海洋低溫肌氨酸氧化酶生產菌株的篩選、鑒定及酶學特性研究

遲乃玉，劉 洋，于 爽，希 倫，李美玉，張慶芳*

（1.大連大學 生命科學與技術學院，遼寧 大連 116622；2.遼寧省海洋微生物工程技術研究中心，遼寧 大連 116622）

肌氨酸氧化酶（sarcosine oxidase，SOX）屬于黃素蛋白氧化酶類，在自然界中分布廣泛。其是酶法測定肌酐中研究較多的一種酶，可催化肌氨酸中的N-甲基氧化，可偶聯肌酐酶和肌酸酶降解肌酐。作為一種重要的診斷酶制劑，是測定血清或尿液中肌酐含量的關鍵酶之一，應用于腎臟的健康程度的診斷[1]。

為了滿足工業用酶的需求，趙更鋒等[2-9]已從肌氨酸氧化酶的分布、酶學性質以及分子生物學方面進行了大量研究。SUZUKIM[10]最早發現棒狀桿菌屬（Corynebacterium sp.）可以產肌氨酸氧化酶，隨后相繼發現假單胞菌（Pseudomonas）、鏈霉菌（Streptomyces）、芽孢桿菌（Bacillus）和節桿菌（Arthrobacter）等微生物均可產肌氨酸氧化酶[11-16]。但目前依然存在著許多不足之處，如熱穩定性普遍較差，使其在一些領域的應用中受到限制。MORIN等[17]從土壤中篩選出一株產單聚體肌氨酸氧化酶的銨鐠柱胞霉菌（Cylindrocarpon didymium）M-1，測得該單聚體肌氨酸氧化酶分子質量為48 kDa，最適pH值為7.5，最適溫度為40℃，將該酶在45℃處理10 min，殘余酶活力為75%。

本研究從渤海海泥中分離、篩選一株高產低溫肌氨酸氧化酶菌株，采用形態觀察、生理生化試驗及分子生物學技術對其進行鑒定，并對其所產的肌氨酸氧化酶酶學性質進行初步研究，為腎臟疾病診斷試劑盒的研發提供優質的菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

海泥樣品：遼寧省大連渤海灣（N：39°7′，S：121°41′）。

1.1.2 試劑

肌酸：大連凱美化工工程配套有限公司；脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）純化試劑盒：大連寶生物有限公司；酵母膏、硫酸鎂、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、碘化鉀、淀粉、牛肉膏、胰蛋白胨、氯化鈉：生工生物工程（上海）股份有限公司；所有試劑均為國產分析純或生化試劑。

1.1.3 培養基[18]

富集培養基：肌酸5.0 g/L，酵母膏0.5 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，磷酸氫二鉀0.5 g/L，磷酸二氫鉀2 g/L，海水1 L，pH 7.0。

分離培養基：肌酸5.0 g/L，酵母膏5 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，磷酸氫二鉀0.5 g/L，磷酸二氫鉀2 g/L，碘化鉀1.7 g/L，淀粉10 g/L，海水1 L，pH 7.0。

種子培養基：胰蛋白胨10 g/L，牛肉膏5 g/L，NaCl 10 g/L，海水1 L，pH 7.0。

發酵培養基：肌酸5.0 g/L，酵母膏5 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，磷酸氫二鉀0.5 g/L，磷酸二氫鉀2 g/L，海水1 L，pH 7.0。

LB培養基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化鈉10 g/L。

以上固體培養基中加入20 g/L瓊脂，培養基均在0.1 MPa、121℃條件下高壓蒸汽滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

HZP-256全溫振蕩培養箱：上海智誠分析儀器制造有限公司；CX21FS3顯微鏡：日本OLYMPUS公司；NB-1630超凈工作臺、UV-H232可見紫外分光光度計：菲迪康樂（廣州）科學儀器有限公司；LDFX-50BI立式壓力蒸汽滅菌鍋：蘭州方盛生物科技有限公司；APL-204電子天平、pH-3G pH計：陜西鼎盛儀器設備有限公司；MBS聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀：上海普迪生物技術有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 產肌氨酸氧化酶菌株的篩選

菌株初篩：取大連渤海海灣海泥10 g于100 mL富集培養基中，在20℃、150 r/min條件下振蕩培養，每天測肌酸含量。待肌酸完全降解后，富集培養液經10倍梯度稀釋至10-6，將稀釋液涂布于固體分離培養基，25℃條件下倒置培養24 h，挑取變為藍綠色的菌落進行分離、純化。將分離得到的菌株接種到新鮮的分離培養基中，20℃、150 r/min條件下培養72 h，測定肌酸的降解情況。

菌株復篩：將可降解肌酸的菌株接種于發酵培養基中，20℃、150 r/min條件下培養48 h，測定其肌氨酸氧化酶活力。

1.3.2 肌酸降解率的測定[19]

在0.5 mL的樣品中，加入1 mL含有1%α-萘酚的1.5 mol/L NaOH、0.5 mL 0.05%的雙乙酰，顯色30 min，再加入3 mL蒸餾水，于波長530 nm處測定吸光度值。計算肌酸降解率，計算公式如下：

1.3.3 肌氨酸氧化酶活力的測定[19]

將待測菌體進行超聲破壁后，于4℃、8 000 r/min條件下離心15 min，取上清酶液0.1 mL于0.9 mL含有0.1 mol/L肌氨酸的焦磷酸鈉緩沖液（pH 7.4）中，37℃反應10 min，再加入0.25 mL 0.1 mol/L的醋酸終止反應，并加入1.5 mL含有0.04%乙酰丙酮的20%乙酸銨溶液，于37℃反應40 min后，在波長410 nm處測定吸光度值。

肌氨酸氧化酶活力定義：在37℃、pH 7.0條件下每分鐘分解1μmol肌氨酸的酶量為一個酶活力單位（U）。

1.3.4 菌株的鑒定

形態觀察：將試驗菌株劃線于固體LB平板上，20℃恒溫培養24 h，觀察菌株的菌落形態特征，并挑取單菌落，進行革蘭氏染色，觀察菌株的細胞形態。

生理生化試驗[20]：對試驗菌株進行V-P反應、接觸酶反應、硝酸鹽還原試驗、產生吲哚試驗、淀粉水解試驗、明膠水解試驗、含碳化合物的利用等試驗。

分子生物學鑒定：將試驗菌株接種于富集培養基中，20 ℃、150 r/min條件下培養48 h，8 000 r/min離心15 min后棄上清，加入100μL無菌重蒸水（ddH2O）中，混勻，沸水處理10 min，12 000 r/min離心10 min，以上清液為模板對試驗菌株的16S rDNA基因序列進行PCR擴增[19]。正向引物為BSF8/20（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）；反向引物為BSR1541/20（5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'）。采用DNA純化試劑盒對PCR擴增產物進行純化，并送至北京諾禾致源生物技術有限責任公司進行測序。將測序結果提交至美國國家生物技術信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank數據庫中，與已知菌種的16S rDNA序列進行BLAST同源性比對，選擇若干條同源性較高的模式菌株的16S rDNA序列，采用MEGA 5.0軟件中的鄰接（neighbor joining，NJ）法構建系統發育樹，確定其分類地位。

1.3.5 肌氨酸氧化酶酶學性質的初步研究

最適作用溫度：按照肌氨酸氧化酶活力的測定方法，分別在不同作用溫度條件下（5～70℃，梯度為5℃），測定肌氨酸氧化酶活力，確定酶的最適反應溫度；將同組實驗中最高酶活力設為100%，計算相對酶活。

熱穩定性：將粗酶液分別在不同溫度條件下（25℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃）處理60 min，測定酶活力。

最適作用pH：分別在不同pH值條件下（4.0～11.0，梯度為0.5）測定肌氨酸氧化酶酶活力，確定酶的最適反應pH。其中pH 4.0～6.0為0.1 mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液；pH 6.0～8.5為0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液；pH 8.5～9.5為0.05 mol/L硼砂-硼酸緩沖液；pH 9.5～11.0為0.05 mol/L硼砂-NaOH緩沖液。

pH穩定性：將粗酶液分別于不同pH值（4.0～11.0，梯度為0.5）的緩沖液中，37℃保溫18 h，測定酶活力。

不同金屬離子對肌氨酸氧化酶活性的影響：將粗酶液分別加入含有1 mmol/L或10 mmol/L不同金屬離子（Co2+、Ca2+、K+、Fe2+、Zn2+、Mn2+、Mg2+、Ni2+、Cu2+）的溶液中，37 ℃保溫30 min，測定酶活力。將未加入金屬離子的酶液活力設為100%，計算各組的相對酶活。

2 結果與分析

2.1 產肌氨酸氧化酶菌株的初篩

通過初篩發現，27個菌落周圍變成藍綠色，其中10株菌株（LYH03、LYH09、LYH18、LYH36、LYH44、LYH45、LYH83、LYH106、LYH186、LYH221）可降解肌酸（對照菌株肌酸降解率為4.5%），結果見表1。由表1可知，菌株LYH18降解肌酸的能力最強，培養72 h后，肌酸降解率達75%。

表1 菌株的肌酸降解率Table 1 Creatine degradation rate of strains

2.2 產肌氨酸氧化酶菌株的復篩

將初篩獲得的10株菌進行搖瓶發酵，測定其肌氨酸氧化酶活力，結果如表2所示。

表2 菌株產肌氨酸氧化酶的酶活比較Table 2 Comparison of enzyme activities of sarcosine oxidase produced by strains

由表2可知，菌株LYH18的肌氨酸氧化酶活力最高，為1.65 U/mL，與肌酸降解情況一致。因此，選取菌株LYH18為目標菌株，對其進行菌種鑒定。

2.3 菌株的鑒定

2.3.1 形態觀察

菌株LYH18的菌落與細胞形態見圖1。由圖1a可知，菌株LYH18在LB固體培養基上，菌落呈圓形，隆起，表面光滑，濕潤，邊緣整齊，無色，易挑取；由圖1b可知，革蘭氏染色呈陽性，在LB固體培養基上生長3 d后形成芽孢，芽孢形狀為橢圓形，菌體呈桿狀。這些特征表明，菌株LYH18呈現出典型的細菌特征。

圖1 菌株LYH18的菌落（a）和細胞（b）形態Fig.1 Colony(a)and cell(b)morphology of strain LYH18

2.3.2 生理生化鑒定

參照《常見細菌系統鑒定手冊》（第8版）[21]對菌株LYH18進行生理生化試驗，生理生化特征結果見表3。

由表3可知，菌株LYH18在無氧條件下不能生長，接觸酶試驗呈陽性，V-P反應呈陰性，對氯化鈉有較強的耐受性，在10%NaCI條件下能夠生長；不能分解酪酛、明膠及淀粉；可將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽；能利用多種碳水化合物，如D-半乳糖、L（+）-鼠李糖、纖維二糖、葡萄糖、蔗糖、松三糖，但不能利用D-木糖、棉子糖和D-甘露糖；不能產吲哚。結合形態觀察，根據《常見細菌系統鑒定手冊》（第8版）初步鑒定菌株LYH18為芽孢桿菌屬（Bacillus）。

表3 菌株LYH18的生理生化特征Table 3 Physiological and biochemical characteristics of strain LYH18

2.3.3 分子生物學鑒定

為了進一步鑒定分離菌株LYH18，將其16S rDNA序列在GenBank數據庫中進行同源性比對。結果表明，菌株LYH18與Bacillus的多個菌種的序列相似性＞97%，采用MEGA5.0軟件中的NJ法構建系統發育樹，結果如圖2。由圖2可知，菌株LYH18與海泥芽孢桿菌（Bacillus oceanisediminis）H2同源性（99%）較高，親緣關系最近。結合形態觀察及生理生化試驗結果，將菌株LYH18鑒定為海泥芽胞桿菌（Bacillus oceanisediminis）。

圖2 基于16S rDNA序列菌株LYH18的系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain LYH18 based on 16S rDNA sequences

2.4 酶學性質研究

2.4.1 肌氨酸氧化酶的最適作用溫度

不同作用溫度條件下測定肌氨酸氧化酶活力，結果見圖3。由圖3可知，當作用溫度在10～15℃時，肌氨酸氧化酶的活性隨著作用溫度的升高而急劇增大；當作用溫度為25℃時，肌氨酸氧化酶活力最高；當作用溫度在15～45℃時，相對酶活力基本保持在80%以上，說明在室溫條件下，該酶即可保持較高酶活，這一特點可節省能源的消耗；當作用溫度高于45℃后，酶活性急劇下降；當作用溫度高于50℃后，相對酶活＜60%。結果表明，肌氨酸氧化酶的最適作用溫度為25℃，該酶對高溫條件比較敏感，更適合低溫條件。

圖3 肌氨酸氧化酶的最適反應溫度Fig.3 Optimal reaction temperature of sarcosine oxidase

2.4.2 肌氨酸氧化酶的熱穩定性

肌氨酸氧化酶的熱穩定性如圖4所示。由圖4可知，肌氨酸氧化酶在25～40℃條件下處理60 min后，相對酶活＞80%，保持高酶活性，說明該酶在室溫條件下，較穩定；當處理溫度高于40℃以后，相對酶活力逐漸下降，符合海洋低溫酶的特性[23]；該酶在50℃處理60 min后，相對酶活力急速下降，僅保留30%的相對酶活力；在60℃、70℃處理60 min，相對酶活力均＜10%，說明該酶熱穩定性較弱。

圖4 肌氨酸氧化酶的熱穩定性Fig.4 Thermal stability of sarcosine oxidase

2.4.3 肌氨酸氧化酶的最適作用pH值

不同作用pH值條件下測定肌氨酸氧化酶活力，結果如圖5所示。由圖5可知，該肌氨酸氧化酶作用的最適作用pH為8.0，且pH值在7.5～9.0之間時，相對酶活性較高，可保持在80%以上；當pH值≤7.0或≥9.0時，相對酶活性較低。

圖5 肌氨酸氧化酶的最適作用pH值Fig.5 Optimal reaction p H of sarcosine oxidase

2.4.4 肌氨酸氧化酶的pH穩定性

肌氨酸氧化酶的pH穩定性結果如圖6所示。由圖6可知，該酶在pH值≤6.0時，相對酶活＜40%；在pH值7.0～10.0之間時，酶活可保持在80%以上，較穩定；由此可以得出，在中性至弱堿性條件下，肌氨酸氧化酶活性較高，較穩定，說明該酶耐弱堿性。

圖6 肌氨酸氧化酶的pH穩定性Fig.6 pH stability of sarcosine oxidase

2.4.5 不同金屬離子對肌氨酸氧化酶活性的影響

不同金屬離子對肌氨酸氧化酶活力的影響見圖7。

圖7 不同金屬離子對肌氨酸氧化酶活性的影響Fig.7 Effect of different metal ions on sarcosine oxidase activity

由圖7可知，不同金屬離子對酶的作用不同；同種金屬離子在不同終濃度條件下對酶的作用也不同。其中Ca2+、Fe2+、Ni2+、Cu2+能使該酶失活，而K+對酶活性幾乎沒有影響；Co2+、Zn2+、Mg2+對酶活性有一定促進作用，其中Co2+對酶活性促進作用最強。

3 結論

本研究從渤海灣海泥樣品中分離到一株高產肌氨酸氧化酶的菌株LYH18，肌氨酸氧化酶活力為1.65 U/mL。通過形態觀察、生理生化分析和分子生物學技術鑒定菌株LYH18為海泥芽胞桿菌（Bacillus oceanisediminis）。經初步探索其產肌氨酸氧化酶的酶學性質，結果表明，該菌株所產的肌氨酸氧化酶的最適作用溫度和pH值分別為25℃和8.0，在溫度25～40℃和pH 7.0～10.0范圍內，酶活性較穩定，該酶屬于低溫酶類。菌株LYH18作為一株產肌氨酸氧化酶的新菌源，具有潛在的開發價值。