一株產酯酶窖泥細菌的篩選、鑒定及酶學性質研究

韓 麗，李 磊，曾 毅，楊源源，儲鎮江，何培新，2

（1.鄭州輕工業大學 食品與生物工程學院，河南 鄭州 450002；2.鄭州輕工業大學 食品生產與安全協同創新中心，河南 鄭州 450002）

酯酶（esterase）是指能夠催化水解羧酸酯的所有酶的總稱，是目前較常見的生物催化劑之一[1]，其廣泛存在于動植物和微生物中，尤其在微生物中種類最多[2-3]。微生物酯酶在細菌中分布最多，其廣泛存在于包括金黃葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、鏈球菌（Streptococcus）、芽孢桿菌（Bacillus）和結核桿菌（Mycobacterium tuberculosis）等多種細菌中。

酯酶作為重要的生物催化劑，其催化的反應具有較高的底物專一性、區域選擇性和對應選擇性[4]，廣泛應用于醫藥、食品、化工、環保等領域，尤其在白酒釀造業。隨著工業的發展，人們對酯酶的要求越來越高，因此，選育性質特殊、催化活性高的酯酶成為近年來研究的熱點[5-8]。目前，研究學者主要從土壤、海洋樣品中篩選產酯酶細菌，為了獲得催化性能優良、耐極寒或酷熱的酯酶，研究學者多在高山、極地、深海或者火山口進行取樣，篩選產酯酶細菌[9]。鄭鴻飛等[10]從青島前海和膠州灣地區分離出一株酶活力和穩定性較高的菌株EB-1，被鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）的亞種；王文文等[11]從自然發酵的黃皮果汁中分離出一株細菌C10，其產生的酯酶最適pH值為9.0、最適溫度為60℃；盛小禹等[12]從溫泉中分離得到一株的棲熱菌（Thermurs sp.）FD3041，其產酯酶FD2TAP的最適溫度為70℃，且在95℃處理60 min后仍然有75%的活性；ZAPPA S等[13]從火山中分離到一株異養古細菌Pyrococcusabyssi，其培養溫度為100℃，從中分離得到的胞內堿性磷酸酯酶最適溫度為70℃。

現有的報道中多從富含油脂的土壤中篩選能夠產酯酶的真菌或細菌[14-16]，而鮮有從窖泥中篩選產酯酶菌株的報道。本研究從白酒窖泥中篩選出一株高產酯酶的菌株，對其進行形態觀察和分子生物學鑒定，并對其產生的酯酶進行純化和酶學性質分析，以期對窖泥的改良與優化提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

窖泥：采集于河南周口宋河酒廠。

1.1.2 試劑

酵母粉、胰蛋白胨、葡萄糖、瓊脂粉（均為生化試劑）：北京索萊寶科技有限公司；氯化鈉、聚乙烯醇、三丁酸甘油酯、羅丹明B（均為分析純）、細菌基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒、DNA聚合酶、2000Maker：上海生工生物工程有限公司；硫酸銨、硝酸銨、磷酸氫二鉀、氯化鈉、七水硫酸鎂、七水硫酸亞鐵（均為分析純）：天津市永達化學試劑有限公司；丁酸酯、己酸酯、辛酸酯、癸酸酯、十二烷酸酯、十四烷酸酯、十六烷酸酯（均為分析純）：上海麥克林生化科技有限公司。

1.1.3 培養基

三丁酸甘油酯乳化液：稱取3 g聚乙烯醇于80 mL蒸餾水中，沸水浴加熱、攪拌，直至全部溶解，冷卻后用蒸餾水定容至100 mL。采用3.0%的聚乙烯醇溶液制備含100 g/L三丁酸甘油酯的乳液，超聲波處理（功率40%，破碎5 s停3 s，總時間15 min），得到的乳化液為乳白色黏稠狀液體。

LB液體培養基：胰蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、NaCl 10 g/L，pH 7.0。121℃高壓滅菌20 min。固體培養基中加入瓊脂粉20 g/L。

種子培養基：牛肉膏3 g/L、蛋白胨5 g/L、葡萄糖5 g/L、NaCl 5 g/L、pH 7.0。121℃高壓滅菌20 min。

發酵培養基：蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、氯化鈉10 g/L、pH 7.0。121℃高壓滅菌20 min。

富集培養基：三丁酸甘油酯乳化液12 mL、酵母粉0.2 g/L、磷酸氫二鈉3.5 g/L、磷酸氫二鉀1.5 g/L、微量金屬離子，pH 7.5。121℃高壓滅菌20 min。

三丁酸甘油酯固體培養基：硫酸銨0.5 g/L、硝酸銨0.1 g/L、磷酸氫二鉀1 g/L、氯化鈉1 g/L、七水硫酸鎂0.5 g/L、七水硫酸亞鐵0.1 g/L、酵母粉3 g/L、蛋白胨3 g/L，三丁酸甘油酯乳化液12 mL、瓊脂粉20 g，pH 7.0。121℃高壓滅菌25 min。

篩選培養基：于三丁酸甘油酯固體培養基中加入2 mL 0.5%羅丹明B溶液，蒸餾水定容至1 L，于121℃高壓滅菌25 min。

1.2 儀器與設備

DH-600A電熱恒溫培養箱：北京中興偉業儀器有限公司；SW-CJ-2D雙人超凈工作臺：蘇州凈化設備有限公司；DMEX30生物顯微鏡：寧波舜宇儀器有限公司；FORMA-86C超低溫冰箱：鄭州金友寧儀器有限公司；ZWY-100H搖床：上海智誠分析儀器制造有限公司；AE224分析天平：北京賽多利斯天平有限公司；TGL-16G離心機：上海安亭科學儀器廠；SC-15恒溫水浴鍋、SCIENTZ-10N真空冷凍干燥機：寧波新芝生物科技有限公司；DYCZ-24KF四板垂直電泳儀：北京六一生物科技有限公司；C1000聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀：美國伯樂公司。

1.3 方法

1.3.1 產酯酶菌株的初篩

稱取5 g窖泥樣品于100 mL無菌生理鹽水中，充分混勻后按1%（V/V）的接種量接種于富集培養基中，30℃、180 r/min培養2 d。將富集液進行梯度稀釋（10-1～10-6），每個梯度涂布于兩個三丁酸甘油酯平板，每塊平板涂布200μL，30℃倒置培養2 d至長出單菌落。挑取產生透明圈的單菌落點樣于篩選培養基平板上，30℃培養2 d，觀察透明圈，以菌落直徑和水解圈直徑的比值作為初篩依據，篩選比值較大的菌落于LB固體培養基上分離純化。將得到的產酯酶細菌接種于5 mL LB液體培養基中，30℃、180 r/min培養24 h后，保存于甘油中。

1.3.2 產酯酶細菌的復篩

將初篩得到的菌株接種于種子培養基中，30℃、180 r/min培養24 h。按1%的接種量將種子液接種于發酵培養基中，30℃、180 r/min培養48 h。取發酵液1 mL，8 000 r/min、4℃條件下離心10 min，即為粗酶液，通過測定酯酶酶活對菌株進行復篩。

酯酶酶活的測定[17]：采用棕櫚酸對硝基苯酯（p-nitrophenylpalmitate，pPNP）法測定酯酶活力。反應體系中加入粗酶液15μL、pPNP（10 mmol/L）35μL、Tris-HCl（0.1 mol/L，pH=8.0）200μL，40℃水浴10 min，在波長410 nm處測定吸光度值。酯酶活力單位定義：在pH=8.0、40℃條件下，每分鐘水解產生1μmol的pNP所需的酶量定義為一個酶活力單位（U）。

1.3.3 產酯酶細菌的鑒定

形態觀察：將目標菌株劃線于LB固體平板，30℃倒置培養24 h，觀察菌株的菌落形態；參考國標GB 4789.28—2013《食品微生物學檢驗培養基和試劑的質量要求》對目標菌株進行革蘭氏染色并鏡檢。

分子生物學鑒定：采用細菌基因組DNA提取試劑盒提取目的菌株的基因組DNA，以其作為模板，使用引物27F（5′-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）進行PCR擴增。PCR反應體系：DNA模板2 μL，10×PCR buffer（MgCl2）4 μL，2.5 mmol/L脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）mix 3.2μL，上、下游引物（10μmol/L）各0.8μL，pfu DNA聚合酶（2.5 U/mL）0.8μL，雙蒸水（ddH2O）補足至40μL。PCR擴增條件：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環；72 ℃再延伸10 min。PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收PCR擴增產物并送至蘇州金唯智生物科技有限公司進行測序。測序結果提交至美國國立生物技術信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank數據庫中進行Blast同源性比對。選取同源性較高的模式菌株的16S rDNA序列，采用Mega 5.0軟件中的鄰接（neighbor joining，NJ）法構建系統發育。

1.3.4 酯酶的純化

將目標細菌劃線于LB固體培養基，30℃培養24 h。挑取單菌落接種于50 mL種子培養基中，30℃、180 r/min條件下培養48 h。按照1%的接種量將種子液接種于1 L發酵培養基中，30℃、180 r/min培養48 h，8 000 r/min、4℃條件下離心20 min，取上清液備用。

由分級沉淀得到純化酯酶的最佳硫酸銨飽和度為60%。向上清液中緩慢加入硫酸銨沉淀，使其飽和濃度達到60%，4℃過夜，5 000 r/min、4℃離心10 min，即可得到蛋白沉淀。將得到的蛋白沉淀溶于Tris-HCl（0.1 mol/L，pH=8.0）中，移入透析袋（截留分子質量：8 000～14 000 Da）中，透析液為Tris-HCl（0.1 mol/L，pH=8.0）。每隔4 h換一次透析液，直至硫酸銨沉淀完全去除。取一定量的透析液，加入高濃度的硫酸鋇溶液，如無白色沉淀生成表明硫酸銨已透析完全。透析液5 000 r/min、4℃離心10 min，去除未溶沉淀，然后用液氮速凍，冷凍干燥機過夜[18]。將凍干的酶粉溶解于Tris-HCl（0.1 mol/L，pH=8.0）中，即可得到粗純化的酶液。酶液經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）檢測。

1.3.5 酯酶酶學性質研究

最適溫度及溫度穩定性：將純化的酶液分別在不同溫度（20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃）條件下孵育10 min，測定酶活，確定酯酶的最適溫度。在pH=8.0的條件下，純化的酶液在不同溫度（20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃）條件下孵育30 min，測定殘余的酶活力來分析酯酶的溫度穩定性。

最適pH及pH穩定性：將反應體系的pH調整至5.0～10.0，測定酯酶在不同pH值（5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0）條件下的酶活，確定酯酶的最適pH。酶液在不同pH（5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0）的緩沖溶液中40℃孵育30 min，測定殘余的酶活力來分析酯酶的pH穩定性。

底物鏈長的選擇性：反應體系中添加不同碳鏈長的對硝基苯酚脂肪酸酯乙醇溶液（10 mmol/L），包括對丁酸酯、己酸酯、辛酸酯、癸酸酯、十二烷酸酯、十四烷酸酯、十六烷酸酯。在相同的體系下測定酯酶對不同底物的水解酶活。

2 結果與分析

2.1 產酯酶菌株的篩選結果

經過初篩與復篩從宋河酒廠窖泥中共篩選出20株產酯酶的細菌，將其編號為SH-1～SH-20。20株細菌在三丁酸甘油酯平板上形成的透明圈直徑如表1所示，酯酶酶活如表2所示。

表1 20株產酯酶細菌在三丁酸甘油酯平板的透明圈直徑Table 1 Transparent circle diameter of 20 esterase-producing bacteria on tributyrin plates

由表1可知，從窖泥中分離出的20株菌株中，14株菌株在三丁酸甘油酯平板上產生的透明圈直徑≥5 mm，占窖泥樣品中分離菌株總數的70%；3株菌株（SH-17、SH-1和SH-18）的透明圈直徑達＞7 mm，其中菌株SH-17的透明圈直徑最大，為7.56 mm。

表2 20株產酯酶細菌的酯酶活力測定結果Table 2 Determination results of esterase activity of 20 esterase-producing bacteria

由表2可知，pPNP法測定酶活力復篩結果與三丁酸甘油酯平板法初篩結果一致。20株菌株中4株菌株的酶活力＞2 U/mL，占篩選菌株的25%，其中菌株SH-17的酯酶活力最高，為2.83 U/mg。因次，選取菌株SH-17進行鑒定。

2.2 菌株SH-17的鑒定結果

菌株SH-17在LB固體平板上的菌落形態、革蘭氏染色結果如圖1所示。由圖1可知，菌株SH-17的菌落呈淡黃色、光滑、圓潤、圓形，為革蘭氏陰性菌。

圖1 菌株SH-17的菌落形態（A）和革蘭氏染色結果（B）Fig.1 Colony morphology(A)and gram staining result(B)of strain SH-17

菌株SH-17的16S rDNA PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖2所示。由圖2可知，菌株SH-17的16S rDNA序列堿基長度在1 450 bp左右，與預期結果相符，進行測序。將菌株SH-17的16S rDNA測序結果進行Blast比對，采用Mega5.0軟件的NJ法構建系統發育樹，如圖3所示。

圖2 菌株SH-17的16S rDNA PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2 Agarose gel electrophoresis of 16S rDNA PCR amplification product of strain SH-17

圖3 基于16S rDNA序列菌株SH-17的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain SH-17 based on 16S rDNA sequences

由圖3可知，菌株SH-17與約氏不動桿菌（Acinetobacter johnsonii）有最高相似度，同源性達到98.57%。結合形態學特征及革蘭氏染色結果，鑒定菌株SH-17為約氏不動桿菌（Acinetobacter johnsonii）。

2.3 酯酶的純化結果

采用飽和度60%的硫酸銨對酯酶進行純化后，蛋白回收率為（42.19±0.36）%，酶活力回收率為（78.29±0.59）%，純化倍數為（1.68±0.11）倍。將經過硫酸銨沉淀和冷凍干燥后的酶粉溶于Tris-HCl（0.1 mol/L，pH=8.0）中，進行SDS-PAGE分析，結果如圖4所示。由圖4可知，純化的蛋白條帶單一且較清晰，其分子質量約為42 kDa。

圖4 純化蛋白聚丙烯酰胺凝膠電泳結果Fig.4 Polyacrylamide gel electrophoresis results of purified protein

2.4 酯酶酶學性質的研究

2.4.1 酯酶的最適溫度及溫度穩定性

在20～80℃的溫度范圍內，酯酶活力隨溫度的變化情況如圖5所示。由圖5可知，菌株SH-17所產酯酶在20～80℃的溫度范圍內均有活性，且隨著溫度的升高酶活性呈先升高后降低的趨勢。當溫度為40℃時，酶活力最高，因此，該酯酶的最適反應溫度為40℃。

圖5 溫度對酯酶酶活的影響Fig.5 Effect of temperature on esterase activity

酯酶經不同溫度（20～80℃）熱處理30 min后，酯酶活力變化結果如6所示。由圖6可知，酯酶經20～40℃處理30 min仍有90%以上的酶活力，而溫度高于40℃之后處理30 min后，酶活不斷降低，當溫度高于60℃之后，相對酶活僅為10%，此時的酯酶已喪失大部分活性，說明該酯酶耐高溫性能較差。

圖6 酯酶的溫度穩定性測定結果Fig.6 Determination results of temperature stability of esterase

2.4.2 酯酶的最適pH值及pH穩定性

40℃條件下菌株SH-17所產酯酶在pH值為5～10條件下酶活力變化如圖7所示。由圖7可知，菌株SH-17所產酯酶在pH值為5和6時基本無催化活性，當pH＞6之后，酶的催化活性隨pH值增加而升高，當pH=8時，達到最高催化活性，隨后酯酶的催化活性不斷降低，但在pH=10時該酶仍有20%的催化活性，說明該酶是一種弱堿性酯酶，其最適反應pH值為8。

圖7 pH值對酯酶酶活的影響Fig.7 Effect of pH on esterase activity

圖8 酯酶的pH值穩定性測定結果Fig.8 Determination results of pH value stability of esterase

酯酶在40℃條件下經不同pH（5～10）處理30 min后，酯酶活力變化結果如8所示。由圖8可知，酯酶經過不同pH處理30 min，在pH7.0～9.0的范圍內，其活力保持在60%以上；而在pH＜7.0或pH＞9.0的條件下，其酶活穩定性變低。結果表明，該酯酶在中性偏堿的環境中相對穩定。

2.4.3 底物碳鏈長的選擇性

以C4～C16相應的酯為底物測定菌株SH-17所產酯酶在40℃、pH=8.0條件下對不同底物的水解酶活，結果如圖9所示。由圖9可知，該酯酶對6個碳的底物催化活性最高，對于碳鏈長＞12的底物催化活性較低。結果表明，該酯酶對鏈長較短的底物催化活性較高，最適反應底物碳鏈長為6。推測該酯酶作用于酯化反應時可能對乙酸、己酸等短鏈酸有較高的催化活性，在白酒發酵過程中可以增加白酒中乙酸乙酯、己酸乙酯等香味成分[19-20]，對豐富白酒風味具有一定意義且對窖泥的評估和改良也有一定的參考價值。

圖9 酯酶對不同鏈長底物的水解活力Fig.9 Hydrolytic activity of esterase on substrates with different chain length

3 結論

本研究從白酒窖泥中共篩選出20株產酯酶菌株，其中菌株SH-17的酯酶活力最高，為2.83 U/mL。經形態觀察和分子生物學技術鑒定其為約氏不動桿菌（Acinetobacter johnsonii）。經飽和度60%的硫酸銨鹽析得到該酯酶分子質量約為42 kDa，最適反應溫度為40℃、最適pH值為8.0，高溫耐受性差，在中性偏堿的環境中相對穩定，且對碳鏈長較短的底物催化活性較高，最適反應底物碳鏈長為6。