踝管綜合征對大鼠糖尿病足病變發展的促進作用

秦小勇 張冉

【摘要】 目的 探索踝管綜合征是否對大鼠糖尿病足病變的發展有促進作用。方法 鏈脲佐菌素（55 mg/kg）腹腔注射制備糖尿病大鼠;將糖尿病大鼠后肢隨機分為卡壓組（A組）、松解組（B組），在A組大鼠一側后肢踝管處血管、神經行卡壓手術，在B組大鼠一側后肢踝管處血管、神經行探查手術，同時在A組、B組大鼠一側足底制作創面，6周后取材制作病理切片，顯微鏡下觀察踝管處血管、神經及足底創面的組織病理學改變。結果 A組與B組比較，A組大鼠足底創面組織中的血管、血管內皮細胞明顯減少，A組大鼠足底創面組織中的血管內皮生長因子（VEGF）、神經生長因子（NGF）、堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）表達明顯降低，平均光密度相對值比較差異有統計學意義（P<001）。結論 踝管綜合征對大鼠糖尿病足病變的發展有明顯促進作用。

【關鍵詞】 糖尿病足;糖尿病大鼠;踝管綜合征

中圖分類號：R688 ? 文獻標志碼：A ? DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2019.05.003

【Abstract】 Objective To explore whether tarsal tunnel syndrome can promote the development of diabetic foot disease in rats.Methods Diabetic rats were prepared by intraperitoneal injection of streptozotocin（55 mg/kg）.The hindlimbs of diabetic rats were randomly divided into compression group（group A） and loose group（group B）.In the group A， the vessels and nerves in the ankle canal of one hind limb of rats were given compression operation，while the vessels and nerves in the ankle canal of one hind limb of rats in the group B were given exploratory operation.At the same time，wounds were made on one side of feet of rats in the group A and the group B.After 6 weeks，pathological sections were taken to observe the histopathological changes of blood vessels，nerves and plantar wounds in ankle canal under microscope.Results Compared with the group B，the vascular and vascular endothelial cells in the plantar ulcer tissue of the group A significantly reduced.The expressions of vascular endothelial growth factor（VEGF），nerve growth factor（NGF） and basic fibroblast growth factor（bFGF） in plantar wound tissue of rats in the group A significantly decreased，and difference of the relative values of average optical density between the two groups was statistically significant（P<0.01）.Conclusion Tarsal tunnel syndrome can promote the development of diabetic foot lesions in rats.

【Key words】 diabetic foot;diabetic rats;tarsal tunnel syndrome

隨著糖尿病患者日益增多，糖尿病足（Diabetic Foot）患者也隨之增多。踝管綜合征（Tarsal tunnel syndrome）也稱跗管綜合征，指脛神經或其分支、終末支在內踝后下方的相應管道內受到擠壓而產生的局部或足底放射性疼痛、麻木的神經綜合征[1]。糖尿病足患者合并踝管綜合征時病情發展變得更加復雜，此類疾病的治療及研究鮮有報道，僅有個別文獻報道提及部分糖尿病患者出現此病癥狀[2]。患者踝管及踝管上下存在多發神經、血管的嚴重病變，通過高頻彩色多普勒對患者踝管處血管、神經的掃描[3]得到證實。踝管綜合征如何影響糖尿病足病變發展的機制尚未清楚，因此根據糖尿病足合并踝管綜合征患者病變特點設計近似實際病變的動物模型，探索病變發展過程中糖尿病足皮膚、血管、神經病變組織的病理學改變。

1 資料與方法1.1 實驗設計 采取隨機對照動物實驗方法。實驗過程中對動物的處置符合2006年科技部關于善待實驗動物的規章。

1.2 時間及地點 于2016年12月～2017年6月在柳州市人民醫院實驗中心動物實驗室完成。

1.3 實驗材料 SPF級6周齡SD大鼠50只，體重（20944±18.61）g。動物來源于廣西醫科大學實驗動物中心。

1.4 實驗方法 將鏈脲佐菌素（Streptozoticin，STZ，Sigma公司）溶于0.1 mol/L 新鮮枸櫞酸/枸櫞酸鈉緩沖液中（pH 4.5），SD大鼠禁食12 h后按55 mg/kg劑量一次性腹腔注射1.2%STZ。于72 h時后測空腹血糖（FPG），選取FPG連續維持在16.7 mmol/L以上的SD大鼠，飼養2周后空腹采尾靜脈血，以血糖分析儀測定，FPG>11.1 mmol/L為造模成功[4] 。選取其中造模成功SD大鼠40只飼養2周，按隨機數字表分為卡壓組（A組）與松解組（B組）各20只，予0.3%戊巴比妥鈉溶液（1 mL/100 g）腹腔麻醉， A組大鼠一側后肢踝管處血管、神經行卡壓手術。為保持良好的卡壓效果，自行設計切取5 mm×5 mm淺筋膜條，顯微鏡下顯露血管、神經鞘后將筋膜條環繞一周，以顯微縫線固定并環扎血管、神經3道，每道縫線間隔約2 mm。卡壓成功標準：顯微鏡下觀察神經表面動脈受壓，但血流尚未完全阻斷。縫合關閉切口。B組大鼠一側后肢踝管處血管、神經行探查手術后關閉切口。同時兩組大鼠手術側足底相同部位使用直徑3 mm金屬棒明火加熱2分鐘后，直接燒灼5秒鐘制備直徑約3 mm足底創面。

1.5 實驗標本收集及檢測方法 A組、B組大鼠飼養6周，予0.3%戊巴比妥鈉溶液（1 mL/100 g）腹腔麻醉，行手術側后肢踝管處神經、血管及足底創面組織取材，標本經生理鹽水沖洗后，立即使用4%多聚甲醛溶液中固定24小時，經梯度酒精脫水，二甲苯透明、浸蠟、石蠟包埋，做連續切片，常規HE染色和免疫組化染色標記足底創面組織切片中的血管內皮生長因子（VEGF）、神經生長因子（NGF）、堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）。免疫組化圖像使用Image-pro plus 進行分析并測算平均光密度相對值。

1.6 統計學方法 采用SPSS 19.0統計軟件進行統計分析，計量資料符合正態分布，以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，檢驗水準：α=0.05，雙側檢驗。

2 結 ?果2.1 糖尿病大鼠一般情況 造模前大鼠反應良好，毛發光潔，飲食、大小便正常，行動靈敏，行STZ腹腔注射后3～7天，大鼠開始出現明顯多尿、多飲、多食癥狀，毛發污黃，光澤度差，活動力明顯降低。連續2周多次測定FPG為（20.37±4.18）mmol/L，糖尿病大鼠造模成功。

2.2 糖尿病足大鼠病變發展情況 A組大鼠術后3天出現明顯的肢體腫脹，足底創面周圍腫脹尤其明顯。3周時A組足底創面明顯擴大，且肢體腫脹明顯;B組大鼠足底創面無明顯擴大，肢體腫脹不明顯。6周實驗取材時A組大鼠足底創面不愈合，B組足底創面基本愈合。見圖1。

2.3 病理學形態改變 組織切片HE染色顯微鏡下A組大鼠的踝管處神經組織水腫，大量單核細胞浸潤，神經纖維變性;血管內皮細胞明顯減少，血管內皮細胞核皺縮;足底創面組織中纖維細胞萎縮，纖維變性、細胞水腫，細胞核明顯減少。B組大鼠踝管處神經、血管及足底創面組織表現為較正常的組織學結構，血管內皮細胞結構完整，神經纖維結構清晰，皮膚細胞層次清晰、結構完好。見圖2。

2.4 細胞因子表達 A組足底創面組織切片免疫組化顯示大鼠VEGF、NGF、bFGF表達較B組明顯降低（P<0.01）。見表1和圖3。

2.5 各組大鼠的一般情況 在實驗過程中，A組和B組大鼠無死亡。

3 討 ?論 ?足底皮膚是遠離循環系統中心的末梢組織，糖尿病足狀態下易出現不同程度的損害，組織形態學改變主要表現為皮膚變薄，損傷后易出現難愈合的皮膚潰瘍。足底創面的修復需要血管再生為基礎，血管內皮細胞及成纖維細胞等在細胞因子的引導下增殖、遷移到血管外周后分化成相應的組織細胞。糖尿病足大鼠踝管卡壓形成后，踝管處的血管、神經卡壓加重導致相應支配區域的血液及神經營養削弱，術后6周A組大鼠足底創面組織中的VEGF、NGF、bFGF平均光密度與B組比較差異有統計學意義，A組大鼠足底創面處無法生成較多的新生血管內皮細胞，皮膚成纖維細胞增殖困難，造成創面愈合困難，表現為A組大鼠糖尿病足病變發展較B組迅速，A組大鼠足底創面修復時間長且修復效果差。

VEGF是目前所知最強的血管內皮細胞選擇性有絲分裂因子和血管生成因子，能夠特異地直接作用于血管內皮細胞，作用包括促進新血管生成、促進血管內皮細胞增殖、提高血管通透性、改變血管外基質、維持新生血管功能，在微小血管結構和功能改變的病理生理過程中發揮重要作用[5]。VEGF在動脈閉塞病理進展及側支循環建立新生血管的過程中起著至關重要的作用，VEGF表達提高后可以通過旁分泌介導作用促進血管內皮細胞遷移、分裂、增殖，形成新的毛細血管網。A組大鼠足底創面組織中血管內皮細胞明顯減少， A組大鼠足底創面組織切片中的VEGF表達明顯低于B組，A組VEGF表達水平降低導致足底創面邊緣毛細血管通透性減弱，新生毛細血管再生數量及速度下降，直接影響足底創面的修復。

NGF是各類組織中常見的細胞生長調節因子，具有營養神經和促進神經生長的生物學功能，對中樞神經元和周圍神經的發育、分化、生長、再生及功能特性的表達具有重要調節作用。NGF不僅可以對神經元起營養保護作用，而且具有促進神經組織以外的血管生成作用[6]。NGF表達能夠為周圍神經修復早期提供蛋白合成信息，使感覺神經對氨基酸和其他小分子物質攝取增加，軸漿合成、運送加速，經再生軸突運送到感覺效應器并加速其功能恢復，促進感覺結構完整性的恢復，同時促進了神經周圍微血管的再生。Juliopieper等[7]通過實驗證實NGF可增加VEGF的mRNA和蛋白表達水平，說明NGF能夠作用于VEGF來促進內皮細胞再生并介導內皮細胞、成纖維細胞的遷移、增殖，最終形成新生血管及血管周基質。A組大鼠踝管處的神經組織中神經纖維排列明顯松散，髓鞘嚴重厚薄不均并出現嚴重空泡變性，軸索變細甚至消失。A組大鼠足底創面組織中的NGF表達明顯低于B組，NGF表達水平降低間接影響到新生血管的生成。

bFGF是具有多種生物活性的多肽類物質，對皮膚組織的成纖維細胞、血管內皮細胞等細胞有明顯的促進分化增殖作用，在皮膚損傷后的修復過程中起重要作用。 本實驗中A組大鼠足底創面組織中的細胞排列明顯松散，細胞核減少并出現空泡變性，細胞層數明顯減少，血管明顯減少。A組大鼠足底創面中的bFGF表達明顯低于B組，足底創面處的成纖維細胞、血管內皮細胞的增殖、遷移明顯減少。

綜上所述，糖尿病足大鼠合并踝管綜合征后組織中的VEGF、NGF、bFGF表達明顯降低導致足底創面不愈合，由此可見踝管綜合征對大鼠糖尿病足病變的發展有明顯促進作用。

參 考 文 獻

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