柵欄技術在發酵辣椒保藏中的應用研究

張二康，王修俊，王麗芳，馮廷萃

（1.貴州大學 發酵工程與生物制藥省級重點實驗室，貴州 貴陽 550025；2.貴州大學 釀酒與食品工程學院，貴州 貴陽 550025；3.鎮遠縣名城食品廠，貴州 黔東南州 557700）

發酵辣椒是一種頗具特色的調味品，既保留了鮮辣椒原有的色澤、脆度、辣味和形態，又具有發酵制品[1]特有的濃郁香氣[2]、風味，同時有促進食欲、幫助消化、抗氧化、抑菌、抗動脈粥樣化[3]以及預防支氣管炎等功能[4]。但如今發酵辣椒產業受到產品質量不穩定及后續保藏技術的限制，使用抽真空、熱殺菌或添加防腐劑等某一種方法單獨處理發酵辣椒時，雖然可以達到保藏的目的，但強度較大，會導致發酵辣椒特有的風味及口感變差，而使用柵欄技術（hurdle technology，HT）就可以在保藏發酵辣椒的同時保證其品質。

柵欄技術這個概念最初是由德國肉類研究中心專家LEISTNER提出，是一套科學的、系統的將多種技術結合在一起的提高產品貨架期的綜合保藏方法[5]。造成食品發生腐敗變質的重要原因是由食品中的微生物（包含腐敗菌和致病菌）的生長繁殖、酶促和非酶促等生化反應引起的，將對食品品質有影響的柵欄因子單獨或者聯合后形成特殊的柵欄應用到食品中，不但對微生物生長起到控制作用，而且能使引起食品發生氧化變質的酶類物質失活，從而防止了食品的腐敗變質，降低了對食品的危害性，提高了食品的穩定性和衛生安全性，即柵欄技術。國內外有關研究多集中在肉及肉制品、水產品、果蔬等方面[6]，而有關柵欄技術在發酵辣椒保藏方面的研究卻鮮見報道。本試驗將柵欄技術應用到發酵辣椒的保藏中，通過控制食品保藏中的關鍵柵欄因子以及多因子的綜合控制來解決發酵辣椒的保藏問題，同時保證其品質。

1 材料與方法

1.1.1 材料與菌種

新鮮辣椒、大蒜、生姜：市售；食鹽（食品級）：四川久大制鹽有限公司；白酒（食品級）：北京紅星股份有限公司；復合菌劑（植物乳桿菌乳桿菌屬亞種（Lactobacillus plantarum subsp.lactobacillus）R-2，植物乳桿菌片球菌屬亞種（Lactobacillus plantarum subsp.pediococcus）R-4，菌種比例為R-2∶R-4=2∶1）：貴州大學發酵工程與生物制藥省級重點實驗室。

1.1.2 培養基

（1）MRS培養基：蛋白胨10.0 g，葡萄糖20.0 g，乙酸鈉5.0 g，酵母膏5.0 g，MnSO4·4H2O 0.25 g，牛肉膏10.0 g，MgSO4·7H2O 0.58 g，K2HPO42.0 g，吐溫80 1.0 mL，檸檬酸氫二銨2.0 g，蒸餾水1 000 mL，調節pH值至6.2～6.4，固體培養基需加瓊脂18.0 g，121℃滅菌15～20 min。

（2）平板計數瓊脂（plate count agar，PCA）培養基：酵母浸膏2.5 g，瓊脂15.0 g，胰蛋白胨5.0 g，葡萄糖1.0 g，蒸餾水1 000 mL，調節pH值至7.0±0.2，121℃滅菌15 min，滅完菌后可放于（46±1）℃恒溫水浴箱中保溫。

1.1.3 試劑

Nisin：河南安銳生物科技有限公司；脫氫乙酸鈉（食品級）：大偉生物工程有限公司；0.1 mol/L NaOH標準滴定溶液：國家標準溶液中心。

1.2 儀器與設備

DZ（Q）400真空（充氣）包裝機：上海兆發機械有限公司；XK97-A菌落計數器：姜堰市新康醫療器械有限公司；DZKW-4電子恒溫水浴鍋：上?？莆鲈囼瀮x器廠；FA2004B電子天平：上海越平科學儀器有限公司；LS-1F型凈化工作臺：上海索普儀器有限公司；XFS-280A手提式蒸汽滅菌器：浙江新豐醫療器械有限公司；SPX-250B-G型光照培養箱：上海博訊實業有限公司。

1.3 方法

1.3.1 發酵辣椒的制作

將鮮辣椒、姜和蒜洗凈、切分、裝壇，辣椒與鹽水的比例為1∶2，鹽水濃度為4%，在發酵溫度28℃，復合發酵菌劑配比為R-2∶R-4=2∶1，接種量為4%，發酵時間48 h的發酵工藝條件下將辣椒發酵成熟后，用復合袋盛裝100 g辣椒。

1.3.2 模擬加速試驗

通常在食品中運用的加速方法主要有：溫度的提高、光照和濕度的增加等。本試驗主要通過提高樣品的保藏溫度，將樣品包裝后放置于37℃的恒溫光照培養箱中培養，從而加快樣品中的反應速度和腐敗速度[8]。

1.3.3 單因子柵欄對發酵辣椒保藏性影響的研究

（1）真空度對發酵辣椒保藏性影響的研究

分別在真空度0.04 MPa、0.06 MPa、0.08 MPa、0.09 MPa、0.092 MPa（抽真空時間分別為3 s、5 s、10 s、30 s、50 s）條件下密封發酵辣椒，在37℃保溫7 d進行加速試驗，加速試驗后測定菌落總數、總酸度并結合感官確定最佳真空度。

（2）脫氫乙酸鈉對發酵辣椒保藏性影響的研究[9-10]

選取脫氫乙酸鈉的添加量分別為0.005%、0.010%、0.020%、0.030%。在1.3.3確定的真空度條件下抽真空包裝，加速試驗后測定菌落總數、總酸度并結合感官確定脫氫乙酸鈉的最適添加量。

（3）Nisin對發酵辣椒保藏性影響的研究

選取Nisin添加量分別為0.005%、0.010%、0.015%、0.020%。在1.3.3確定的真空度條件下抽真空包裝，加速試驗后測定菌落總數、總酸度并結合感官確定Nisin的最適添加量[11]。

（4）巴氏殺菌對發酵辣椒保藏性影響的研究

在1.3.3確定的真空度條件下抽真空包裝后，分別在水浴70 ℃、80 ℃條件下進行5 min、10 min、15 min、20 min的巴氏殺菌處理，加速試驗后測定菌落總數、總酸度并結合感官來確定辣椒的最佳殺菌條件。

1.3.4 柵欄因子的正交優化試驗

在單因素試驗的基礎上，以脫氫乙酸鈉添加量（A）、Nisin添加量（B）、殺菌溫度（C）和殺菌時間（D）柵欄因子為試驗因素，采用L9（34）正交表對影響發酵辣椒保藏的柵欄因子進行優化，因素與水平表見表1。

表1 發酵辣椒保藏條件優化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for preservation conditions optimization of fermented chilli

1.3.5 測定方法

菌落總數：按照GB 4789.2—2016《食品微生物學檢驗菌落總數測定》規定的平板計數法測定[12]，試驗結果以菌落總數（CFU/g）表示。

總酸度的測定：根據GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》[13]，選用pH電位法測定辣椒中總酸的含量。根據酸堿中和的原理，用標定好的NaOH溶液滴定試樣中的酸，當溶液的電位發生突躍時，即是滴定終點，以NaOH的消耗量計算出試樣中的總酸含量?？偹岫扔嬎愎饺缦拢?/p>

式中：總酸度以乳酸計，g/100 g；C為已知NaOH標準溶液的濃度，mol/L；V為滴定時消耗NaOH標準溶液的用量，mL；K為換算系數，其中乳酸的換算系數為0.09；F為試液的稀釋倍數；M為試樣的質量，g。

感官評分標準：乳酸發酵辣椒在保藏期間的感官評分標準見表2。

表2 發酵辣椒的感官評分標準Table 2 Sensory evaluation standard of fermented chili

2 結果與分析

2.1 單因子柵欄對發酵辣椒保藏性的影響

2.1.1 真空度對發酵辣椒保藏性的影響

真空度對發酵辣椒保藏性的影響結果見表3。

表3 真空度對發酵辣椒保藏性的影響Table 3 Effect of vacuum degree on the preservability of fermented chilli

由表3可知，隨著真空度的不斷增加，氧氣含量不斷減少，菌落總數逐漸下降，這說明在氧氣含量低的條件下，微生物的生長繁殖受到一定的抑制作用，在較高真空度條件下的包裝有利于抑制樣品中微生物的生長繁殖。當真空度≤0.06 MPa時，產品發生嚴重的褐變，真空度為0.08 MPa時發生輕微的褐變，當真空度≥0.09 MPa時，沒有發生褐變。發生褐變的原因是在較低的真空度條件下，由于環境中的氧化還原電勢較高而使辣椒中的多酚類物質發生褐變，抽真空能減少包裝袋中氧氣含量而降低氧化還原電勢以及減緩氧化反應的速度，從而可以有效的防止辣椒發生褐變。由表3可知，不同的真空度對辣椒的后發酵并沒有達到有效的控制，使酸度從發酵成熟后的0.82%增加至1.2%。由于在0.09 MPa和0.092 MPa時不僅菌落總數相差不大，都在一個數量級，而且在感官評定上相差也不大，且縮短了包裝所用的時間，提高了效率，故選擇0.09 MPa的真空度進行包裝。

2.1.2 脫氫乙酸鈉對發酵辣椒保藏性的影響

脫氫乙酸鈉添加量對發酵辣椒保藏性的影響結果見表4。

表4 脫氫乙酸鈉添加量對發酵辣椒保藏性的影響Table 4 Effect of sodium dehydroacetate addition on the preservability of fermented chilli

由表4可知，脫氫乙酸鈉對產品的后發酵有一定的控制作用，隨著添加量的增加，可以比較明顯的抑制酵母菌、霉菌、細菌等微生物的繼續發酵，但是仍不能完全有效的控制；隨著脫氫乙酸鈉添加量的增加，菌落總數呈下降的趨勢，脫氫乙酸鈉在一定程度上可以抑制微生物的生長繁殖。當脫氫乙酸鈉的添加量＞0.02%后，抑菌效果、感官評分增加不明顯，因此，選擇脫氫乙酸鈉的添加量為0.02%。

2.1.3 Nisin對發酵辣椒保藏性的影響

Nisin添加量對發酵辣椒保藏性的影響結果見表5。

表5 Nisin添加量對發酵辣椒保藏性的影響Table 5 Effect of nisin addition on the preservability of fermented chilli

由表5可知，結合酸度和感官可以看出，Nisin對后發酵有一定的抑制作用，隨著添加量的增加，可以比較明顯的抑制細菌等微生物的繼續發酵，但是還不能完全有效的控制；隨著Nisin添加量的增加，菌落總數呈下降的趨勢，Nisin在一定程度上可以抑制微生物的生長和繁殖。當Nisin的添加量＞0.015%后，抑菌效果、感官評分增加的不明顯，因此，選擇Nisin的添加量為0.015%。

2.1.4 巴氏殺菌對發酵辣椒保藏性的影響

巴氏殺菌對發酵辣椒保藏性的影響結果見表6。

由表6可知，相同殺菌時間下，80℃的菌落總數均＜70℃的菌落總數，可以看出殺菌溫度越高、殺菌時間越長，產品菌落總數越低，殺菌效果越好。其中在70℃加熱15 min后，菌落總數都沒有明顯的下降趨勢，當在80℃處理15 min時，菌落總數下降趨勢較大，殺菌效果明顯。

表6 殺菌溫度和時間對發酵辣椒保藏性的影響Table 6 Effects of sterilization temperature and time on the preservability of fermented chilli

從酸度變化來看，在70℃和80℃條件下處理時，酸度隨殺菌的時間延長逐漸降低，但在80℃處理時酸度降低較多，對后發酵有較好的抑制，但是由于高溫和長時間的處理對辣椒的風味又有影響，導致80℃處理20 min時其感官評分降低，因此在能控制微生物生長的同時，應盡量降低巴氏殺菌的溫度和縮短處理的時間。綜合菌落總數、總酸度并結合感官，選擇在80℃條件下處理15 min。

2.2 多個柵欄因子的交互作用對發酵辣椒保藏性的影響

表7 發酵辣椒保藏條件優化正交試驗結果與分析Table 7 Results and analysis of orthogonal tests for preservation conditions optimization of fermented chilli

從表7和表8可以看出，以菌落總數為評價指標時，最佳方案為A2B3C3D3，即脫氫乙酸鈉的添加量為0.02%，Nisin的添加量為0.02%，殺菌的溫度為85℃，殺菌時間為20 min。影響菌落總數的主次因素為C＞D＞B＞A，即殺菌溫度對菌落總數的影響最大，其次是殺菌時間和Nisin，影響最小的是脫氫乙酸鈉，其中殺菌溫度影響非常顯著，處理時間影響顯著，說明殺菌溫度越高，處理時間越長，菌落數越少，對微生物的生長抑制作用越強。

表8 正交試驗結果方差分析Table 8 Variance analysis of orthogonal tests results

當以感官為評價指標時，最佳方案為A2B3C1D1，即脫氫乙酸鈉的添加量為0.02%，Nisin的添加量為0.02%，殺菌溫度和時間分別為75℃和10 min，影響感官評分的主次因素為D＞C＞B＞A，即處理時間對感官的影響最大，殺菌溫度和Nisin次之，影響最小的是脫氫乙酸鈉，其中殺菌溫度和時間影響非常顯著，說明殺菌溫度越高，處理時間越長，對辣椒的風味等感官指標產生了比較嚴重的影響，使感官評分降低。

根據GB 5009.54—2003《醬腌菜衛生標準》[14]，規定大腸桿菌≤30 MPN/100 g，本試驗對大腸桿菌進行檢測，沒有發現大腸桿菌，而國標并未對菌落總數做出規定，參照其他產品的衛生標準，一般要求菌落總數≤1×103CFU/g，由于殺菌溫度和時間對產品的感官有比較嚴重的影響，所以在既能抑制微生物生長和控制后發酵的同時，又能保證產品的感官品質，最終將A2B3C1D1作為最佳柵欄組合，由于在正交試驗中沒有A2B3C1D1這項組合，所以補做這組試驗，在此條件下做了3次重復試驗，取平均值，其試驗結果為菌落總數的對數值（lgCFU/g）為2.30，感官評分為95分，總酸度為0.85%。經過該柵欄因子的組合處理后，不僅能抑制微生物的生長，沒有脹袋的發生，控制產品的繼續發酵，而且能使產品保持較好的感官品質，所以將該組合作為發酵辣椒保藏的最優方案。

3 結論

應用柵欄保藏技術可以很好的解決發酵辣椒的保藏問題，既達到發酵辣椒保藏的目的，又保證了其風味和品質。通過對真空度、脫氫乙酸鈉的添加量、Nisin的添加量、殺菌溫度和時間進行單因素試驗和正交試驗，以菌落總數和感官評分為指標，利用極差和方差方法確定了辣椒保藏的優化柵欄因子組合為添加0.02%的脫氫乙酸鈉和0.02%的Nisin，抽真空度為0.09 MPa密封后，在75℃的殺菌溫度下處理10 min，在此優化條件下，菌落總數的對數值為2.30，感官評分為95分，總酸度為0.85%。經過該柵欄因子組合處理的產品不僅可以抑制保藏期間微生物的生長，控制產品的繼續發酵，而且還有利于保證辣椒的感官。