威寧豆醬中主酵菌株的分離與鑒定

張問平，黃曉潤，郭 婭，曾金興，黎忠杰，佟碩秋，吳擁軍*

（貴州大學 生命科學學院，貴州 貴陽 550025）

豆醬是中國傳統的調味品，是經自然發酵而成的半流動狀態的發酵食品，也稱黃豆醬、黃醬或大豆醬[1]。中國是世界上最早發明醬制作方法的國家，制醬技術的起源可以追溯到公元前一千余年，《周禮》和《論語》中都有記載[2]。傳統發酵豆醬除了作為調味品之外，其含有異黃酮類、多酚類、大豆皂苷、類黑精、肽類、維生素等大量對人體有益的生理活性物質，具有較好的保健功能[3-6]。

傳統發酵豆醬采用開放式生產，空氣中各種微生物混入后共同生長，通過發酵、后熟等階段，形成了發酵豆醬特有的風味[7]。這些微生物主要包括霉菌、細菌和酵母菌，其中，霉菌起主要作用[8]。威寧豆醬也是經過特殊的工藝自然發酵而成，具有特殊的色、香、味、形，是當地人們生活中不可或缺的調味品。其傳統工藝為：炒豆、磨豆、捏團、制曲發酵，加入輔料、后發酵。威寧豆醬傳統的生產多為家庭作坊式生產，生產工藝落后，發酵周期長，原料及設備利用率低，產品質量不穩定，不能滿足市場需求。為了提高豆醬發酵風味品質，可以選擇人工接種純種發酵的方式進行發酵，這也是目前發酵食品研究中的熱點和主要趨勢。

目前，高秀芝等[9-13]采用多種方法對豆醬中微生物進行研究，并對豆醬發酵工藝進行研究，但是對威寧豆醬發酵的研究鮮見報道，關于威寧豆醬純種發酵的研究尚未見報道。因此，本研究從威寧豆醬中分離并鑒定主要的發酵菌株，分別將菌種應用在威寧豆醬純種發酵工藝上，以期為威寧豆醬的純種發酵提供優良菌種，為威寧豆醬的發酵及工藝化生產提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

威寧豆醬醬曲樣品：威寧地區；威寧豆醬成品：威寧地區農戶自釀。

1.1.2 培養基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 L，pH自然，121℃滅菌20 min。

LB培養基：胰蛋白胨10 g，酵母浸粉 5 g，NaCl 10 g，蒸餾水1 L，pH 7.0，121℃滅菌20 min。

馬丁氏培養基：葡萄糖10 g，蛋白胨5 g，KH2PO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，1/3 000孟加拉紅溶液100 mL，瓊脂15 g，蒸餾水800 mL，pH自然，121℃滅菌20 min，臨用前加入0.03%鏈霉素稀釋液100 mL。

1.1.3 試劑

Mix、載體pMD 18-T、Hind III限制性核酸內切酶（15 U/μL）、EcoR I限制性核酸內切酶（15 U/μL）：寶日醫生物技術（北京）有限公司。

1.2 儀器與設備

GZX-GF101-3-BS-II電熱鼓風恒溫干燥箱、DNP-9082電熱恒溫培養箱：上海精宏實驗設備有限公司；GR 60 DA高壓滅菌鍋：致微（廈門）儀器有限公司；BX 53顯微鏡：日本Olympus公司；MB90水分測定儀：奧豪斯儀器（常州）有限公司；VITEK2 Compact全自動微生物鑒定系統：梅里埃診斷產品（上海）有限公司；T100聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀、Universial Hood Ⅱ凝膠成像系統：美國Bio-Rad公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌株的分離純化

稱取5 g樣品于45 mL無菌生理鹽水中，室溫、180 r/min條件下振蕩培養30 min，懸液用無菌生理鹽水以10倍梯度稀釋至10-8，取稀釋度為10-5、10-6、10-7的稀釋液100 μL分別涂布于PDA培養基、馬丁氏培養基和LB培養基，將涂布好的PDA、馬丁氏培養基置于28℃培養箱中倒置培養36 h，LB培養基置于37℃培養箱中倒置培養18 h，觀察生長情況。挑取菌落形態不同的菌株純化3次，將純化后的菌種4℃保存備用。

1.3.2 威寧豆醬發酵工藝流程及操作要點

選豆→烘焙→磨豆→接種→主（前）發酵→加入輔料→后發酵→豆醬

操作要點：將黃豆在140℃條件下烘焙1.5 h，磨成細粉狀，通過60目篩，稱取50 g黃豆粉于500 mL錐形瓶中，121℃滅菌20 min，將前期分離純化的菌株分別制成菌懸液（1×107CFU/mL），以1%（V/V）的接種量接種于黃豆粉中，再以黃豆粉∶水=5∶4（g∶mL）的料水比加入無菌水，攪拌均勻。接種真菌的物料置于28℃發酵15 d，接種細菌的物料置于37℃發酵15 d。前發酵好的物料中加入輔料（辣椒粉、五香粉、食鹽），再以物料∶水=5∶3（g∶mL）加入無菌水，攪拌均勻，接種真菌的物料置于28℃、接種細菌的物料置于37℃各發酵3個月。

1.3.3 感官評價和主酵菌株篩選

采用10人品嘗小組綜合計分，參照國標GB/T 24399—2009《黃豆醬》對豆醬的色澤、氣味、滋味、體態進行感官評分，總分以100分記，具體評分標準見表1。以得分值較高者作為主酵菌株。采用主酵菌株發酵制備威寧豆醬，并與威寧豆醬成品風味對比。

表1 威寧豆醬的感官評分標準Table 1 Sensory evaluation standards of Weining soybean paste

1.3.4 菌株鑒定

形態學鑒定：將篩選出的主酵菌株分別劃線接種于LB或PDA培養基上，細菌37℃培養12 h，真菌28℃培養36 h，觀察菌株菌落形態。細菌進行革蘭氏染色、真菌進行美蘭染色，觀察細胞形態。然后參照《真菌鑒定手冊》[14]和《伯杰氏細菌手冊》[15]進行初步鑒定。

分子生物學鑒定[16-17]：提取主酵菌株的基因組，然后采用通用引物（見表2）進行聚合酶鏈式反應（PCR）擴增，PCR擴增體系：DNA模板2μL，上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，2×Mix 10μL，雙蒸水（ddH2O）7μL，共20μL。PCR擴增程序：95℃預變性8 min；95℃變性30 s，55℃退火1 min，72℃延伸40 s，30個循環；72℃再延伸8 min。反應結束后PCR擴增產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離后在凝膠成像系統上觀察分析。

PCR擴增產物分別與pMD 18-T載體連接，導入DH5a感受態細胞，提取重組質粒，酶切驗證后送至上海生工生物工程技術服務有限公司進行測序。測序結果在美國國立生物技術信息中心（nationalcenter for biotechnology information，NCBI）的Genbank數據庫中進行Blast比對，選取同源性高的模式菌株，采用MEGA 5軟件中的鄰接（neighbor joining，NJ）法構建系統發育樹。

表2 通用引物序列Table 2 Sequences of universal primer

VITEK 2全自動微生物鑒定系統鑒定：將篩選出的主酵菌株純化后，制成菌懸液備用。選擇相應鑒定卡，按照操作說明用VITEK 2 Compact全自動微生物分析系統進行分析。

1.3.5 主酵菌株生長曲線的繪制

將篩選出的主酵菌株按1%接種量接入LB或PDA液體培養基中進行培養，每隔2 h取樣，測定培養液的OD600nm值。以培養時間（x）為橫坐標，OD600nm值（y）為縱坐標，繪制主酵菌株的生長曲線。

1.3.6 主酵菌株發酵豆醬理化指標的測定

氨基酸態氮含量：參照國標GB/T 24399—2009《黃豆醬》進行測定；總酸含量：參照國標GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》中的酸堿滴定法進行測定；水分含量：參照國標GB 5009.3—2016《食品安全國家標準食品中水分的測定》中直接干燥法進行測定。

2 結果與分析

2.1 菌株的分離純化

從威寧地區采集的豆醬樣品中共分離純化出10株真菌（DZ-1～DZ-10）和22株細菌（DX-1～DX-22），將分離的菌株純化后，4℃保存備用。

2.2 主酵菌株的篩選

分別采用分離到的10株真菌和22株細菌進行純種發酵制備豆醬，參照評分標準對其進行感官評價，結果見表3和表4。由表3可知，22株細菌中，細菌DX-9發酵的豆醬綜合評分最高，為94分。由表4可知，10株真菌中，真菌DZ-3發酵的豆醬綜合評分最高，為90分。且2株菌發酵豆醬風味與威寧豆醬成品風味相似，對威寧豆醬發酵過程中滋味和氣味的貢獻較大。因此，確定菌株DX-9和菌株DZ-3為主要發酵菌株。

表3 細菌發酵豆醬的感官評價Table 3 Sensory evaluation of soybean paste fermented by bacterium

表4 真菌發酵豆醬的感官評價Table 4 Sensory evaluation of soybean paste fermented by fungus

2.3 菌株的鑒定

2.3.1 形態學觀察

對主酵菌株DZ-3和DX-9進行形態觀察，結果分別見圖1、圖2。由圖1可知，菌株DZ-3的菌落呈乳白色、菌落表面光滑、有光澤、邊緣整齊，細胞呈橢圓形。由圖2可知，菌株DX-9的菌落呈白色、無光澤、表面褶皺、邊緣不整齊，細胞呈桿狀，為革蘭氏陽性菌。因此，參照《真菌鑒定手冊》[14]和《伯杰氏細菌手冊》[15]初步判定菌株DZ-3屬于酵母屬，菌株DX-9屬于芽孢桿菌屬。

圖1 菌株DZ-3的菌落形態（a）和細胞形態（b）Fig.1 Colony morphology(a)and cell morphology(b)of strain DZ-3

圖2 菌株DX-9的菌落形態（a）和細胞形態（b）Fig.2 Colony morphology(a)and cell morphology(b)of strain DX-9

2.3.2 分子生物學鑒定

菌株DZ-3和DX-9的PCR擴增產物見圖3。由圖3可知，菌株DX-3的ITS PCR擴增產物堿基長度為610 bp左右，菌株DX-9的16SrDNAPCR擴增產物堿基長度為1 410 bp左右，均與預期片段大小一致。PCR擴增產物與載體pMD18-T連接后，送去測序。

圖3 菌株DZ-3和DX-9 PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.3 Agarose gel electrophoresis of PCR amplified products of strain DZ-3 and DX-9

測序結果在NCBI的Genbank數據庫中進行比對，選取同源性較高的序列構建系統發育樹，結果見圖4和圖5。由圖4可知，菌株DZ-3與異常威克漢姆（Wickerhamomycesanoma lus anomalus）CBS：1978聚于一支，親緣關系最近，因此，初步判定菌株DZ-3為異常威克漢姆（Wickerhamomyces anomalus）。由圖5可知，菌株DX-9與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）聚于一支，親緣關系最近，因此，初步判定菌株DX-9為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。

圖4 基于ITS序列分析菌株DZ-3的系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree of strain DZ-3 based on ITS sequences analysis

圖5 基于16S rDNA序列分析菌株DX-9的系統發育樹Fig.5 Phylogenetic tree of strain DX-9 based on 16S rDNA sequences analysis

2.3.3 VITEK 2全自動微生物鑒定系統鑒定

通過VITEK 2全自動微生物鑒定系統對菌株DZ-3和DX-9進行鑒定，結果表明，鑒定菌株DZ-3為異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus），菌株DX-9為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），結果與分子生物學鑒定結果一致。

酵母菌在豆醬發酵過程中發酵糖類產生小分子醛、酸、酯等物質，增加醬的風味[18-21]。枯草芽孢桿菌也是豆醬發酵過程中的主要優勢菌株[22-23]，與豆醬滋味的形成密切相關。

2.4 主酵菌株的生長曲線

菌株DZ-3及菌株DX-9的生長曲線見圖6。由圖6可知，菌株DZ-3的遲滯期為0～4 h，對數生長期為6～28 h，28 h后進入穩定期，32 h后開始進入衰亡期。菌株DX-9的遲滯期為0～4 h，對數生長期為4～18 h，18 h后進入穩定期，26 h后進入衰亡期。生長曲線的測定為兩種菌的培養時間和豆醬發酵過程中的接種量提供參考依據。

圖6 菌株DZ-3（A）及菌株DX-9（B）的生長曲線Fig.6 Growth curve of strain DZ-3(A)and DX-9(B)

2.5 純種發酵豆醬理化指標的測定

氨基酸態氮是調味品中主要的增味物質，也是發酵產品發酵程度的特性指標，氨基酸態氮含量越高，氨基酸含量越高，營養成分也越高[24-25]。豆醬中的總酸高低也會直接影響豆醬風味、色澤、穩定性和品質的高低。

采用篩選獲得的主酵菌株DZ-3和DX-9分別純種發酵制備威寧豆醬，對豆醬的理化指標進行測定，并與威寧豆醬成品理化指標結果進行比較，結果見表5。

表5 菌株DZ-3和菌株DX-9發酵豆醬理化指標測定結果Table 5 Determination results of physicochemical index of soybean paste fermented by strain DZ-3 and DX-9

由表5可知，菌株DZ-3發酵的豆醬的總酸、氨基酸態氮、水分含量分別為1.53 g/100 g、0.64 g/100 g、55%。菌株DX-9發酵的豆醬的總酸、氨基酸態氮、水分含量分別為1.96 g/100 g、0.96 g/100 g、59%。威寧豆醬的總酸、氨基酸態氮、水分含量分別為1.85 g/100 g、1.02 g/100 g、52%。結果表明，兩種菌發酵豆醬的總酸、氨基酸態氮、水分含量均達到國家標準GB/T 24399—2009《黃豆醬》的要求。菌株DX-9發酵豆醬的總酸、氨基酸態氮含量和水分含量比菌株DZ-3發酵的豆醬分別高0.46 g/100 g、0.32 g/100 g和4%，且菌株DZ-3和DX-9純種發酵的豆醬氨基酸態氮含量均比威寧豆醬成品低，但菌株DX-9純種發酵的豆醬僅比威寧豆醬成品低0.06 g/100 g。綜合來看，菌株DX-9在威寧豆醬的發酵過程中發酵能力比菌株DZ-3強。

3 結論

本研究從威寧地區采集的醬曲樣品中初步分離得到22株細菌和10株真菌。采用分離菌株進行純種發酵制備豆醬，并進行感官評價。結果表明，細菌中，菌株DX-9發酵豆醬的感官評分最高，為94分；真菌中，菌株DZ-3發酵豆醬的感官評分最高，為90分，且均與傳統威寧豆醬風味相似。因此，確定這兩株菌為主酵菌株。通過形態觀察、分子生物學技術及VITEK 2全自動微生物鑒定系統對主酵菌株進行鑒定。結果表明，菌株DX-9為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），菌株DZ-3為異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）。對菌株DX-9及DZ-3純種發酵豆醬的理化指標進行測定，結果表明，菌株DX-9發酵豆醬的氨基酸態含量為0.96 g/100 g、總酸含量為1.96 g/100 g、水分含量為59%；菌株DZ-3發酵豆醬的氨基酸態含量為0.64 g/100 g、總酸含量為1.53 g/100 g、水分含量為55%，均達到國家相關標準要求，且菌株DX-9發酵豆醬優于菌株DZ-3。