星點設計-效應面法優化復合酶解酪蛋白制備抗凝血肽的工藝研究

吳雄,夏建開，苗艷麗,陳紹紅,張兆霞,郭婉婷,李欞靈

(1.廣東海洋大學化學與環境學院，廣東 湛江 524088；2.廣東海洋大學食品科技學院現代生物化學實驗中心，廣東 湛江 524088)

心腦血管疾病已成為我國發病率、致死率最高的疾病，其中大部分疾病與血栓相關[1]，而血管內血栓形成的主要因素是凝血酶誘發的血液凝固[2]。凝血酶分子表面有一個富含堿性氨基酸的活性部位(fibrinogen recognition site，FRS)，能特異性與纖維蛋白原結合并將其裂解成為纖維蛋白，從而導致血液凝固[3]。天然水蛭素是從吸血水蛭唾液腺中分離出來的多肽[4]，C 端為活性部位，含較多酸性氨基酸，具有強烈的抗凝血酶活力，對防治多種血栓性疾病以及溶解術后形成的血栓都有較好效果[5-6]，國內外試圖將其開發成新一代高效特異性抗凝、溶栓藥物[1]。水蛭素 C 端與凝血酶分子FRS在一定pH條件下按1∶1結合，形成凝血酶-水蛭素復合物，抑制了凝血酶對纖維蛋白原的激活作用，從而避免了血液的凝固。根據該原理，利用凝血酶滴定改進法[7]可用水蛭素標準液測定凝血酶的濃度，從消耗的水蛭素量得知凝血酶的量；或者以凝血酶標準液測定水蛭素的濃度，根據消耗的凝血酶量得知水蛭素的量。

天然水蛭素的來源有限制約了其廣泛使用。研究發現，酪蛋白分子中含有若干具有抗凝血酶活性的肽段[抗凝血肽(anticoagulant peptide，AP)、抗血栓肽][8-10]，在合適的工藝條件下水解酪蛋白，可獲得功能與水蛭素類似的AP，且六肽及以下的小肽能被腸道直接吸收[11]。前期我們已經利用木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶進行酪蛋白多酶混合水解，發現水解后的產物具有較強的抗凝血酶活力[12]。本實驗旨在通過星點設計-效應面法來優化復合酶解酪蛋白的工藝條件，運用凝血酶滴定改進法測定其體外抗凝血活性，并用活性最高的酪蛋白復合酶解液做體外溶栓和抗凝血實驗，初步評價其體外抗凝血活性與溶栓效果，為日后開發以酪蛋白作原料的防治血栓性疾病的口服小肽類藥物或功能性食品提供理論及實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 酪蛋白(上海源葉生物科技有限公司)；胰蛋白酶(2.5×105U·g-1)、胰糜蛋白酶(1.5×106U·g-1)、木瓜蛋白酶(5×105U·g-1)、菠蘿蛋白酶(3.2×105U·g-1)、凝血酶(1 000 U/瓶)購自上海源葉生物科技有限公司；纖維蛋白原(牛血纖維蛋白原，美國Biosharp公司)；鹽酸(廣州化學試劑二廠)；新西蘭大白兔，兩只，雌雄各一只，普通級，質量2.3～2.5 kg,廣東省醫學動物實驗中心，生產證號:SCXX(粵)2017-0035。其他試劑均為分析純。

恒溫水浴振蕩器(沈陽萊克斯儀器制造有限公司)；MP200A型電子天平(上海精科電子有限公司)；電熱恒溫水浴鍋(沈陽萊克斯儀器制造有限公司)；高速臺式離心機(上海安亭科學儀器廠)；TU-1901型雙光束紫外可見光分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)；F100數碼照相機(日本富士公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 酪蛋白總氮含量的測定 本實驗利用凱氏定氮法測定酪蛋白中的氮含量[13]。本實驗測得酪蛋白的總氮含量為9.8%。

1.2.2 酶活力的測定 本實驗用福林法和紫外分光光度法對4種蛋白酶(胰蛋白酶、胰糜蛋白酶、菠蘿蛋白酶和木瓜蛋白酶)的實際活力進行測定。具體操作要求參考劉恭等[9，14]文獻中的方法。對所用的4種蛋白酶的酶蛋白活力測定結果如表1所示。

表1 4種蛋白酶的活力

1.2.3 水解度的測定 在許多關于蛋白質的酶解過程研究中都是采用水解度(DH)來衡量反應進程的參量[14]。本試驗利用甲醛滴定法來測定酪蛋白酶解液的水解度[15]。

1.2.4 單因素試驗確定最佳料水比 取5個錐形瓶，分別稱取5.0 g酪蛋白,制備成pH為8.0，料水比(m/V)分別為1∶3、1∶5、1∶7、1∶9、1∶11的酪蛋白溶液。然后加入酶用量為4 000.00 U/(g底物)的胰蛋白酶，并在50.00 ℃的恒溫條件下水解3 h，水解完成后滅活10 min，冷卻后再以5 000 rpm的速率離心10 min，最后定量量取離心后上層澄清液測定水解度。

1.2.5 星點設計-效應面法 星點設計-效應面法是先通過擬合效應變量對因變量的效應面，然后利用效應面的最佳效應區反推得到自變量最優值的優化法[16]。本文以A(pH)、B(水解溫度)、C(酶用量)、D(水解時間)為自變量，以水解度(DH)為因變量，運用星點設計—效應面法進行預測和分析。

1.2.6 復合酶酶解酪蛋白制備酶解液 以“胰蛋白酶-胰糜蛋白酶”組合為例，取料水比為(m/V)1∶7的酪蛋白溶液20.0 mL于錐形瓶中，在胰蛋白酶的最佳條件下反應，反應結束后滅活10 min；冷卻到預定溫度后加入胰糜蛋白酶，在胰糜蛋白酶的最佳條件下反應，反應結束后取出并滅活，冷卻至室溫后以5 000 rpm轉速離心10 min，取上清液來測定水解度。其他組合也同以上步驟。

1.2.7 酪蛋白酶解液抗凝血活性的測定[7]

1.2.7.1 配制不同濃度的凝血酶溶液 以20 NIH·mL-1的濃度作為一個基準濃度，即作為一倍。以5 μL該溶液作為一個滴定體積，相當于0.1 ATU酪蛋白活力肽:20 NIH/(1000 μL/5 μL)=20 NIH/200=0.1 NIH，因為1 NIH=1 ATU，所以0.1 ATU=0.1 NIH。配20 NIH·mL-1溶液(作為基準濃度，即為1倍)，配40 NIH·mL-1溶液(即為2倍)，配100 NIH·mL-1溶液(即為5倍)，配400 NIH·mL-1溶液(即為20倍)。

1.2.7.2 配纖維蛋白原溶液 ①配0.2 mol·L-1的三羥甲基氨基甲烷溶液:用蒸餾水溶解1.214 g的三羥甲基氨基甲烷，然后置于50 mL的容量瓶中定容即可。②配制pH為7.40 的Tris-HCl溶液:量取0.2 mol·L-1三羥甲基氨基甲烷溶液25.0 mL，加入0.1 mol·L-1HCl溶液40.0 mL，然后用pH計將溶液的pH調到7.40即可。③配制含有0.05 mol·L-1NaCl的0.5 mol·L-1Tris-HCl溶液:量取pH為7.40的Tris-HCl溶液20.0 mL，然后加入氯化鈉0.06 g即可。④配制0.5%的纖維蛋白原溶液:稱取纖維蛋白原5.0 g，再用含0.05 mol·L-1氯化鈉的0.5 mol·L-1Tris-HCl溶液稀釋到0.5%即可。

1.2.7.3 抗凝血活性測試 取幾支玻璃小試管，用移液槍移取200 μL 的0.5%纖維蛋白原于試管中，然后再加入50 μL樣品液，于37.00 ℃恒溫水浴鍋中恒溫保持5 min。

其中一支玻璃小試管滴加5 μL 五倍的凝血酶溶液，立即搖勻，如果1 min內凝固，表示50 μL酶解液中含有的抗凝血活性小于0.5 ATU。為了準確確定該酶解液的抗凝血活性，再取其中一支試管并加入5 μL 一倍凝血酶溶液，立即搖勻，如果1 min內凝固，表示50 μL酶解液中含有的抗凝血活性低于0.1 ATU；如果1 min內不凝固，表示其抗凝血活性高于0.1 ATU，再滴加5 μL 一倍凝血酶溶液，立即搖勻，如果1 min內凝固，表示其抗凝血活性低于0.2 ATU；如果1 min內不凝固，表示其抗凝血活性高于0.2 ATU，再滴加5 μL 一倍凝血酶溶液，立即搖勻，直至凝固出現，從而確定該酶解液的活性[12]。利用此原理，直至測出酶解液的活性。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗確定最佳料水比 按照“1.2.4”項下步驟進行試驗。結果顯示，料水比(m/V)分別為1∶3、1∶5、1∶7、1∶9、1∶11的酪蛋白溶液，在pH為8.00，水解溫度為50.00 ℃，酶用量4 000.00 U/(g底物)，水解時間為3 h的平行條件下測得的水解度分別為3.8%、5.0%、7.3%、5.4%、4.8%。可看出，隨著料水比的增加，水解度先增大后減小。這是由于當加水量適宜時，酶與底物充分接觸，有利于酶促反應。但隨著加水量繼續增加，酶濃度會降低，使得底物接觸的單位酶量減少，不利于酶促反應。在料水比為1∶7(m/V)時，水解度達到最大值，因此胰蛋白酶酶解酪蛋白最佳料水比選1∶7(m/V)。

2.2 方案設計 胰蛋白酶酶解酪蛋白的星點設計見表2，試驗結果見表3，方差分析見表4。

表2 胰蛋白酶酶解酪蛋白的星點設計表

由表4可知，4種因素對酪蛋白水解度都有顯著的影響(P<0.05),顯著性大小依次為：酶用量>水解溫度>水解時間>pH。其中酶用量這一因素表現為極顯著，對水解度的影響最大，而pH對水解度的影響最小。

表3 星點設計胰蛋白酶酶解酪蛋白的試驗結果

表4 效應面試驗結果的方差分析

2.3 效應面分析 以因變量(水解度)擬合數學模型為基礎來描繪效應面，效應面分析結果分別見圖1～6。

圖1 pH和水解溫度對酪蛋白水解度的響應面分析

圖2 pH和酶用量對酪蛋白水解度的響應面分析

圖3 pH和水解時間對酪蛋白水解度的響應面分析

圖4 水解溫度和酶用量對酪蛋白水解度的響應面分析

圖5 水解溫度和水解時間對酪蛋白水解度的響應面分析

圖6 酶用量和水解時間對酪蛋白水解度的響應面分析

圖1所示當pH從7.0逐漸增加到8.0的時候，水解度不斷增加,在pH值8.0時水解度達到最大值，當pH值超過8.0后，水解度又逐漸下降，由此可知酶的最適pH為8.0。水解溫度對酪蛋白水解度的影響成反比，由圖可看出最佳水解溫度為50 ℃，溫度增加，水解度反而下降。酶的化學本質是蛋白質，溫度過高可引起蛋白質變性，導致酶的失活。在相同的水解度下，隨著pH增加，溫度逐漸偏向最佳。

圖2表明酶用量對酪蛋白水解度的影響成正比，由圖可看出最佳酶用量為5 500.00 U/(g底物)。而且相對于pH，酶用量對酪蛋白水解度的影響比較大。在相同的酪蛋白水解度下，隨著pH增加，酶用量逐漸偏向最佳。

圖3和圖5表明時間對酪蛋白水解度的影響成正比，從節約時間，提高生產效率和降低成本的角度出發，由圖可看出最佳時間為3.80 h。在相同的水解度下，隨著pH增加，時間逐漸偏向最佳。

圖4表明相對于溫度，酶用量對酪蛋白水解度的影響比較大。在相同的水解度下，隨著溫度增加，酶用量逐漸偏向最佳。

圖6表明酶用量和時間對酪蛋白水解度的影響成正比，而且相對于時間，酶用量對酪蛋白水解度的影響比較大。在相同的水解度下，隨著時間增加，酶用量逐漸偏向最佳。

根據試驗結果和軟件擬合的胰蛋白酶酶解酪蛋白最佳條件為:pH為8.00、溫度為50.00 ℃、酶用量為6 000.00 U/(g底物)、時間為3 h，水解度預測為15.0%。3次試驗驗證結果，水解度分別為14.7%、14.9%、15.5%，平均水解度為15.0%。

另外，胰糜蛋白酶、菠蘿蛋白酶和木瓜蛋白酶的最佳反應條件也運用星點設計-效應面法來預測分析，根據試驗結果，3種蛋白酶酶解酪蛋白的最佳條件分別為:菠蘿蛋白酶:pH為6.50、溫度為60.00 ℃、酶用量為12 000.00 U/(g底物)、時間為3 h、料水比為1∶7(m/V)；胰蛋白酶和胰糜蛋白酶:pH為8.00、溫度為50.00 ℃、酶用量為6 000.00 U/(g底物)、時間為3 h、料水比為1∶7(m/V)；木瓜蛋白酶:pH為6.50、溫度為60.00 ℃、酶用量為4 000.00 U/(g底物)、時間為3 h、料水比為1∶7(m/V)。

2.4 復合酶解酪蛋白制備酶解液 按照“1.2.6”項下步驟進行試驗。復合酶解酪蛋白制備酶解液的酶組合、水解度和抗凝血活性測試結果見表5。

表5 酪蛋白酶解液的酶組合、水解度和抗凝血活性結果

注:“胰蛋”、“胰糜”、“菠蘿”和“木瓜”分別指胰蛋白酶、胰糜蛋白酶、菠蘿蛋白酶和木瓜蛋白酶

表5顯示，“菠蘿-胰蛋-胰糜-木瓜”4酶組合所制備的復合酶解液具有最高的抗凝血活性，為100.0 ATU·mL-1，其次是“木瓜-胰蛋-胰糜-菠蘿”4酶組合的復合酶解液，其抗凝血活性為90.0 ATU·mL-1。由試驗結果可看出，利用復合酶解的方法來水解酪蛋白，水解度更高且所制備的酪蛋白酶解液也具有較高的抗凝血活性。

2.5 酪蛋白抗凝血肽的體外溶栓與抗凝血作用實驗

2.5.1 酪蛋白抗凝血肽(AP)的體外溶栓實驗 新西蘭大白兔耳朵靜脈采血，滴在懸有棉線的小玻璃管中，靜置15 min使兔血充分凝固后，將帶血栓的棉線剪成約2 cm長，浸泡于100 ATU·mL-1的AP 溶液中。同時以生理鹽水為陰性對照、4%(質量分數，后同)CATS為陽性對照。在 26 ℃下浸泡24 h,然后進行觀察并拍照[17]。體外溶栓實驗見圖7，結果顯示：兔血栓線在100 ATU·mL-1的AP 溶液中液中浸泡24 h后已經全部溶解,浸泡于4% CATS中的尚有部分未溶解，而溶解于生理鹽水中的只有極少量。說明100 ATU·mL-1AP溶栓效果好于4% CATS。而后者又明顯好于生理鹽水。

a.浸泡于生理鹽水；b.浸泡于4% CATS；c.浸泡于100 ATU·mL-1 AP 1.開始時的狀態；2.結束時的狀態圖7 體外溶栓實驗

2.5.2 酪蛋白凝血肽(AP)體外抗凝血實驗 體外抗凝血實驗參照文獻方法[17]。樣品液為100 ATU·mL-1的AP溶液，取6支試管，按照以下比例加入兔血：新西蘭大兔血1 mL(空白組)；新西蘭大兔血∶4%檸檬酸鈉溶液(V/V)=1∶1(對照組)；新西蘭大兔血∶樣品液(V/V)分別為9∶1、8∶2、6∶4、1∶1(樣品組①、②、③、④)；然后把6支試管分別置于37 ℃水浴3 min后,開始觀察血液凝固時間(試管倒置時血液不流動)。

實驗結果見圖8。空白組(1 mL兔血)約30 s凝固；對照組(兔血∶4%檸檬酸鈉溶液(V/V)=1∶1)48 h后凝固；樣品組①(兔血∶酪蛋白酶解液(V/V)=9∶1)5 min后半凝固；樣品組②(兔血∶酪蛋白酶解液(V/V)=8∶2)10 min后半凝固；樣品組[③和④(兔血∶酪蛋白酶解液(V/V)=6∶4和1∶1)]48 h后仍然不凝固。實驗結果顯示，空白組兔血很快就凝固、酪蛋白酶解液所占體積較小的樣品組兔血也較快凝固，而對照組及酪蛋白酶解液所占體積較高的樣品組都可以有效延長凝血時間，說明按照該實驗條件復合酶解酪蛋白所制備的酶解液中含抗凝血活性物質，具有較強的體外抗凝血作用。

圖8 體外抗凝血實驗

3 結論

本實驗運用星點設計-效應面法分別確定了菠蘿蛋白酶、胰蛋白酶、胰糜蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解酪蛋白的最佳反應條件，并利用這4種蛋白酶對酪蛋白進行復合酶解，然后測定酪蛋白酶解液的水解度和抗凝血活性。實驗結果表明，按照本實驗條件“菠蘿蛋白酶-胰蛋白酶-胰糜蛋白酶-木瓜蛋白酶”4酶組合復合酶解酪蛋白，所制備的酶解液具有最高的抗凝血活性值，為100.0 ATU·mL-1。選用100.0 ATU·mL-1的AP溶液對新西蘭大白兔血進行體外溶栓和抗凝血作用的實驗，結果表明其在體外具有明顯的溶栓效果和抗凝血作用。后續正在進行該抗凝血肽的分離和純化工作。