分子標記輔助離體葉片接種鑒定甜瓜蔓枯病極端抗感單株

任琴琴 魯秀梅 柯思佳 錢春桃

摘? ? 要： 為了構建抗感基因池，快速準確篩選抗感單株，進行抗蔓枯病基因的精細定位，加速育種進程，采用分子標記輔助離體葉片接種鑒定，篩選極端抗感單株。研究結果表明，利用甜瓜F2群體的96株植株，接種5 d后快速準確篩選到抗感單株分別為17株和15株，抗感植株的離體葉片接種鑒定與分子標記篩選的相關系數分別達0.85和0.68。

關鍵詞： 甜瓜;蔓枯病;分子標記;離體葉片;接種鑒定

In vitro leaf inoculation combing with molecular marker selection to identify extreme resistance and susceptibility of melon to gummy stem blight

REN Qinqin，LU Xiumei，KE Sijia，QIAN Chuntao

（State Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement，College of Horticulture， Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095， Jiangsu， China）

Abstract： In order to rapidly and accurately screen resistant plants， gene pools of resistant and susceptible were constructed to fine map resistance genes to gummy stem blight ， aiming to accelerate the breeding process.In this study， in vitro leaf inoculation combing with molecular marker-assisted selection was performed to identify extreme resistant plants. Results have shown that 96 indivduals of melon F2 population were used to screen rapidly and accurately 17 resitant plants and 15 susceptible plants 5 days after inoculation. The resistance and susceptible correlation coefficients of in vitro leaf inoculation identification and molecular marker screening results were 0.85 and 0.68， respectively.

Key words： Melon; Gummy stem blight; Molecular marker; In vitro leaf; Inoculation identification

甜瓜是世界上十大水果之一，營養豐富，深受消費者的喜愛。蔓枯病是限制甜瓜優質、高產的主要病害之一。在我國浙江、江蘇、河南、甘肅、新疆等地均有蔓枯病爆發，而且呈逐年加重趨勢[1]，篩選抗蔓枯病資源和培育抗蔓枯病品種具有重要意義[2]。常規育種周期長，常依賴于育種家的經驗和機遇，帶有很大的盲目性和機遇性，而分子標記可以提高育種效率。

‘PI 420145是葫蘆科甜瓜屬甜瓜種質資源，起源于日本，經研究發現屬于高抗蔓枯病的甜瓜材料，在江蘇一帶地區栽培，綜合性狀優良;抗性遺傳規律為單個顯性基因控制[3-4]，同時，Wolukau等[4-5]利用感病親本‘PI 5136170和抗病‘PI 420145，構建F2群體，苗期活體接種鑒定，篩選到抗感植株，采用BSA分析和AFLP引物進行分子標記，篩選得到4個與其所含抗病基因Gsb-6連鎖的AFLP標記，但由于存在遺傳距離較遠，篩選率低。因此需篩選抗感單株、構建抗感基因池，需更進一步的抗蔓枯病基因的精細定位，加速抗蔓枯病育種進程。

對現有的種質資源進行抗性鑒定是建立抗感基因池的前提。目前，國內對甜瓜蔓枯病的抗性鑒定多采用苗期接種鑒定[6]，多項研究表明，苗期接種鑒定易受溫度、濕度等環境條件的影響，且單一鑒定方法常造成鑒定結果不穩定，不能完全反應材料的抗性程度[7];此外，苗期接種發病周期長、成本高，植株接種后無法進行后續的生長研究使用，對甜瓜蔓枯病鑒定的準確性有一定影響[8-9]。而采用離體接種鑒定具有準確、快速、篩選量大、受外界環境條件影響較小等優點[10]。因此，利用致病性極強的蔓枯病原菌，以抗病材料‘PI 420145、感病材料‘白皮脆及雜交F2群體進行分子標記輔助離體葉片接種方法鑒定，更快、更精確地篩選到抗感單株，構建抗感基因池，提高育種效率。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗于2018年8—10月在南京農業大學白馬基地網室進行，8月1日播種，8月20日定植，9月5日取第3片展開的真葉進行離體葉片接種鑒定，9月10日統計病情。試驗所用材料：感病材料‘白皮脆、抗病材料‘PI 420145以及‘白皮脆與‘PI 420145雜交所得的F2代，感病材料和抗病材料分別由新疆農業科學院和葫蘆科作物遺傳與種質創新試驗室提供，均由葫蘆科作物遺傳與種質創新試驗室連續多代自交保存。試驗所用蔓枯病病原菌由江蘇省農科院提供，經葫蘆科作物遺傳與種質創新試驗室分離純化并保存的DBJSJY2菌株。

1.2 蔓枯病菌培養

參照Li[11]的方法，誘導蔓枯病菌產生分生孢子：選取純性蔓枯病原菌DBJSJY2，接種試驗前，將蔓枯病菌DBJSJY2接種到PDA培養基上（土豆200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 L），26～28 ℃條件下暗培養1周。

1.3 離體葉片菌絲塊接種

接種方法參照Wang等[12]方法稍作改動：取甜瓜植株展開的第3或第4片真葉（保留葉柄），用無菌水沖洗干凈，晾干后放置到鋪有2層濾紙的培養皿中。統一采用直徑為0.5 cm的滅菌打孔器切取菌絲塊，接種到甜瓜葉片的中央，每個葉片接種1個菌絲塊，將培養皿放在光照培養箱中培養，培養溫度（26±1） ℃，16 h光照/8 h黑暗，相對濕度90%～95%。培養5 d后，測量病原菌的擴展半徑，分析甜瓜對病原菌侵染的敏感性。

葉片侵染病情分級標準如下，1級：擴展半徑<1.8 cm，2級：1.8 cm≤擴展半徑<2.3 cm，3級：2.3 cm≤擴展半徑<2.8 cm，4級：2.8 cm≤擴展半徑<3.3 cm，5級：擴展半徑≥3.3 cm。其中，1級為高抗（HR），2級為抗（R），3級為中抗（MR），4級為感（S），5級為高感（HS）。

1.4 分子標記輔助篩選

待植株長至3葉1心時，取甜瓜幼嫩葉片0.8～1.0 g于2.0 mL的離心管中，浸入液氮研磨成粉末，采用改良CTAB法[13]提取DNA。選用Wolukau[5]等篩選的分子標記進行蔓枯病抗性篩選鑒定（表1）。

用于檢測抗病基因Gsb-6由葫蘆科作物遺傳與種質創新試驗室設計，由南京擎科生物科技有限公司合成（表1）。PCR程序總反應體系為20 ?L（包括10×buffer 10.0 ?L，10 ?mol·L-1前后引物各1.0 ?L，30 ng·?L-1模板DNA 1.0 ?L，ddH2O 7.0 ?L）。擴增反應在TaKaRa PCR儀中進行。反應條件為：94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 80 s，40個循環;72 ℃延伸 5 min。PCR產物在聚丙烯酰胺凝膠上電泳，采用銀染方法檢測。

1.5 數據分析

采用Microsoft Office Excel 2003和SPSS 20.0軟件對試驗數據進行統計、相關性分析和卡方值檢驗。

2 結果與分析

2.1 蔓枯病分子標記輔助鑒定

對親本及F2群體的96株植株進行篩選（表2），20株親本‘白皮脆‘PI 420145各擴增出20條‘白皮脆帶型和20條‘PI 420145帶型。F2群體中，20株擴增出‘PI 420145帶型，54株擴增出雜合帶型，22株擴增出‘白皮脆帶型。由此可知，共篩選到20株純合抗性植株，分離比為1∶2.7∶1.1，經卡平方檢驗，χ 2=1.234 4<χ0.05，1=3.84，分離比近似接近1∶2∶1，與Wolukau等[4]的研究結果一致。

2.2 蔓枯病抗性離體葉片接種鑒定分析

對兩親本進行離體葉片接種發現（圖1），抗感品種的病斑大小和擴展速度不同。接種第5天后，20株‘白皮脆全表現為感病，擴展半徑在3.07 cm到4.05 cm不等，其中12株感病植株的病情級別為4級，8株高感植株的病情級別為5級;20株‘PI 420145鑒定結果全表現為抗病，擴展半徑在1.45 cm到2.1 cm不等，10株高抗植株的病情級別為1級，10株抗病植株的病情級別為2級。

進一步對分子標記篩選到的20株抗性植株和22株感病植株進行離體葉片接種鑒定，結果見表3、表4。經測量發現，抗感植株菌絲侵染擴展范圍差異明顯，抗性級別從1級到5級不等，擴展半徑從1.5 cm到3.9 cm不等。其中，20株抗病植株中，篩出高抗、抗、中抗植株分別有8株、9株、3株;22株感病植株中，篩選出感病、高感植株分別有7株、15株。

2.3 分子標記輔助篩選與離體葉片接種方法相關性分析

表2、表3、表4結果顯示，利用分子標記篩選到20株純合抗性植株和22株感病植株;篩選到極端高抗、高感植株分別為17和15株，抗感分子標記輔助篩選與離體葉片接種鑒定結果的相關系數分別為到0.85和0.68。由此可見，分子標記篩選與離體葉片接種鑒定是高度相關的。

3 討論與結論

人工接種鑒定是篩選抗蔓枯病資源的重要組成部分，為構建抗感基因池，篩選抗感單株，是甜瓜抗病性育種的前提。離體接種鑒定具有在空間有限的條件下，短時間內大量快速準確鑒定抗感材料，而且不易受環境條件的影響[14]，并已在菜瓜、甜瓜、黃瓜、西瓜等園藝作物上被廣泛運用于蔓枯病、葉斑病、黑星病、炭疽病等的抗性鑒定[15-16]。姚協豐、張永兵等[16-17]研究表明，感病材料離體葉片接種蔓枯病菌后，有不同程度的擴展;而在抗病材料中，沒有被侵染的現象。在本試驗中，感病材料離體接種后結果與此相一致;而在抗病材料中，與張永兵等[16]的研究結果不一致，離體接種后也有不同程度的侵染;這可能與研究所用的抗性材料抗性、培養條件、病原菌不同有關。張艷苓等[18]研究發現，苗期人工接種鑒定與成株期田間鑒定存在顯著差異，下一步對離體葉片接種鑒定的擴展速率及不同時期發病率進行研究。

利用分子標記輔助篩選抗病基因的可靠性主要取決于分子標記與基因的連鎖距離，即連鎖距離越近，輔助選擇的準確性越高[19-20]。本研究中所用的分子標記與抗病基因Gsb-6的遺傳連鎖距離為2.0 cM，但存在篩選率低的問題，因此需進一步的進行抗蔓枯病的進行定位。本試驗中，利用抗蔓枯病基因Gsb-6在F2群體的96株植株中共篩選到20株純合抗性植株，54株雜合抗病植株，22株感病植株，利用離體葉片接種鑒定，高抗性植株和高感植株的篩選率分別達到85%和68%，與宋茂興等[21]的研究結果一致。

本研究結果表明，利用分子標記輔助甜瓜蔓枯病離體葉片接種鑒定具有發病快，縮短檢測周期，接種5 d后就可得到鑒定結果;同時節省空間，降低試驗成本;同時植株離體接種后還可進行后續的研究使用，操作簡便等優勢。因此，利用分子標記輔助離體葉片接種快速準確地篩選抗感抗感單株，構建抗感基因池，加速抗蔓枯病基因精細定位的進程，為甜瓜極端抗感基因池的篩選鑒定提供一條新的研究思路。

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