Ce6交聯介孔硅納米粒的制備及其單線態氧產率的測定研究

陳敏 ，康安鋒 ，王騏榕 ，王丹 ，楊峰 ,

1.福建中醫藥大學，福建福州 350122；2.海軍軍醫大學藥學院，上海 200433；3.上海長征醫院，上海 200433

光動力療法(PDT)中，單線態氧的生成能力是評價光動力活性的重要因素之一。二氫卟吩(Ce6)是具有較高1O2量子產率的光敏劑，介孔二氧化硅納米粒是具有較大的孔表面積和良好的生物相容性的納米載藥體系[1]；該課題制備了一種雙孔道有序介孔二氧化硅納米粒，通過化學交聯法在孔道表面負載Ce6，利用紫外吸收光譜法來判斷載藥情況。通過近紅外發光法測定1O2的生成和產率，同時研究該系統對黑色素瘤細胞內的殺傷作用和誘導細胞內活性氧產生的能力，以期得到新型納米載藥體系。

1 資料與方法

1.1 試劑與儀器

十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)和三甲基十六烷基溴化銨(TEOs)及正己烷均購自國藥集團化學試劑有限公司，二氫卟吩(Ce6,百靈威科技有限公司)，3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTS)購自美國阿拉丁工業公司，小鼠黑色素瘤細胞（B16，海軍軍醫大學藥學院提供），活性氧、CCK8試劑盒，透射電鏡，電位測定儀，紫外分光光度計，近紅光電倍增管，多功能酶標儀等。

1.2 實驗方法

1.2.1 介孔硅(MSN)的制備 參考文獻[2]采用改進Stober方法合成雙孔道介孔硅納米粒，稱取0.48 gCTAB溶于240 mL去離子水，滴加2 mLTEOs和10 mL正己烷混合溶液,繼續反應12 h,離心洗滌。分散于100 mL無水乙醇和2 mL 5M的HCl混合液，離心洗滌得MSN。在N2保護下滴加50 μL APTES，得介孔改性材料 MSN-NH2。

1.2.2 載Ce6介孔硅 (MSN/Ce6)的制備 稱取100 mgMSN加入150 mg N,N-二環己基碳二亞胺（DCC）和25 mgCe6得MSN/Ce6[3]。

1.2.3 介孔硅納米粒的表征 采用電位測定儀測定介孔硅的粒徑，通過透射電鏡 （TEM）觀察納米粒的形貌特征，QuadraSord SI吸附儀測得N2吸附-脫附等溫線；計算比表面積分布、孔徑和孔容[4]。

1.2.4 紫外吸收光譜測定 樣品溶于DMF溶劑，每個樣品4種濃度梯度，見表1，記錄不同樣品的掃描曲線。

表1 紫外吸收光譜測定中不同樣品的濃度

1.2.5 單線態氧產率的近紅外發光測定 檢測1O2的近紅外發光信號，定量評估1O2產率[5]。將樣品（表2）分別放入比色皿，依次采集5個濾光片的光譜信號，進而鑒別出單線態氧發光信號。比較待測樣品與參考標樣的1O2（max=1 270 nm）發光強度，計算待測樣品的1O2量子產率。

表2 單線態氧產率測定中不同樣品的濃度

1.2.6 CCK8法測細胞毒性 取對數生長期B16細胞孵育后加入不同濃度梯度（0.375、0.75、1.5、3、6、12 μg/mL）游離的Ce6、含等量Ce6的MSN/Ce6和空白載體材料MSN，并設空白對照組，每組設3個復孔避光培養。660 nm波長激光照射，光劑量為10 J/cm2，避光培養后每孔加入100 μL含10%CCK8的培養液，2 h后酶標儀測定450 nm處OD值。

1.2.7 細胞內單線態氧產生的檢測 取對數生長期B16細胞孵育后加入倍比稀釋的游離 Ce6 （0.375～12 μg/mL）、含等量Ce6的MSN/Ce6和載體材料MSN，并設空白對照，每組設3個復孔避光培養。每孔加入100 μL含DCFH-DA活性氧檢測試劑的無血清培養基，激光照射后測定各孔的吸光度值[6]。

2 結果

2.1 雙孔道介孔硅納米粒表征

納米粒的表征結果TEM圖（圖1）。電位測定儀測定其水合粒徑為159.2 nm，zeta電位值為-15.1 mV，材料比表面積為1 356 m2/g，總孔容積為2.40 cm3/g，孔徑約為5.62 nm。

圖1 MSN納米粒的結構表征

2.2 吸收光譜檢測

通過不同樣品的紫外吸收光譜 （圖2），發現Ce6、MSN/Ce6在671 nm處有特征吸收峰,表明Ce6成功修飾到MSN-NH2外表面和孔道內表面。

2.3 單線態氧近紅外發光檢測

近紅外光譜分辨圖（圖3A）顯示Ce6和MSN/Ce6在1 270 nm處有發光強度，其中Ce6的發光強度最強。不同樣品在1 270 nm處的近紅外時間分辨圖（圖3B）也驗證了這點。單線態氧的產率呈現濃度依賴性(圖3C)。

圖2 載藥和不載藥MSN納米粒的紫外吸收圖譜

圖3 載藥和不載藥MSN納米粒的近紅外光譜分辨圖

2.4 細胞毒性檢測

圖示（圖4A）表明MSN不具有細胞毒性。經光照射處理后（圖4B），游離Ce6組和MSN/Ce6均顯示較強的光毒作用，呈濃度依賴性。當Ce6濃度達到3μg/mL時，兩組均可有效殺傷B16細胞，表明MSN/Ce具有體外光動力抗腫瘤活性。

圖4 MSN/Ce6對黑色素瘤B16細胞的暗毒性(A)和光毒性(B)

3 討論

該課題成功制備了雙孔道介孔硅納米粒，其獨特的介孔特性可以高效負載藥物。由于Ce6共價交聯負載在MSN孔道表面影響直接釋放，無法計算其載藥量的情況，于是利用紫外吸收光譜法來判定MSN是否成功負載Ce6。MSN與Ce6共價交聯后是否仍具有光學活性，具備產生1O2的能力，是值得探討的問題。利用近紅外發光法來測定樣品是否產生1O2以及1O2的產率，并選用B16細胞考察MSN/Ce6的細胞毒性和活性氧的產生。在載藥納米體系中檢測出1O2的產生，初步說明了MSN/Ce6具有較好的光動力療效，MSN/Ce6作用B16細胞后表現出顯著的細胞毒性和較高ROS的產生，表明載藥介孔硅納米粒具有一定的體外光動力作用。今后，可進一步研究MSN/Ce6的抗腫瘤活性機制等方面。