朝鮮辣白菜中抗擴(kuò)展青霉乳酸菌的篩選與鑒定

孫 悅，劉佳伊，杜 宏，李 婧，白鳳翎*，王君勇，勵(lì)建榮

（1.渤海大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院 遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，遼寧 錦州 121013；2.寧夏出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫綜合技術(shù)中心，寧夏 銀川 750000）

霉菌是一類絲狀真菌，廣泛分布于自然環(huán)境中[1]。霉菌污染導(dǎo)致水果、蔬菜、糧食作物和動(dòng)物飼料等發(fā)生霉變，使食品和農(nóng)產(chǎn)品失去價(jià)值[2-4]。其中擴(kuò)展青霉（Penicillium expansum）是梨果采后腐爛病害的主要致病菌，其分泌產(chǎn)生的毒素對(duì)人體具有致癌、致畸、致突變等潛在威脅[5]。控制食品和農(nóng)產(chǎn)品中霉菌的方法包括物理法、化學(xué)法和生物法。物理法（加熱、紫外照射、微波等）[6]通常會(huì)影響食品的感官性狀，造成營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)流失。化學(xué)法應(yīng)用山梨酸鹽和丙酸鹽等化學(xué)防腐劑控制霉菌的生長(zhǎng)，但存在一定的安全隱患。生物法主要應(yīng)用茶多酚、殼聚糖、溶菌酶等生物制劑抑制霉菌的生長(zhǎng)，具有綠色、安全、高效的特點(diǎn)，已成為食品防腐領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)[7]。

乳酸菌作為一種新型生物制劑廣泛應(yīng)用于肉制品、乳制品、果蔬制品等防腐保鮮，其主要通過產(chǎn)生的有機(jī)酸、細(xì)菌素、過氧化氫等代謝物質(zhì)抑制食品中腐敗微生物的生長(zhǎng)[8]。李院等[9]從醬菜中分離得到3株對(duì)青霉拮抗作用較強(qiáng)的乳酸菌L511、L520、L544，抑菌圈直徑均＞18.0 mm，并推測(cè)抑菌物質(zhì)是有機(jī)酸類；李曉婷[10]從內(nèi)蒙古傳統(tǒng)發(fā)酵食品中分離得到對(duì)黃曲霉拮抗活性較強(qiáng)的乳酸菌ALAC-1、ALAC-4，最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）分別為62.50 mg/mL、31.25 mg/mL；尹雪等[11]從新疆傳統(tǒng)發(fā)面面肥中分離得到3株對(duì)黃曲霉抑制效果較好的乳酸菌F3、F11、F12，抑菌圈直徑分別為23.0 mm、45.0 mm、18.0 mm；EBRAHIMIM等[12]從傳統(tǒng)發(fā)酵食品中分離得到1株拮抗活性較強(qiáng)的小球菌，對(duì)黃曲霉和黑曲霉的抑制率分別為70.32%和98.8%。目前，關(guān)于從朝鮮辣白菜中分離出抗擴(kuò)展青霉乳酸菌的相關(guān)報(bào)道較少。

朝鮮辣白菜是以中國(guó)大白菜為主要原料，利用天然微生物發(fā)酵而成的傳統(tǒng)發(fā)酵食品，在發(fā)酵過程和產(chǎn)品中含有豐富的乳酸菌資源[13-14]。因此，本研究采用菌餅法從朝鮮辣白菜中分離對(duì)擴(kuò)展青霉具有拮抗活性的乳酸菌，通過形態(tài)觀察、生理生化試驗(yàn)及分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)其進(jìn)行鑒定，并對(duì)其抑菌物質(zhì)的特性及抑菌機(jī)理進(jìn)行初步研究，為研發(fā)一種控制霉腐微生物的乳酸菌生物防腐劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品與菌株

朝鮮辣白菜：錦州市金凌商場(chǎng)、錦州白樓農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)、錦州牡丹農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)等；擴(kuò)展青霉（Penicillium expansum）CMCC 3.3703：中國(guó)醫(yī)學(xué)細(xì)菌菌種保藏管理中心。

1.1.2 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基、PDA液體培養(yǎng)基：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

MRS固體培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g，酵母粉4.0 g，牛肉粉5.0 g，乙酸鈉5.0 g，葡萄糖20.0 g，磷酸氫二鉀2.0 g，檸檬酸三銨2.0 g，硫酸錳0.05 g，硫酸鎂0.2 g，吐溫-80 1.0 mL，瓊脂粉15.0 g，蒸餾水1.0 L，pH 6.0～6.4，121 ℃滅菌15 min。MRS液體培養(yǎng)基中不添加瓊脂粉。

1.1.3 試劑

乳酸、乙酸、丙酸、苯乳酸（均為分析純）：美國(guó)Sigma公司；胃蛋白酶（15 000 U/g）、木瓜蛋白酶（200 000 U/g）、中性蛋白酶（200 000 U/g）、胰蛋白酶（250 000 U/g）：上海華藍(lán)化學(xué)科技有限公司；Taq PCR Master mix、細(xì)菌基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）快速抽提試劑盒、DNA Marker：生工生物工程（上海）股份有限公司；乳酸菌生化鑒定管：杭州天合微生物試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DL-CJ-2N型超級(jí)潔凈工作臺(tái)：東聯(lián)哈爾（北京）儀器制造有限公司；DYY-8C電泳儀：北京市六一儀器廠；ABI stepone plus聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀、5804R冷凍高速離心機(jī)：德國(guó)艾本德股份有限公司；Cheimdox XRS凝膠成像儀：美國(guó)Bio-Rad公司；S-4800掃描電鏡：日本日立公司；SPX-250智能生化培養(yǎng)箱：寧波海曙賽福實(shí)驗(yàn)儀器廠；UV2550紫外可見分光光度計(jì)：日本島津公司；PHSJ-3F pH計(jì)：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；FA1004精密電子天平：上海恒平科學(xué)儀器有限公司；IKA Vortex GENIUS 3振蕩器：德國(guó)IKA公司；GI54DS立式高壓蒸汽滅菌鍋：致微（廈門）儀器有限公司；KJELTEC 8000凱氏定氮儀：丹麥福斯公司；DZF-6050型真空干燥箱：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌的分離

參照文獻(xiàn)[15]并稍作修改。無菌條件下取出適量朝鮮辣白菜樣品，采用接種環(huán)挑取每個(gè)樣品汁液1環(huán)，劃線于含1.0%CaCO3的MRS固體培養(yǎng)基，37℃條件下培養(yǎng)48 h，選取有溶鈣圈的乳白色典型菌落進(jìn)行過氧化氫酶試驗(yàn)和革蘭氏染色。

1.3.2 乳酸菌抗擴(kuò)展青霉活性的測(cè)定

乳酸菌無細(xì)胞上清液（cell free supernatant，CFS）的制備：參照文獻(xiàn)[16]并稍作修改。在MRS液體培養(yǎng)基中接種乳酸菌菌株，37℃培養(yǎng)并傳代2次，再以2%（V/V）的接種量接種于1.0 LMRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)12～24 h。4℃、6 000 r/min條件下離心15 min，上清液經(jīng)0.45μm的濾膜過濾除菌，得到乳酸菌CFS，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

抗擴(kuò)展青霉活性的測(cè)定：參照文獻(xiàn)[17]中的菌餅法并稍作修改。在無菌條件下，挑取1環(huán)擴(kuò)展青霉于PDA培養(yǎng)基中，25℃避光培養(yǎng)5 d。用直徑為7.0 mm專用打孔器從培養(yǎng)5 d的擴(kuò)展青霉菌落邊緣制取菌餅，接種于含10%乳酸菌CFS的PDA培養(yǎng)基中央。25℃避光培養(yǎng)，以接種擴(kuò)展青霉的PDA培養(yǎng)基為空白對(duì)照，計(jì)算乳酸菌對(duì)擴(kuò)展青霉的抑菌率，其計(jì)算公式如下：

式中：d0為對(duì)照組擴(kuò)展青霉菌落直徑，mm；dx為實(shí)驗(yàn)組擴(kuò)展青霉菌落直徑，mm。

1.3.3 乳酸菌菌株鑒定

形態(tài)學(xué)鑒定：將分離的乳酸菌劃線于MRS培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)。采用革蘭氏染色法染色并在顯微鏡下觀察。

生理生化鑒定：參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[18]和《乳酸細(xì)菌分類鑒定及實(shí)驗(yàn)方法》[19]對(duì)乳酸菌菌株進(jìn)行生理生化鑒定。

分子生物學(xué)鑒定：參照文獻(xiàn)[20]對(duì)分離乳酸菌的16S rRNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果提交至美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST同源性搜索，選取同源性較高的模式菌株的16S rRNA序列，采用MEGA 5.0軟件中的鄰接（neighbor-joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.4 乳酸菌對(duì)擴(kuò)展青霉的拮抗機(jī)理研究

pH對(duì)乳酸菌抗擴(kuò)展青霉活性的影響：采用1.0 mol/L NaOH和1.0 mol/L HCl將乳酸菌CFS的pH分別調(diào)至2.5、3.0、4.0、5.0、6.0，以未處理的乳酸菌CFS作對(duì)照。

溫度對(duì)乳酸菌抗擴(kuò)展青霉活性的影響：將乳酸菌CFS分別在50℃、70℃、100℃處理30 min、121℃處理15 min，以未處理的乳酸菌CFS作為對(duì)照組。

蛋白質(zhì)對(duì)乳酸菌抗擴(kuò)展青霉活性的影響：采用1.0 mol/L NaOH和1.0 mol/L HCl將乳酸菌CFS的pH分別調(diào)至胃蛋白酶（pH 2.0）、木瓜蛋白酶（pH 7.0）、中性蛋白酶（pH 7.0）、胰蛋白酶（pH 7.5）的最適pH，再分別加入相應(yīng)的蛋白酶，使其最終濃度為1.0 mg/mL，室溫條件下處理4 h，以未處理的乳酸菌CFS作為對(duì)照組。

測(cè)定乳酸菌CFS中乳酸、乙酸、丙酸、苯乳酸的含量，采用MRS液體培養(yǎng)基配制與乳酸菌CFS中相同濃度的乳酸、乙酸、丙酸、苯乳酸以及四種混合酸，測(cè)定其對(duì)擴(kuò)展青霉的抑菌活性。

1.3.5 乳酸菌CFS對(duì)擴(kuò)展青霉細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響

參照文獻(xiàn)[21]并稍作調(diào)整，研究乳酸菌CFS對(duì)擴(kuò)展青霉細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響。以不加乳酸菌CFS為對(duì)照組，5.0 mL乳酸菌CFS中加入200μL指示菌，30℃、150 r/min條件下培養(yǎng)12 h。4℃、6 000 r/min離心10 min，收集菌體。在2.5%戊二醛溶液中4℃固定過夜，用0.1 mol/L pH 7.2磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）洗滌2次，除去殘留戊二醛，洗滌后菌體用無菌水懸浮，用膠頭滴管取適量滴于潔凈蓋玻片，真空干燥12 h，噴金鏡檢。

1.3.6 測(cè)定方法

乙酸、乳酸、丙酸的測(cè)定：參照文獻(xiàn)[22]；苯乳酸的測(cè)定：參照文獻(xiàn)[23]。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗擴(kuò)展青霉乳酸菌的分離和初篩

從朝鮮辣白菜中共分離得到62株具有白色溶鈣圈的典型菌落，經(jīng)革蘭氏染色和過氧化氫酶試驗(yàn)確認(rèn)45株為乳酸菌。采用菌餅法從45株乳酸菌中篩選出5株對(duì)擴(kuò)展青霉拮抗活性較強(qiáng)的乳酸菌，分別編號(hào)為PC-1、PC-2、PC-3、PC-4、PC-5，其對(duì)擴(kuò)展青霉的抑制率分別為60.37%、61.53%、68.62%、59.97%、63.44%。其中，乳酸菌PC-3的抑菌率最高，因此，選擇菌株P(guān)C-3進(jìn)行下一步研究。

2.2 乳酸菌PC-3對(duì)擴(kuò)展青霉的抑菌效果

菌株P(guān)C-3對(duì)擴(kuò)展青霉的抑菌效果見圖1。

圖1 擴(kuò)展青霉的生長(zhǎng)情況（A）及菌株P(guān)C-3對(duì)其的抑菌作用（B）Fig.1 Growth situation of Penicillium expansum(A)and antimycotic activity of strain PC-3 on it(B)

由圖1可知，無乳酸菌PC-3 CFS添加，擴(kuò)展青霉生長(zhǎng)茂盛，布滿整個(gè)平板；添加乳酸菌PC-3 CFS后，擴(kuò)展青霉的生長(zhǎng)受到明顯的抑制，抑菌率為68.62%。

2.3 乳酸菌PC-3的鑒定

2.3.1 形態(tài)學(xué)鑒定

菌株P(guān)C-3的菌落形態(tài)及細(xì)胞形態(tài)見圖2。

圖2 菌株P(guān)C-3的菌落形態(tài)（A）及細(xì)胞形態(tài)（B）Fig.2 Colony(A)and cell(B)morphology of strain PC-3

由圖2A可知，菌株P(guān)C-3的菌落呈乳白色，不透明，中央凸起，邊緣整齊，表面光滑，菌落直徑為0.5～2.0 mm，具有典型乳酸菌生長(zhǎng)特征。由圖2B可知，菌體PC-3為革蘭氏陽(yáng)性菌，菌體為短桿狀排列，無鞭毛，無芽孢。

2.3.2 生理生化試驗(yàn)結(jié)果

菌株P(guān)C-3的生理生化試驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 菌株P(guān)C-3的生理生化試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Physiological and biochemical tests results of strain PC-3

由表1可知，菌株P(guān)C-3不能液化明膠，不能發(fā)酵葡萄糖酸鹽，能發(fā)酵利用除棉籽糖、鼠李糖、木糖以外的其他糖類。根據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[18]和《乳酸細(xì)菌分類鑒定及實(shí)驗(yàn)方法》[19]初步鑒定菌株P(guān)C-3為乳桿菌屬（Lactobacillus）。

2.3.3 分子生物學(xué)鑒定

菌株P(guān)C-3的16S rRNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖見圖3。由圖3可知，在堿基長(zhǎng)度為1 500 bp處有特異性條帶，與目的基因相符，表明目標(biāo)片段被成功擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果在NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST同源性比對(duì)，選取同源性較高的模式菌株的16S rRNA序列，采用MEGA5.0軟件中的NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖4。由圖4可知，菌株P(guān)C-3和清酒乳桿菌（Lactobacillus sakei）CP022709.1聚于一支，親緣關(guān)系最近，相似度達(dá)96%。因此，鑒定菌株P(guān)C-3為清酒乳桿菌（Lactobacillus sakei）。

圖3 菌株P(guān)C-3 16S rRNA基因的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.3 Agarose gel electrophoresis of 16S rRNA gene of strain PC-3

圖4 基于16S rRNA基因序列菌株P(guān)C-3的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of strain PC-3 based 16S rRNA gene sequences

2.4 乳酸菌拮抗作用及機(jī)理的研究

2.4.1 pH對(duì)乳酸菌PC-3 CFS抗擴(kuò)展青霉的影響

不同pH值對(duì)菌株P(guān)C-3 CFS抑制擴(kuò)展青霉的影響見圖5。

圖5 不同pH值對(duì)菌株P(guān)C-3 CFS抗擴(kuò)展青霉的影響Fig.5 Effect of different pH on the antimycotic activity of strain PC-3 CFS on Penicillium expansum

由圖5可知，隨pH值逐漸升高，菌株P(guān)C-3 CFS對(duì)擴(kuò)展青霉的抑菌率呈先上升后下降趨勢(shì)。當(dāng)pH值為4.0時(shí)，菌株P(guān)C-3 CFS對(duì)擴(kuò)展青霉抑菌效果最好，抑菌率為64.97%；當(dāng)pH值為6.0時(shí)，菌株P(guān)C-3 CFS基本失去對(duì)擴(kuò)展青霉的抑菌作用。

2.4.2 溫度對(duì)乳酸菌PC-3 CFS抗擴(kuò)展青霉的影響

溫度對(duì)菌株P(guān)C-3 CFS抑制擴(kuò)展青霉影響見圖6。

圖6 溫度對(duì)菌株P(guān)C-3 CFS抗擴(kuò)展青霉的影響Fig.6 Effect of temperature on the antimycotic activity of strain PC-3 CFS on P enicillium expansum

由圖6可知，菌株P(guān)C-3 CFS經(jīng)50℃處理30 min，對(duì)擴(kuò)展青霉的抑菌率為66.54%，抑菌效果最強(qiáng)；經(jīng)70℃、100℃處理30 min和121℃處理15 min后抑菌率分別下降至43.07%、20.13%和10.07%，表明菌株P(guān)C-3 CFS對(duì)擴(kuò)展青霉的抑菌率隨溫度的升高而逐漸減弱，溫度對(duì)抑菌活性具有顯著的影響（P＜0.05）。

2.4.3 蛋白質(zhì)酶對(duì)乳酸菌PC-3 CFS抗擴(kuò)展青霉的影響

乳酸菌PC-3 CFS分別經(jīng)木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶室溫下處理4 h，菌株P(guān)C-3 CFS對(duì)擴(kuò)展青霉的抑菌率分別為60.66%、60.37%、60.44%、59.96%，無顯著差異（P＞0.05）。因此，初步推測(cè)其抑菌活性物質(zhì)為非蛋白類。

2.4.4 乳酸菌抗擴(kuò)展青霉的活性物質(zhì)分析結(jié)果

乳酸菌CFS中乳酸、乙酸、丙酸和苯乳酸的含量分別為6.52μg/mL、2.62μg/mL、0.05μg/mL和1.86μg/mL，含相同質(zhì)量濃度乳酸、乙酸、丙酸、苯乳酸以及四種混合酸的MRS液體培養(yǎng)基對(duì)擴(kuò)展青霉的抑菌結(jié)果見表2。

表2 乳酸、乙酸、丙酸、苯乳酸及混合酸對(duì)擴(kuò)展青霉的抑菌率Table 2 Anti-mycotic rate of lactic acid,acetic acid,propionic acid,phenyl lactic acid and mixed acids on Penicillium expansum

由表2可知，乳酸和乙酸對(duì)擴(kuò)展青霉的抑菌率分別為67.58%和66.73%，丙酸和苯乳酸對(duì)擴(kuò)展青霉均沒有抑菌效果；將乳酸、乙酸、丙酸和苯乳酸按比例組合成混合酸，抑菌率為68.77%。結(jié)果表明，菌株P(guān)C-3 CFS中的主要抑菌活性物質(zhì)為乳酸和乙酸。ANA G等[24]研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌抑制真菌的活性物質(zhì)為有機(jī)酸類物質(zhì)，與本研究結(jié)果相似。

2.5 乳酸菌PC-3 CFS對(duì)擴(kuò)展青霉細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響

菌株P(guān)C-3 CFS對(duì)擴(kuò)展青霉細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響見圖7。

圖7 擴(kuò)展青霉分生孢子形態(tài)（A）及菌株P(guān)C-3 CFS對(duì)其的影響（B）Fig.7 Conidial morphology of Penicillium expansum(A)and effect of strain PC-3 CFS on it(B)

由圖7A可知，未經(jīng)菌株P(guān)C-3 CFS抑制的擴(kuò)展青霉分生孢子圓潤(rùn)，表面光滑，結(jié)構(gòu)完整。由圖7B可知，經(jīng)菌株P(guān)C-3 CFS處理后，擴(kuò)展青霉分生孢子胞壁結(jié)構(gòu)不完整，邊緣模糊，胞內(nèi)物質(zhì)外泄。結(jié)果表明，菌株P(guān)C-3 CFS對(duì)擴(kuò)展青霉分生孢子胞壁結(jié)構(gòu)具有較強(qiáng)損傷作用，其作用機(jī)理和對(duì)擴(kuò)展青霉分生孢子胞壁結(jié)構(gòu)的破壞過程需進(jìn)一步研究。DA R N A等[25]研究表明，用水楊酸處理擴(kuò)展青霉，細(xì)胞結(jié)構(gòu)溶解，蛋白質(zhì)泄露，與本研究結(jié)果相似。

3 結(jié)論

本研究從朝鮮辣白菜中分離出對(duì)擴(kuò)展青霉拮抗作用較強(qiáng)的乳酸菌PC-3，經(jīng)形態(tài)觀察、生理生化和分子生物學(xué)鑒定為清酒乳桿菌（Lactobacillus sakei）。菌株P(guān)C-3 CFS對(duì)擴(kuò)展青霉的抑菌活性隨pH值的升高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，隨溫度的升高而下降。蛋白酶的添加對(duì)其抑菌活性沒有影響，初步證明抑菌成分為非蛋白類物質(zhì)。菌株P(guān)C-3 CFS中乳酸和乙酸的含量為6.52μg/mL、2.62μg/mL，對(duì)擴(kuò)展青霉抑菌率分別為67.58%和66.73%，乳酸和乙酸為菌株P(guān)C-3抑制擴(kuò)展青霉的主體活性成分。經(jīng)掃描電鏡觀察，菌株P(guān)C-3抑制擴(kuò)展青霉活性的機(jī)制主要使其為細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)失去完整性，導(dǎo)致細(xì)胞原生質(zhì)泄露。該研究為研發(fā)一種控制食品和農(nóng)產(chǎn)品中霉菌的生物防腐劑奠定基礎(chǔ)。