一種高靈敏檢測貝類中大田軟海綿酸的可拋式核酸適配體傳感器

陳佳琦 吳海燕 張旭志 鄭關超 孫曉杰 郭萌萌 譚志軍 翟毓秀 牟海津

摘?要?以能夠特異性識別大田軟海綿酸（Okadaic acid，OA）的核酸適配體作為識別探針，先利用磁力吸附將核殼型納米金磁微粒（Fe3O4@Au）固定在絲網印刷金電極（Screen-printed gold electrode，SPGE）的表面，然后利用AuS鍵固定核酸適配體，構建了可拋式核酸適配體傳感器，用于貝類中OA的高靈敏測定。采用電化學阻抗譜進行測試，利用核酸適配體與OA結合前后工作電極表面電子傳遞阻抗值的變化量與OA濃度對數值之間的線性關系，實現貝類中OA的定量檢測。此傳感器制備簡單，采用Fe3O4@Au修飾傳感界面，通過增大工作電極的比表面積提高核酸適配體的組裝量，提高了方法的靈敏度;將核酸適配體作為識別探針，相比抗體的使用大大降低了方法成本;一次性可拋SPGE的應用，省去傳統電極使用前必需的繁雜拋光過程。采用此傳感器進行貝類中OA的檢測，線性范圍為1～800 μg/kg，檢出限為1 μg/kg;回收率在92.0%～118.6%范圍內，相對標準偏差為5.8%～11.6%。本方法簡便高效且重現性良好，可實現大批量樣品的篩查與定量分析。

關鍵詞?大田軟海綿酸;核酸適配體傳感器;電化學阻抗譜;絲網印刷金電極;高靈敏檢測

1?引 言

大田軟海綿酸（Okadaic acid，OA）是腹瀉性貝類毒素（Diarrhetic shellfish poisoning，DSP）的主要致毒組分，由利馬原甲藻及部分鰭藻等產毒微藻產生，經雙殼貝類濾食性攝入后富集在消化腺內[1]。OA可引發誤食者惡心、嘔吐、腹瀉;對細胞質內蛋白磷酸酶的活性有強烈的抑制作用[2]，影響正常的細胞活動;甚至對人類細胞具有直接的毒害作用，干擾DNA的修復過程[3]，改變基因的表達，誘導腫瘤形成[4]。為消除毒素對自身的毒害作用，貝類可通過復雜的生化反應將部分高毒性游離態的OA轉化為形態各異的低毒性酯化態衍生物[5]。此外，因OA具有脂溶性和熱穩定性，在加工過程中很難通過常見的加工技術將其去除，甚至可能因貝類脫水及酯化態毒素向游離態的轉化，從而導致毒素的毒性增強[6]。為加強貝類安全的前端防控，歐盟現行法規規定雙殼貝類可食性組織中DSP含量不得超過160 μg/kg（以OA計）[7]，為進一步降低食用風險，歐盟食品安全局根據風險評估結果擬將其降低至45 μg/kg[8]。我國國標NY 5073-2006規定其不得檢出[9]。由于倫理道德等原因，歐盟指令（EC）No.15/2011規定小鼠生物法作為官方標準方法僅限于2014年底前使用，以液相色譜-串聯質譜法（LC-MS/MS）作為取代方法，并鼓勵建立免疫分析等新型檢測方法作為補充方法[10]。

電化學生物傳感器因其靈敏度高、快速便攜等優勢在檢測領域得到廣泛關注，核酸適配體也因其能與目標物如重金屬離子[11]、毒素[12]、抗生素[13]或病毒[14]等高親和力、高特異性結合的特點[15]， 在電化學生物傳感器的研制中得到廣泛應用[16]。與傳統電極相比絲網印刷電極（Screen-printed electrode，SPE）具有方便使用、溶液消耗少、三電極體系集成于一體以及使用時不需額外拋光處理等優勢[17， 18]。 同時， SPE具有用后可拋的特點，避免了因基質成分或待測物在電極表面的吸附而造成的電極污染或鈍化現象[19]。基于SPE建立的電化學生物傳感器具有靈敏穩定、易于小型化的優勢[20]。

本研究以絲網印刷金電極（Screen-printed gold electrode，SPGE）為基底電極，研制了可拋式核酸適配體傳感器，并引入核殼型納米金磁微粒（Fe3O4@Au）[21]，以提高方法的靈敏度。由于貝類體內的OA總量由游離態毒素及酯化態衍生物共同組成，而目前的檢測方法通常僅針對游離態OA進行檢測[22，23]，故可能會因低估毒素的含量而導致食用風險[24]。本方法以自行研制的電化學生物傳感器為檢測手段，同時在貝類樣品前處理過程中增加堿性水解步驟，將OA的酯化態衍生物轉化為游離態OA[25]，實現了貝類體內OA總量的高靈敏檢測。

2?實驗部分

2.1?儀器、試劑與材料

CHI660D電化學工作站（上海辰華公司）;T18 basic型均質機（德國IKA 公司）;KQ-300E型超聲波提取儀（昆山市超聲儀器有限公司）;Himac CR 22GⅡ型高速離心機（日本Hitachi公司）;N-EVAPTM112型氮氣吹掃儀（美國Organomation公司）;Milli-Q超純水儀（美國Millipore公司）;220BT絲網印刷金電極（SPGE，包括金工作電極（Φ=4.0 mm）、對電極和銀參比電極，西班牙DropSens 公司）。

大田軟海綿酸（Okadaic acid，OA）、鰭藻毒素-1（Dinophysistoxin-1，DTX-1），純度≥95%（臺灣Algalchem公司）;鰭藻毒素-2（Dinophysistoxin-2，DTX-2，CRM-DTX2-b，（3.8±0.2） μg/mL）、蛤毒素-2（Pectenotoxin-2，PTX-2，CRM-PTX2-b，（4.4±0.13） μg/mL）、蝦夷扇貝毒素（Yessotoxin，YTX，CRM-YTX-c， 4.3 μmol/L）、DSP陽性貽貝質控樣品（CRM-DSP-Mus-c，OA總含量2.4 mg/kg），均購于加拿大國家海洋研究中心;GoldMag納米金磁微粒（Fe3O4@Au，30 nm，5 mg/mL，西安金磁納米生物技術有限公司）;PBS緩沖液試劑片（Phosphate buffered saline tablet）、 6-巰基-1-己醇（6-Mercapto-1-hexanol，MCH）; K3[Fe（CN）6]、K4[Fe（CN）6]·3H2O、KCl（美國Sigma公司）;甲醇（HPLC級，德國Merck公司）; 5'端巰基修飾核酸適配體（Aptamer，5'-SH C6-GGT CAC CAA CAA CAG GGA GCG CTA CGC GAA GGG TCA ATG TGA CGT CAT GCG GAT GTG TGG-3'）由上海生工生物工程股份有限公司合成;其它未作特殊說明的試劑均為分析純。實驗用水為超純水（18.2 MΩ· cm）。

實驗所用牡蠣、貽貝和扇貝樣品于2018年7月購自青島市水產品批發市場，經LC-MS/MS方法[26]檢測為OA陰性。樣品洗凈瀝水，去殼勻漿后于20℃冷凍保存。

2.2?溶液的配制

核酸適配體溶液（5 μmol/L）和MCH溶液（1 mmol/L）均由PBS緩沖溶液（10 mmol/L，pH 7.4）配制。OA標準溶液：以PBS緩沖溶液稀釋OA工作液（甲醇配制，1 μg/mL），配制成濃度分別為0.1、0.5、1、5、10、50和80 ng/mL的系列標準溶液。Fe3O4@Au混懸液：使用前用PBS緩沖溶液清洗2次后，稀釋至濃度為1 mg/mL。檢測液用PBS緩沖溶液配制，含5 mmol/L K3[Fe（CN）6]、5 mmol/L K4[Fe（CN）6]和0.1 mol/L KCl。

2.3?樣品的前處理

稱取2 g勻漿樣品，用18 mL甲醇分兩次進行毒素提取，渦旋振蕩2 min，8000 r/min離心5 min，合并兩次上清液，以甲醇定容至20 mL。準確移取1 mL提取液，加入125 μL 2.5 mol/L NaOH混勻后密封，于76℃下孵育40 min。待溶液冷卻至室溫，加入125 μL 2.5 mol/L HCl溶液中和，氮吹近干，再加入1 mL PBS緩沖溶液復溶，渦旋混勻，待測。

2.4?可拋式電化學核酸適配體傳感器的構建

絲網印刷金電極（SPGE）使用前置于0.5 mol/L H2SO4溶液中進行預處理，在0～1.25 V電位范圍內以0.1 V/s速率采用循環伏安法（Cyclic voltammetry，CV）掃描5 min，以提高傳感界面的粗糙度，利于其功能化修飾[27]。將SPGE用超純水沖洗并吹干后，在其工作電極背面對應處固定一個直徑4 mm的圓形磁鐵，在工作電極表面滴加10 μL 1 mg/mL Fe3O4@Au混懸液，待Fe3O4@Au固定后，滴加10 μL 5 μmol/L核酸適配體溶液，置于濕盒中反應過夜。用超純水沖洗后，在工作電極表面滴加10 μL 1 mmol/L MCH溶液反應1 h，以封閉多余的吸附位點，即完成傳感器的制備。

2.5?測試方法

在傳感器工作電極表面滴加10 μL OA標準溶液或樣品溶液，反應45 min，用超純水沖洗后，在檢測液中進行電化學阻抗譜（Electrochemical impedance spectroscopy，EIS）測試，頻率范圍0.1～10000 Hz，振幅0.01 V，初始電位0.23 V。記錄標準溶液或樣品溶液反應前后的阻抗值，進行定量分析。

3?結果與討論

3.1?傳感界面的構建及電化學表征

可拋式核酸適配體傳感器的構建及檢測原理如圖1所示。適配體序列參考文獻[28]，在能夠特異性結合OA的核酸適配體的5'端修飾巰基，通過AuS鍵將核酸適配體直接固定或通過核殼型納米金磁微粒（Fe3O4@Au）固定在傳感界面。無OA存在時，適配體的空間結構比較松散，阻礙電子在傳感界面的傳遞，導致傳感器阻抗值升高;當OA存在時，與核酸適配體結合后空間結構變得緊密，為電子的傳遞提供更多的空間，阻抗值下降。根據傳感器反應前后阻抗值的變化量與OA濃度之間的關系實現對毒素的定量檢測。

采用CV和EIS對SPGE的修飾過程進行表征，CV結果如圖2A所示，電壓范圍0.3～0.5 V，掃描速率為0.1 V/s。圖2B為電化學阻抗譜的Nyquist圖，其高頻區的半圓直徑對應電極表面的電子傳遞阻抗Ret。裸電極表面電子可以自由傳遞（Ret=41.06）。核酸適配體的結合增加了電極表面的傳質阻力，

導致Ret值顯著上升（865.90 Ω）;MCH的封閉進一步阻礙電子的轉移，Ret值繼續增大（1498 Ω）;當OA與核酸適配體特異性結合后，Ret值下降（1085 Ω），說明二者的結合促進了傳感界面電子的傳遞。這是因為核酸適配體結合目標物后的空間結構更加緊密，使Ret值降低，與文獻報道結果類似[29，30]。

為提高傳感界面核酸適配體的組裝量，在傳感器的構建中引入核殼型納米金磁微粒（Fe3O4@Au）以增大SPGE工作電極的比表面積。當未修飾Fe3O4@Au時，SPGE在核酸適配體固定前后的ΔRet為418.74 Ω，而在修飾Fe3O4@Au后，ΔRet值增至865.90 Ω，表明Fe3O4@Au的引入可提高傳感界面核酸適配體的組裝量。

3.2?實驗條件的優化

3.2.1?核酸適配體濃度的優化?傳感界面核酸適配體的組裝量可影響目標物的結合量，進而影響方法的檢測性能。對核酸適配體溶液濃度進行了優化。分別在已固定Fe3O4@Au的傳感界面滴加濃度為1、2、5和10 μmol/L的核酸適配體溶液，反應過夜后，進行EIS測試。如圖3所示，隨著適配體濃度的增大，ΔRet隨之增大，當適配體濃度為5 μmol/L時，ΔRet達到最大值，隨后趨于穩定，表明核酸適配體的結合量已達到飽和。因此，在后續實驗中采用5 μmol/L核酸適配體溶液進行電極組裝。

3.2.2?目標物孵育時間的優化?目標物的孵育時間也是影響核酸適配體傳感器性能的因素之一。考察了不同孵育時間時，傳感器與OA結合前后的ΔRet值。如圖4所示，隨著孵育時間的延長，ΔRet增大，當時間達到45 min以后，ΔRet趨向平穩，因此選擇45 min作為孵育時間。

3.3?傳感器的分析性能

測定不同濃度的OA標準溶液在適配體傳感器上的阻抗響應值，以OA與電極反應前后ΔRet值為縱坐標， OA溶液濃度對數值為橫坐標，繪制標準曲線。由圖5可見，ΔRet與OA濃度（0.1～80 ng/mL）對數值呈線性關系，線性回歸方程為y=189.12lnx+752.59（R2=0.9976），檢出限為0.1 μg/L（S/N=3），空白樣品基質與PBS緩沖溶液的響應相當，表明貝類基質對傳感器測定基本無干擾，應用于實際貝類樣品檢測時最低檢出濃度為1 μg/kg， 與LC-MS/MS方法[26]相比降低了一個數量級，定量范圍為1～800 μg/kg。而傳感界面無Fe3O4@Au修飾時，傳感器的線性范圍為5～500 μg/kg，實際檢測時的最低檢出濃度為5 μg/kg。上述結果表明，傳感器構建過程中Fe3O4@Au的引入可顯著提高檢測方法的靈敏度，并擴大了線性范圍。