。新標準下，FISH檢測HER-2基因擴增率為30.96%(278/898)，可疑率為5.57%(50/898)，陰性率為63.47%(570/898)，見圖2。FISH與IHC檢測符合率如下：IHC(-/+)為93.79%(151/161)，IHC(++)為7.17%(44/614)，IHC(+++)為60.98%(75/123)。一致性檢驗顯示FISH與IHC一致率為46.77%，結果存在一致性(Kappa=0.132,P=0.000)且呈正相關(r=0.351,P=0.000)，見表1。

表1 FISH及IHC檢測HER-2基因狀態新舊標準比較

新：根據《乳腺癌HER2檢測指南(2014版)》；舊：根據《乳腺癌HER2檢測指南(2009版)》

A:IHC，-無染色(×200);B：IHC+，>10%的浸潤癌細胞呈不完整的、微弱的細胞膜染色(×200)；C：IHC++，>10%的浸潤癌細胞呈不完整和中等強度的細胞膜染色(×200)；D:IHC+++，>10%的浸潤癌細胞呈現強而完整的細胞膜染色(×200)

圖1 IHC評分結果圖片

A:陰性；B:可疑；C、D:陽性

圖2 FISH結果判讀圖片(CEP17為綠色信號，HER-2為紅色信號)

表2 Her-2/neu蛋白表達、HER-2基因狀態與臨床病理特征的相關性

續表2 Her-2/neu蛋白表達、HER-2基因狀態與臨床病理特征的相關性

2.2HER-2基因擴增及蛋白表達與臨床病理特征的關系 ER、PR、ER/PR表達狀態、腫瘤大小及組織學分級與HER-2基因擴增(χ2=164.939,P=0.000;χ2=127.342,P=0.000;χ2=65.146,P=0.000;χ2=30.711,P=0.001;χ2=17.786,P=0.001)及Her-2/neu蛋白表達間差異均有統計學意義(χ2=34.578,P=0.000;χ2=19.706,P<0.01;χ2=19.624,P<0.05;χ2=67.255,P=0.000;χ2=12.047,P<0.05)，年齡和淋巴結轉移狀態與HER-2基因擴增間差異具有統計學意義(P<0.05)，而與Her-2/neu蛋白表達間差異無統計學意義(P>0.05)。ER表達與HER-2基因擴增及蛋白表達呈負相關(r=-0.322,P<0.01;r=-0.114,P<0.01)，PR表達及ER/PR狀態與HER-2基因擴增呈負相關(r=-0.177,P<0.01;r=-0.234,P<0.01)，與HER-2蛋白表達無關(P>0.05)。另外，年齡、淋巴結轉移狀態與HER-2基因擴增狀態相關，而腫瘤大小和組織學分級與HER-2蛋白表達有關(表2)。

3 討 論

乳腺癌患者的HER-2狀態是臨床篩選用藥的重要指標。美國臨床腫瘤學會/美國病理學家學會(ASCO/CAP)于2013年頒布了最新的乳腺癌HER-2檢測指南，我國也同步采用新版《乳腺癌HER-2檢測指南(2014版)》。本文運用該指南再次評價IHC及FISH檢測結果的一致性、相關性及其與臨床病理特征的關系。

HER-2基因擴增及其受體蛋白的過表達被認為與預后不良相關，乳腺癌患者HER-2狀態的評價對其治療和預后判斷具有重要的指導作用[6-7]。本研究再次表明，新標準下FISH和IHC(-/+)的一致性為93.79%，與本文舊標準結果(88.20%)及本課題組之前報道的87.50%[3]和93.67%[8]基本一致，也與大多數報道相符[4,9-11]。新標準下的FISH和IHC(++)一致性為7.17%，低于本文舊標準判讀結果的8.79%、STOSS等[12]報道的8.20%及MURTHY等[13]報道的16%～29%，說明FISH與IHC(++)一致性有所降低，提示IHC(++)者應常規行FISH檢測，才能更準確地評估HER2擴增狀態。新標準下，FISH和IHC(+++)檢測一致性為60.98%，略高于之前報道的58.80%[3]，但仍然明顯低于其他研究者的報道100.00%[4,9]、84.80%[11]。這也是本文FISH與IHC總符合率(46.77%)較低的主要原因，可能與IHC(+++)樣本量較少，以及樣本固定、IHC抗原修復方法、17號染色體多體等因素有關。另外，新舊指南均將IHC(+++)作為HER-2擴增可直接行曲妥珠單抗治療。但本研究結果表明，IHC(+++)仍有一定比例患者HER-2基因無擴增，基于MASS等[14]報道IHC(++)和(+++)患者中，HER-2基因擴增患者應用靶向藥物治療的總有效率及長期生存率顯著高于無基因擴增患者，同時，許多臨床及科研工作者也推薦FISH作為應用曲妥珠單抗治療的金標準[2,5]。因此，筆者認為IHC(++)及(+++)者都應進一步行FISH檢測，以此完善診斷，指導治療和判斷預后。最新指南首次考慮了平均HER-2基因拷貝數對結果評價的影響，提高了FISH與IHC檢測的一致性，但是，臨床上究竟以IHC檢測HER-2/neu蛋白表達，還是以FISH檢測HER-2基因擴增作為應用靶向藥物的最終依據，以及17號染色體多體對乳腺癌患者治療預后的影響，還有待長期、大量、多中心的臨床治療效果的判讀、研究及分析來得以完善和解決。

本文結果顯示ER表達與HER-2基因擴增及HER-2/neu蛋白表達呈負相關，PR表達、ER/PR狀態與HER-2基因擴增呈負相關，這與NING等[11]及劉琪等[15]的結論基本一致。提示ER、PR表達與HER-2基因擴增間可能存在共同的信號轉導通路，使其相互影響。因此，ER、PR和ER/PR狀態可以間接推測HER-2基因擴增情況，且有報道ER- PR-患者預后較差[16]，這可能與其HER-2基因擴增率高相關。此外，年齡和淋巴結轉移狀態與HER-2基因擴增呈正相關，腫瘤大小和組織學分級與HER-2蛋白表達呈正相關，這可能與HER-2基因擴增后調控腫瘤細胞增殖，使腫瘤體積增大、組織學分級增高、淋巴結出現轉移有關，但與汪波等[16]報道的年齡和淋巴轉移與HER-2基因擴增和Her-2/neu蛋白表達無關不同，其原因可能與不同的統計病例數等有關，其相關性仍需多中心、長期、大樣本分析。

綜上所述，IHC是檢測乳腺癌患者HER-2/neu蛋白表達的首選方法。但是FISH仍然是評價HER-2/neu蛋白IHC(++)及IHC(+++)基因擴增的標準方法。最新HER-2檢測指南提高了FISH和IHC檢測的一致性，避免了部分假陰性及假可疑的存在。