U0126對TGF-β1誘導足細胞炎癥因子分泌和miR-155表達的影響

鄭心彤 古賢君 凌霄雁 梁釗 覃卿 杜秀日 林栩

【摘要】 目的 探討細胞外調節蛋白激酶（erk）1/2通路抑制劑U0126對轉化生長因子（transforming growth factor，TGF）β1誘導足細胞炎癥因子分泌和微RNA（microRNA，miR）155表達的影響。方法 體外培養小鼠足細胞，隨機分為正常對照組、TGFβ1組和TGFβ1+U0126組，使用Western blot法檢測erk1/2磷酸化水平，ELISA法檢測足細胞上清TNFα及IL6蛋白表達水平，RTqPCR法檢測足細胞miR155表達水平。結果 與正常對照組相比，TGFβ1誘導足細胞后，erk1/2磷酸化水平明顯上升，足細胞上清IL6和TNFα蛋白分泌增多，足細胞miR155表達顯著上調，差異均有統計學意義（P<0.05）。與TGFβ1組相比，TGFβ1+U0126組erk1/2磷酸化水平被抑制，足細胞上清IL6和TNFα蛋白分泌減少，足細胞miR155表達下降，差異均有統計學意義（P<0.05）。結論 erk1/2通路抑制劑U0126可抑制足細胞炎癥因子IL6、TNFα分泌，下調足細胞miR155的表達。

【關鍵詞】 足細胞;U0126;IL6;TNFα;miR155

中圖分類號：R692 ? 文獻標志碼：A ? DOI：10.3969/j.issn.10031383.2019.05.002

【Abstract】 Objective To investigate the effects of U0126，an extracellular regulated protein kinases（erk）1/2 pathway inhibitor，on inflammatory cytokine secretion and （microRNA，miR）155 expression in podocytes induced by （transforming growth factor，TGF）β1.Methods Mouse podocytes were cultured in vitro and randomly divided into normal control group，TGFβ1 group and TGFβ1+U0126 group.The erk1/2 phosphorylation level was detected by Western blot，the expressions of supernatant TNFα and IL6 were detected by ELISA，and the miR155 expression in podocyte was detected by RTqPCR.Results Compared with the normal control group，the phosphorylation level of erk1/2 significantly increased，the secretion of supernatant IL6 and TNFα protein increased，and the expression of miR155 in podocytes significantly upregulated after TGFβ1 inducement，difference was statistically significant（P<0.05）.Compared with the TGFβ1 group，the phosphorylation level of erk1/2 in TGFβ1+U0126 group was inhibited，the secretions of IL6 and TNFα protein in podocyte supernatant decreased，and the miR155 expression in podocyte decreased，difference was statistically significant（P<0.05）.Conclusion erk1/2 pathway inhibitor U0126 can inhibit the secretions of inflammatory factors such as IL6 and TNFα，and downregulate miR155 expression in podocyte.

【Key words】 podocyte;U0126;IL6;TNFα;miR155

足細胞數量和功能的異常可導致大量蛋白尿，并發展為足細胞病。微小病變性腎病、膜性腎病和局灶節段性腎小球硬化癥等在內的許多腎小球疾病均可出現足細胞損傷，如不及時給予有效的治療，最終可發展為慢性腎臟病[1]。目前足細胞病的治療主要為免疫干預及對癥支持治療。免疫干預治療多數藥物副作用較大，沒有針對性，療效不一。細胞外調節蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，erk）1/2信號通路的主要功能是將細胞表面的信號受體傳導至細胞核中，對細胞增殖及凋亡等過程具有調控作用。有研究表明，erk1/2通路的激活與單核細胞炎癥免疫反應有關，并介導調控了單核細胞黏附、吞噬和殺傷能力[2]。本課題組前期研究探索了轉化生長因子（transforming growth factor，TGF）β1通過線粒體凋亡途徑誘導足細胞凋亡的分子機制[3]。本次實驗，我們繼續使用TGFβ1誘導足細胞損傷模型，應用erk1/2通路抑制劑U0126，研究U0126對TGFβ1誘導足細胞炎癥因子分泌和微RNA（microRNA，miR）155表達的影響，探討該通路作為腎小球疾病治療靶點的可行性。

1 材料與方法1.1 主要試劑 RPMI1640培養基（C11875500BT，Gibco）、優級胎牛血清（fetal bovine serum，FBS，SA21201，蘭州Cellmax）、PBS緩沖液（P1020500，北京Solarbio）、TGFβ1（96100212，美國PeproTech）、U0126（S1102，美國Selleck）、蛋白酶抑制劑混懸液（CW2200S，北京康為世紀）、磷酸酶抑制劑混懸液（CW2383S，北京康為世紀）、RIPA裂解液（P0010S，上海碧云天公司）、BCA蛋白濃度測定試劑盒（P0010S，上海碧云天公司）、perk1/2（#4370，美國CST）、erk1/2抗體（#9102，美國CST）、GAPDH抗體（104941AP，美國Proteintech）、RNAiso Plus（9108，日本TaKaRa）、小鼠白介素（interleukin，IL）6 ELISA Kit（CSBE04639m，武漢華美公司）、小鼠腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）α ELISA Kit（CSBE04741m，武漢華美公司）、MirXTM miRNA FirstStrand Synthesis and SYBR qRTPCR（638315，美國Clontech Laboratories）、SYBRR Premix Ex TaqTM Ⅱ （Tli RNaseH Plus，RR820A，日本TaKaRa）。

1.2 細胞培養 條件永生化小鼠足細胞購于復旦大學細胞中心，培養條件參考本課題組前期研究，并適當優化[4]。培養使用1640培養基（含10% FBS），細胞在5% CO2，37℃培養箱中進行培養，每2天傳代一次。細胞復蘇后，傳代培養14天左右分化成熟后進行后續試驗。

1.3 實驗種板及分組 實驗前一天將分化成熟的足細胞以5×104個/孔接種于6孔板中，每組設置3個平行孔，加入2 mL 含10% FBS的1640培養基。當細胞貼壁生長至70%融合時，加入含1% FBS的1640培養基同步化24小時，之后根據實驗設計加入相應處理試劑進行實驗。細胞隨機設為：正常對照組、TGFβ1組和TGFβ1+U0126組。后兩組使用12 ng/mL TGFβ1誘導足細胞，其中，TGFβ1+U0126組給予20 nM U0126;正常對照組給予等體積含10% FBS的1640培養基。

1.4 Western blot法檢測erk1/2的磷酸化水平 倒去6孔板中的細胞培養液，使用預冷的PBS緩沖液清洗3次，每孔加入100 μL 含1×蛋白酶抑制劑混懸液和1×磷酸酶抑制劑混懸液的RIPA裂解液，小心吹打混勻后冰浴裂解30分鐘，收集含細胞懸液至1.5 mL EP管中，4℃ 10 000 rpm離心10分鐘，收集含總蛋白的上清液。按BCA蛋白定量說明書操作測定總蛋白濃度，并使用RIPA裂解液調整蛋白濃度，將提取的總蛋白與5×SDS上樣緩沖液按比例配制，使其稀釋為1×SDS上樣緩沖液，在沸騰的水浴鍋中煮5分鐘使蛋白變性。每孔加入40 μg總蛋白進行SDS聚丙烯酰氨凝膠電泳，濕轉至PVDF膜，PVDF膜經封閉液室溫封閉1小時后，分別用兔抗鼠perk1/2（1∶2000）、兔抗鼠erk1/2抗體（1∶1000）、兔抗鼠GAPDH抗體（1∶2000）4℃搖床孵育過夜。次日，TBST洗膜10分鐘，重復3次后，加入辣根過氧化物酶標記的相應二抗，室溫孵育1小時，TBST洗膜10分鐘，重復3次。按ECL化學發光試劑盒說明，使用凝膠成像系統顯影，目的條帶以Image J軟件測定灰度值。

1.5 酶聯免疫吸附測定（Enzymelinked Immunosorbent Assay，ELISA）法檢測足細胞上清TNFα及IL6蛋白表達 收集6孔板中的細胞培養液上清，3500 rpm離心15 分鐘后取上清分裝，稀釋兩倍后進行后續檢測。待ELISA試劑盒升至室溫后，取出96孔加樣板，每孔加入標準品和待測樣品100 μL，小心混勻后室溫搖床上反應2小時。吸去孔內液體后，每孔加入100 μL 1×生物素化抗體，室溫搖床上反應1小時，吸去孔內液體并甩干，每孔加入200 μL 1×洗滌工作液靜置2分鐘，充分甩干，重復3次。吸去孔內液體后，每孔加入100 μL 1×辣根過氧化物酶標記結合物工作液，置于37℃溫箱中，搖床上反應1小時，吸去孔內液體并甩干，每孔加入200 μL 1×洗滌工作液靜置2分鐘，充分甩干，重復5次。每孔加入90 μL底物溶液室溫反應30分鐘后，加入50 μL種終止液，5分鐘內測定OD450及OD590。

1.6 實時熒光定量PCR（Realtime Quantitative Polymerase Chain Reaction，RTqPCR）法檢測足細胞miR155的表達 按TaKaRa RNAiso Plus 總RNA提取試劑盒說明提取RNA，電泳檢測總RNA的完整性，紫外分光光度計檢測總RNA濃度。取1 μg總RNA進行逆轉錄，按逆轉錄試劑盒配制反應體系。U6引物由Clontech逆轉錄試劑盒提供，miR155引物由吉瑪公司合成并驗證。實時熒光定量PCR反應總體系為20 μL，每個樣本重復3次，以U6作為管家基因，采用2△△CT法計算miR155的相對表達量。

1.7 統計學方法 采用SPSS 17.0軟件進行統計學分析，經正態分布檢驗及方差齊性檢驗，計量資料均符合正態分布、方差齊，以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，檢驗水準：α=005，雙側檢驗。

2 結 ?果2.1 U0126對TGFβ1誘導足細胞磷酸化erk1/2水平的影響 Western blot法檢測結果表明，TGFβ1可誘導足細胞erk1/2磷酸化水平明顯增高，磷酸化erk1/2與erk1/2灰度值之比為（1.09±0.10），U0126處理足細胞后，erk1/2磷酸化水平則被明顯抑制，灰度值之比為（0.51±0.04），但均高于正常對照組的灰度值之比（0.35±0.03），差異有統計學意義（P<005）。見圖1。

2.2 U0126對TGFβ1誘導足細胞炎癥因子釋放的影響 ELISA法檢測足細胞上清IL6及TNFα蛋白的表達。TGFβ1誘導足細胞后，細胞上清液中IL6蛋白表達水平為（56.67±1.51）ng/mL，與正常對照組（14.59±0.76）ng/mL相比明顯增加;而使用U0126抑制劑后，TGFβ1誘導增加的IL6蛋白表達水平出現下降，為（31.43±1.71）ng/mL，但仍高于正常對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。細胞上清中TNFα蛋白表達水平也檢測到與IL6蛋白相同的變化趨勢，正常對照組為（23.29±1.28）ng/mL，表達較低，TGFβ1組為（83.62±2.67）ng/mL，較正常對照組明顯升高，TGFβ1+U0126組TNFα蛋白表達水平下降，為（68.16±1.40）ng/mL，但高于正常對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖2。

2.3 U0126對TGFβ1誘導足細胞miR155表達水平的影響 RTqPCR法檢測足細胞miR155表達水平的變化。結果顯示，與正常對照組相比，TGFβ1誘導足細胞使miR155的表達水平升高（2.27±020）倍;U0126處理足細胞后，下調了miR155的表達，但仍為正常對照組的（1.94±0.06）倍，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖3。

3 討 ?論 ?足細胞是位于腎小囊壁內的臟層上皮細胞，環繞著腎小球毛細血管，足細胞向外伸展的足突相互交錯，形成了具有濾過功能的裂孔隔膜，是腎小球濾過屏障的重要組成部分。Guo等人[5]通過建立轉基因小鼠模型證實，特異性減輕足細胞損傷，不僅能減緩腎小球硬化、減輕腎小管間質纖維化，還能改善總生存率。這提示我們，足細胞損傷不僅參與了許多腎小球疾病的發病過程，還影響著疾病的發展和預后，針對足細胞特異性藥物的研究具有重要的臨床應用價值。TGFβ1是屬于轉化生長因子家族β超家族的多功能細胞因子，廣泛參與了細胞增殖、生長、分化、凋亡等過程。有報道表明，TGFβ1可能通過增加雷帕霉素靶蛋白1表達及下游因子的磷酸化，參與誘導了足細胞凋亡的過程，但其具體作用機制仍不明確[6]。本課題組前期研究已證實，12 ng/mL TGFβ1能抑制足細胞增殖，下調足細胞特異性蛋白nephrin的表達，從而有效誘導足細胞損傷[7]。本次研究，我們使用TGFβ1誘導體外培養的足細胞，并應用erk1/2通路抑制劑U0126進行干預，觀察U0126的應用對炎癥因子釋放和miR155表達的影響，探討足細胞免疫炎癥性損傷的分子機制。

在細胞損傷應激的過程中，常常由多條信號轉導通路介導，影響著細胞損傷的過程，erk1/2為信號通路的關鍵因子，也是許多藥物治療的重要靶點。在許多腎小球疾病中，均可出現erk1/2磷酸化水平的升高。Mouawad等人[8]研究發現，膜性腎病小鼠模型中，erk1/2通路被激活，并且與足細胞肌動蛋白骨架結構破壞有關。Zhu等人[9]則抑制erk1/2通路的活性，觀察到系膜細胞增殖相關基因的表達也出現改變，影響了系膜增生性腎炎的進展。此外，erk1/2磷酸化的水平與炎癥反應密切相關，在急進性腎小球腎炎中，erk1/2的活化不僅影響系膜細胞增生，還參與調控巨噬細胞浸潤[10]。本次研究結果表明，TGFβ1誘導足細胞后，erk1/2磷酸化的水平顯著升高，erk1/2通路被激活，這證實erk1/2通路參與了TGFβ1誘導的足細胞損傷，而其調控作用的機制，我們將進一步設計實驗對其進行研究。

免疫性腎小球疾病的發病過程中，常伴隨著炎癥因子的產生，并繼發一系列炎癥反應。局灶節段性腎小球硬化的患者體內，活化T細胞核因子1介導了TNFα的分泌，誘發游離膽固醇依賴性足細胞凋亡，影響了疾病的進展[11]。在糖尿病腎病中，炎性因子IL6、TNFα釋放增加可誘發內質網應激，從而導致足細胞損傷[12]。還有研究表明，霉酚酸酯、他克莫司和類固醇聯合治療狼瘡性腎炎時，可強烈抑制IL6途徑，有助于穩定足細胞骨架結構，因而表現出比常規治療更好的療效[13]。因此，炎癥免疫反應是腎小球疾病發病的主要因素之一，研究U0126對TGFβ1誘導足細胞炎癥因子的影響具有重要意義。我們的實驗結果發現，TGFβ1誘導足細胞可顯著增加炎癥因子IL6、TNFα的釋放，引起足細胞炎癥應激反應，進一步應用U0126抑制erk1/2通路后，炎癥因子釋放減少，提示erk1/2通路參與調節TGFβ1誘導足細胞損傷過程中的炎癥反應，U0126的使用可減輕這一應激反應。

MiR155為非編碼微小RNA，在病理生理過程中，miRNA通過與靶基因結合在轉錄后水平調節著基因表達，參與了許多疾病的發病機制，并且有望成為新的診斷標志物。Muller等人[14]對不同腎小球疾病患者的尿液和體外培養的足細胞、腎小球內皮細胞、腎小球系膜細胞、腎小管細胞中miRNA的表達進行篩選，發現miR155表達顯著上調，有望成為腎小球疾病相關的新型診斷指標，但其具體機制有待進一步研究。眾所周知，miR155與免疫調節功能密切相關，不僅對免疫細胞具有調節作用，還能影響免疫炎癥相關的信號轉導通路調節炎癥介質的表達。因此我們推測，miR155可能參與了U0126抑制TGFβ1誘導足細胞炎癥反應的過程。本次研究我們發現，正常足細胞miR155的表達水平較低，TGFβ1干預后miR155的表達水平明顯上調，進一步實驗發現，應用U0126可下調TGFβ1誘導升高的miR155表達。這說明，miR155與U0126影響TGFβ1誘導足細胞損傷的機制關系密切，值得我們對其進行深入研究。

綜上所述，我們發現erk1/2在TGFβ1誘導足細胞損傷的過程中被明顯激活，U0126的應用抑制了erk1/2通路，使炎癥因子IL6、TNFα釋放減少，miR155表達水平降低，從而減輕了TGFβ1誘導足細胞引起的炎癥應激反應。本研究有望為腎小球疾病足細胞損傷的治療提供新策略。