響應(yīng)面法優(yōu)化軟棗獼猴桃組培增殖培養(yǎng)基

趙春莉，湯昊，姚思揚(yáng)，王曼，吳雙，王一飛，胡釗源

摘要：目的：研究優(yōu)化軟棗獼猴桃的增殖培養(yǎng)基。方法：以軟棗獼猴桃初代培養(yǎng)的不定芽為外植體，利用響應(yīng)面法對其增殖培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化。在單因素的試驗(yàn)基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計原理，以6-BA、IAA、IBA為試驗(yàn)因子，植株再生頻率為響應(yīng)值，進(jìn)行三因素三水平的試驗(yàn)設(shè)計。結(jié)果表明：三因素對植株再生頻率的影響力大小為6-BA>IBA>IAA，最終得到的二元回歸方程顯示，一步成苗的培養(yǎng)基優(yōu)化結(jié)果為MS+6-BA1.61mg/L+IAA0.55 mg/L+IBA0.33 mg/L。在此條件下，最佳再生頻率預(yù)測值為7.27，實(shí)際操作結(jié)果為7.23，說明該方程預(yù)測與實(shí)際試驗(yàn)擬合度較好，該優(yōu)化方案有實(shí)際意義和可行度。

關(guān)鍵詞：響應(yīng)面;優(yōu)化;增殖系數(shù);軟棗獼猴桃

基金項目：吉林省重點(diǎn)科技攻關(guān)項目：編號20140204030NY，編號20140101271JC; 科技創(chuàng)新基金項目：編號（2017496）

中圖分類號： Q949.758.2 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼： ?A ? ? ? ? ? ? ? ? ? DOI編號： 10.14025/j.cnki.jlny.2019.02.024

軟棗獼猴桃（Actinidia arguta）為多年生落葉藤本，在我國主要分布在東北、華北、西北及長江流域，在吉林省主要分布在長白山區(qū)各縣，是著名的經(jīng)濟(jì)野果[1]。野生軟棗獼猴桃酸甜可口，富含營養(yǎng)成分，如黃酮及苷、氨基酸、有機(jī)酸、油脂及多糖、蛋白質(zhì)、脂肪、維生素A、維生素C、葉綠素、果膠、胡蘿卜素等[2，3]，還可加工成果脯、果酒、果汁等產(chǎn)品，有良好的食用價值。其根、莖、葉均可入藥，可治療消化不良、腹瀉、嘔吐和風(fēng)濕性關(guān)節(jié)痛，有抗衰防癌的功效[4]，具有良好的藥用價值和經(jīng)濟(jì)價值。

軟棗獼猴桃的常見繁殖方法有種子繁殖、扦插繁殖和嫁接繁殖，但種子繁殖生長周期長，扦插和嫁接成活率低[5]，組織培養(yǎng)是快速繁殖大量植株并保留其優(yōu)良性狀的有效途徑。目前，關(guān)于軟棗獼猴桃的組培已有一些研究報道，在增殖階段的研究中[6-9]，一般通過調(diào)整植物生長調(diào)節(jié)劑的種類及濃度，來篩選增殖系數(shù)更高的培養(yǎng)基，但增殖系數(shù)不夠理想。增殖培養(yǎng)常用的植物生長調(diào)節(jié)劑有6-BA、IBA、NAA、IAA、KT等，但研究其中交互作用的文章未見報道。本次試驗(yàn)用響應(yīng)面的研究方法，選用6-BA、IAA、IBA三種植物生長調(diào)節(jié)劑，以初代培養(yǎng)產(chǎn)生的不定芽為試驗(yàn)材料，探究最適宜軟棗獼猴桃增殖的培養(yǎng)基，以及三種植物生長調(diào)節(jié)劑之間的交互作用，以期獲得高于前人研究的增殖系數(shù)，在一定程度上優(yōu)化軟棗獼猴桃的快繁體系，為今后的相關(guān)研究提供理論實(shí)踐基礎(chǔ)。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

外植體為長白山野生軟棗獼猴桃?guī)а壳o段，于2017年5月采自吉林長白山地區(qū)，經(jīng)消毒后接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基：MS+6-BA1.0mg/L+IBA0.1mg/L中，培養(yǎng)30d后，選取長勢一致的不定芽為試驗(yàn)材料。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1單因素試驗(yàn) 為探究每種生長激素的不同濃度對外植體產(chǎn)生的影響，以MS為基本培養(yǎng)基，將6-BA、IBA、IAA分別設(shè)置5種濃度：6-BA（0.5mg/L，1.0mg/L，1.5mg/L，2.0mg/L，2.5mg/L）;NAA（0.05mg/L，0.10mg/L，0.20mg/L，0.40mg/L，0.80mg/L）;IAA（0.05mg/L，0.10mg/L，0.20mg/L，0.40mg/L，0.80mg/L）。將不定芽分別接種到培養(yǎng)基內(nèi)，每個處理接10個不定芽，3次重復(fù)，30d后，統(tǒng)計增殖系數(shù)。增殖系數(shù)=培養(yǎng)30天后不定芽總數(shù)/接種的不定芽數(shù)。

1.2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，應(yīng)用響應(yīng)面分析法，根據(jù)Box-Behnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計原理，以6-BA、IAA、IBA為試驗(yàn)因子，增殖系數(shù)為響應(yīng)值，設(shè)計三因素三水平的優(yōu)化試驗(yàn)，見表1，每個水平處理10個組培苗，培養(yǎng)周期為30d。

1.3 培養(yǎng)條件

基礎(chǔ)培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，蔗糖30g/L，瓊脂粉8g/L，pH值為5.8～6.0。培養(yǎng)環(huán)境為溫度（25±2）℃，光照強(qiáng)度2000lx，每天光照14h。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS20.0和Design-Expert8.0.6軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行整理與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 6-BA濃度對增殖系數(shù)的影響 由表2可知，6-BA對不定芽增殖的效果較顯著，6-BA濃度為0.5、1.0mg/L時，產(chǎn)生的新芽葉片為嫩綠色，芽細(xì)弱矮小，長勢不佳。隨著濃度的升高，增殖系數(shù)隨之升高，6-BA濃度為2.0mg/L時，達(dá)到了最佳增殖系數(shù)4.07，新生芽多，莖較粗壯，與其他處理有顯著差異。但濃度超過2.5mg/L，增殖率下降，植株葉片邊緣發(fā)黃，芽較細(xì)弱，長勢不佳，可見6-BA濃度過高，對芽苗增殖分化有抑制作用。

2.1.2 IAA濃度對增殖系數(shù)的影響 由表3可知，低濃度的IAA對不定芽幾乎無促進(jìn)增殖的作用，新生芽極少，且莖段及葉片呈白綠色，長勢不佳。IAA濃度越高，不定芽增殖系數(shù)越高，當(dāng)IBA濃度為0.40mg/L時，最佳增殖率為2.37，芽苗翠綠色，長勢健壯。

2.1.3 IBA濃度對增殖系數(shù)的影響 由表4可知，低濃度的IBA對不定芽增殖的促進(jìn)作用較弱，芽呈嫩綠色，較細(xì)弱，隨著IBA濃度的升高，增殖系數(shù)有所上升，新生芽漸多，且翠綠粗壯。IBA濃度為0.20mg/L、0.40mg/L時增殖系數(shù)無顯著差異，新生芽較多，芽長勢健康。IBA濃度為0.40mg/L時，增殖系數(shù)最佳，植株健壯，長勢良好。

2.2 軟棗獼猴桃增殖培養(yǎng)基的優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1回歸方程分析 ?以6-BA（X1）、IAA（X2）、IBA（X3）為自因素，以植株再生頻率（Y）為響應(yīng)值，設(shè)計了17組試驗(yàn)，5個中心試驗(yàn)，見表5。得到回歸方程為：Y=7.04+0.69X1+0.33X2+0.51X3+0.20X1X2+0.12X1X3-0.10X2X3-1.76X12-1.03X22-0.51X32。R2=0.9694，說明試驗(yàn)值與預(yù)測值有較高的相關(guān)性，該回歸模型的P值<0.0001，有極顯著性。失擬項F值=0.0551>

0.05，不顯著。說明該方程模型擬合度良好，試驗(yàn)誤差小。表6中，X1、X3、X12、X22均呈極顯著影響（P<0.01），X2、X32呈顯著影響（P<0.05）。X1X2、X2X3、X1X3不顯著。說明三種單因素對植物的增殖系數(shù)有顯著影響，但三者之間的交互作用不顯著。單因素對響應(yīng)值的影響力大小為6-BA>IBA>IAA。

2.2.2響應(yīng)面分析 等高線的形狀可體現(xiàn)兩因素交互作用的大小，圓形表示交互作用小，橢圓形則相反[10]。響應(yīng)面的坡度變化可體現(xiàn)因素對響應(yīng)值的影響力，坡度平緩說明影響力小，坡度陡說明影響顯著[11]。由圖1～圖3可知，IAA與6-BA的曲面最陡，呈明顯凸面，6-BA與IBA的曲面偏陡，IBA與IAA的曲面相對平緩。由此可知，三種因素的交互作用對響應(yīng)值的影響力大小為X1X2>X1X3>X2X3。

2.2.3 模擬方程的驗(yàn)證試驗(yàn) 通過二次回歸方程的分析可得出軟棗獼猴桃增殖培養(yǎng)基中，三種植物生長調(diào)節(jié)劑的最佳濃度為：6-BA1.61mg/L，IAA0.55 mg/L，IBA為0.33mg/L，最佳增殖頻率預(yù)測值為7.27。對該模型進(jìn)行三次驗(yàn)證試驗(yàn)，每次處理10個不定芽，得出的三次結(jié)果為：7.3，6.9，7.5，平均結(jié)果為7.23。與方程預(yù)測值接近，說明該方程預(yù)測與實(shí)際試驗(yàn)擬合度較好，該優(yōu)化方案有實(shí)際意義和可行度。

3 討論

增殖培養(yǎng)是組培試驗(yàn)中至關(guān)重要的階段，植物生長調(diào)節(jié)劑的種類及濃度對不定芽的分化、增殖及組培苗的長勢有著不同程度的影響[12.13]。本次試驗(yàn)以初代培養(yǎng)誘導(dǎo)出的不定芽為試驗(yàn)材料，通過調(diào)整6-BA、IAA、IBA三種植物調(diào)節(jié)劑的濃度，篩選出了適宜軟棗獼猴桃增殖的培養(yǎng)基，最佳增殖系數(shù)為7.23。有研究用2mg/L的6-BA和0.2mg/L的IBA對軟棗獼猴桃進(jìn)行增殖培養(yǎng)，得到的最佳增殖系數(shù)為5.0[14]。也有研究用到0.8mg/L的6-BA和0.3mg/L的NAA，得到最佳增殖系數(shù)為4.84[15]。還有研究篩選的最佳增殖培養(yǎng)基為MS+BA 1.5mg·L-1+IBA 0.1mg·L-1，增殖系數(shù)達(dá)4.5[16]。本次的試驗(yàn)結(jié)果明顯高于上述研究，可能是因?yàn)樗x的3種植物生長調(diào)節(jié)劑間相互作用對不定芽有更好的促進(jìn)作用，其濃度經(jīng)過Design-Expert8.0.6所得方程更為精確的計算，所以有了很好的增殖效果，高于部分前人的研究結(jié)果。

在單因素的試驗(yàn)過程中，發(fā)現(xiàn)低濃度的植物生長調(diào)節(jié)劑對不定芽促進(jìn)作用不顯著，植株長勢細(xì)弱，可能因濃度未達(dá)到其生長分化的需求量。但6-BA濃度為2.5mg/L，IBA濃度為0.8mg/L時，增殖率都有所下降，且試管苗葉片發(fā)黃卷曲，莖段細(xì)弱，長勢不佳。這與前人研究結(jié)果一致，該研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)添加的6-BA和IBA的濃度逐漸高于2.0mg/L和0.2mg/L 時，叢生芽增殖系數(shù)呈下降趨勢[17]。說明高濃度的生長調(diào)節(jié)劑對試管苗的增殖分化促進(jìn)效果減弱，抑制其增殖生長，在組培試驗(yàn)中，要控制好植物生長調(diào)節(jié)劑的濃度，才可得到最佳的試驗(yàn)效果。

響應(yīng)面法是一種綜合試驗(yàn)設(shè)計和數(shù)學(xué)建模的優(yōu)化方法，通過對具有代表性的局部各點(diǎn)進(jìn)行試驗(yàn)，回歸擬合全局范圍內(nèi)因素與響應(yīng)值間的函數(shù)關(guān)系，計算各因素最佳水平值[18]。相比于常用的正交設(shè)計，響應(yīng)面法可分析幾種因素間的交互作用，以達(dá)到較全面地反映各因素水平的效果。可在整個區(qū)域上因素的最佳組合和響應(yīng)值的最優(yōu)值，且實(shí)驗(yàn)次數(shù)少，節(jié)省了試驗(yàn)成本和時間。

參考文獻(xiàn)

[1]牛曉林.長白山軟棗獼猴桃組織培養(yǎng)和快繁技術(shù)研究[D].南京林業(yè)大學(xué)，2012.

[2]孫寧寧.長白山野生軟棗獼猴桃的成分分析及保鮮研究[D].吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2007.

[3]張嵐芝，張先，周美英，等.3 種長白山野生獼猴桃營養(yǎng)及功能成分比較[J].延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)學(xué)報，2010，32（02）：106-109，118.

[4]王曉東，段全猛.軟棗獼猴桃的利用與栽培[J].特種經(jīng)濟(jì)動植物，2006（02）：33-34.

[5]鄭小華.軟棗獼猴桃莖、葉離體培養(yǎng)與植株再生的研究[D].四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008.

[6]劉延吉，郝桂杰，姜巖巖，等.不同品種野生軟棗獼猴桃最佳組培方法的研究[J].北方園藝，2012（17）：124-126.

[7]鄧踐.軟棗獼猴桃“龍成2號”組培擴(kuò)繁技術(shù)研究[J].遼寧林業(yè)科技，2017（02）：38-40.

[8]胡皓，張志東.軟棗獼猴桃“魁綠”品種組培微繁技術(shù)研究[J].吉林農(nóng)業(yè)，2011（02）：71-72.

[9]屈德洪，吳景芝，吳興恩，等.野生軟棗獼猴桃種子萌發(fā)及離體快繁技術(shù)研究[J].西部林業(yè)科學(xué)，2017，46（06）：56-60.

[10]代文亮，程龍，陶文沂.響應(yīng)面法在紫杉醇產(chǎn)生菌發(fā)酵前體優(yōu)化中的應(yīng)用[J].中國生物工程雜志，2007（11）：66-72.

[11]張黎明，李瑞超，郝利民，等.響應(yīng)面優(yōu)化瑪咖葉總黃酮提取工藝及其抗氧化活性研究[J].現(xiàn)代食品科技，2014，30（04）：233-239.

[12]譚文澄，戴策剛.觀賞植物組織培養(yǎng)技術(shù)[M].北京：中國林業(yè)出版社，1999.

[13]張建華，張建鳳.幾種植物生長調(diào)節(jié)劑及硝酸鹽對唐菖蒲繼代苗芽增殖的影響[J].青海大學(xué)報，2012，30（05）：20-22.

[14]劉長江，劉國成，趙德英，孫曉榮.野生軟棗獼猴桃莖尖培養(yǎng)研究[J].中國樹，2009（02）：32-34.

[15]屈德洪，吳景芝，吳興恩，等.野生軟棗獼猴桃種子萌發(fā)及離體快繁技術(shù)研究[J].西部林業(yè)科學(xué)，2017，46（06）：56-60.

[16]盧華，林強(qiáng).“桓優(yōu)1號”軟棗獼猴桃離體快繁研究[J].遼寧林業(yè)科技，2016（02）：27-29.

[17]趙芮.軟棗獼猴桃離體快繁技術(shù)的研究[D].吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，2016.

[18]李莉，張賽，何強(qiáng)，胡學(xué)斌.響應(yīng)面法在試驗(yàn)設(shè)計與優(yōu)化中的應(yīng)用[J].實(shí)驗(yàn)室研究與探索，2015，34（08）：41-45.

[19]趙強(qiáng)，余四九，王廷璞，等.響應(yīng)面法優(yōu)化禿瘡花中生物堿提取工藝及抑菌活性研究[J].草業(yè)學(xué)報，2012，21（04）：206-214.

[20]海洪，汪坤，金文英，王新雯.Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波提取蠶沙中葉綠素的工藝研究[J].食品工業(yè)科技，2009，30（03）：207-209+211.

作者簡介：趙春莉，博士，副教授，研究方向：觀賞植物資源引種馴化及繁殖技術(shù)。