一株可提升豆醬風味乳酸菌的篩選、鑒定及應用

周其洋，侯 杰

（佛山市海天（高明）調味食品有限公司，廣東 佛山 528000）

豆醬為我國傳統發酵豆制品，具有風味獨特、營養豐富、口感鮮咸協調，柔和而回味悠長，易于消化吸收的特點，深受中外消費者的青睞[2]。隨著改革開放的進程，米曲霉（Aspergillus oryzae）、醬油曲霉（Aspergillus sojae）、酵母菌等純菌種應用技術在傳統釀造中得到了廣泛應用[2]。但是目前絕大多數的廠家還是采取的半開放式釀造工藝[3]，不可避免的會接入天然釀造微生物。因此，實際上的釀造過程仍然屬于多菌種共酵的工藝[4-6]。在豆醬制曲過程中，枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）[7]的生長會消耗原料中的碳水化合物、有機酸和氨基酸，產生不良氣味，還會產生抗真菌性物質且迅速消耗氧氣，從而抑制曲霉生長，降低曲霉的蛋白酶活，嚴重影響后續發酵質量。同時，芽孢桿菌還是造成醬、醬油產品變質的主要微生物。乳酸菌能夠產生一些抑菌成分[8]，對微生物起到抑制作用[9-11]，比如說Nisin，是一種由34個氨基酸組成的多肽類物質[12]，目前已經作為一種天然防腐劑被廣泛應用于食品加工業之中，對多種革蘭氏陽性菌有較強的抑菌作用[13]。另外，研究表明[14-15]，乳桿菌屬（Lactobacillus）、乳球菌屬（Lactococcus）、片球菌屬（Pediococcus）、明串珠菌屬（Leuconostoc）、肉食桿菌屬（Carnobacterium）等乳酸菌均能產生成分不同、性質各異的抑菌成分。目前，對于豆醬釀造過程中的微生物菌群組成研究比較多，而對于不同微生物間的拮抗調控關系研究比較少，更缺乏應用方面的報道。

本實驗采用豆醬作為培養基。研究并加以富集、篩選、鑒定及強化對豆醬風味有明顯提升的乳酸菌，對枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）等有害微生物進行拮抗調控，不僅對于促進曲霉生長、提升成曲酶活、改善發酵程度有重要貢獻[16-19]，還能夠改善產品煮制階段的工藝設計，降低產品煮制殺菌加熱強度，節約能源消耗，提升產品感官風味質量[20]，對于實際生產具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料和菌種

豆醬：佛山市海天（高明）調味食品有限公司發酵曬場；米曲霉（Aspergillus oryzae）As3.042：佛山市海天（高明）調味食品有限公司菌種保藏中心；乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）YB1、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）YB2：佛山市海天（高明）調味食品有限公司實驗室篩選。

1.1.2 化學試劑

CaCO3（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；大豆、面粉、精制食用鹽（均為食品級）：佛山市海天（高明）調味食品有限公司；瓊脂粉（生化試劑）：廣東環凱生物科技有限公司。

1.1.3 培養基

MRS肉湯培養基、LB液體培養基、LB固體培養基、MRS培養基、平板計數瓊脂（plate count agar，PCA）培養基：廣東環凱生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

SHP-250型生化培養箱：廣東環凱生物科技有限公司；DL-CJ-2N型超級潔凈工作臺：北京東聯哈爾儀器制造有限公司；S-18K組織勻漿器：常州市金壇晨陽電子儀器廠；2K15離心機：德國Sigma公司；ZHPW-70臺式振蕩培養箱：天津萊玻特瑞儀器設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 目標豆醬收集

選取氨基酸態氮含量＜0.50 g/100 g，總酸含量＞2.50 g/100 g的豆醬進行感官鑒評，結果顯示口感酸味明顯、鮮味較弱、醬香風味不顯著且有異味的發酵豆醬為劣質豆醬。選取氨基酸態氮含量＞1.50 g/100 g，總酸含量＜1.30 g/100 g的豆醬進行感官鑒評，結果顯示酸甜協調、鮮咸柔和、醬香突出純正的豆醬為優質豆醬。分析劣質豆醬和優質豆醬中的芽孢桿菌和乳酸菌的含量。

1.3.2 特征微生物培養及驗證

有害微生物菌群培養及驗證：將LB培養基140 g，發酵豆醬60 g勻漿，加入食鹽10 g，121℃滅菌20 min。冷卻至室溫后接入2 g劣質豆醬，于37.0℃條件下150 r/min搖瓶培養40 h，菌種成熟。取成熟菌液按1%（V/V）接種量，按該培養方案傳代3次，得有害微生物菌群培養液。

將有害微生物菌群培養液于10 000×g條件下離心10 min，收集菌體。將1 g離心收集的菌體添加至1 000 g豆醬中進行30℃恒溫靜置發酵。發酵60 d后取出豆醬測定其總酸、氨基酸態氮含量，并進行感官鑒評。

有益微生物菌群培養及驗證：將MRS肉湯培養基140 g，發酵豆醬60 g勻漿，加入食鹽10 g，121℃滅菌15 min。冷卻至室溫后接入2 g優質豆醬，于35.0℃條件下靜置培養40 h，菌種成熟。取成熟菌液按1%（V/V）接種量，按該培養方案傳代3次，得有益微生物菌群培養液。

將有益微生物菌群培養液于10 000×g條件下離心10 min，收集菌體。將1 g離心收集的菌體添加至1 000 g豆醬中進行30℃恒溫靜置發酵。發酵60 d后取出豆醬測定其總酸、氨基酸態氮含量，并進行感官鑒評。

1.3.3 目標菌株初篩

將有害微生物菌群培養液稀釋10 000倍后，取100μL涂布至LB平板。37.0℃培養至菌落直徑約1 mm時，進行3次劃線純化。純化后的單菌株接種至含鹽量5%的LB培養基，37.0 ℃、150 r/min條件下培養40 h。菌種成熟后10 000×g條件下離心10 min，取1 g菌體添加至1 000 g豆醬進行發酵。選能造成豆醬總酸升高至2.5 g/100 g，且豆醬產生異味的菌株標定為有害菌株，以YB命名。

通常認為能對其他微生物形成抑制的乳酸菌都有一定的產酸能力，因此，采用CaCO3水解圈直徑作為初篩評價指標。有益微生物菌群培養液稀釋10 000倍后，取100μL加至平板，將含5%鹽及0.5%CaCO3的MRS培養基傾注至平板內。35.0℃培養至菌落直徑約1 mm時，進行3次劃線純化。純化后的單菌株接種至含鹽量10%的MRS肉湯，35.0℃培養40 h，獲得初篩乳酸菌[21]，以ZF命名。

1.3.4 目標菌株復篩

由于篩選能對豆醬風味形成破壞的菌株相對容易，但是篩選能對豆醬產生明顯品質提升的乳酸菌則相對困難，且工作量極大。因此，將已獲得的芽孢桿菌YB菌株作為驗證手段，若該菌株能夠對YB菌株形成抑制的，則說明有一定的抑菌能力，可能對豆醬發酵形成正向作用，以此來促進目標乳酸菌的篩選。采用杯碟法進行抑菌試驗篩選，操作如下：采用1%的K2HPO4的改良LB培養基作為指示菌生長培養基，采用兩株有害微生物單菌（YB1、YB2來源于1.3.3篩選所得）作為指示菌，將15 mL指示菌生長培養基倒入直徑9 cm的培養皿中，待冷卻凝固后，加入0.2 mL指示菌懸液，涂布均勻，待干燥后用無菌鑷子放置牛津杯，靜置20 min后取發酵液0.1 mL加入牛津杯內。40℃培養48 h，測量抑菌圈直徑，挑選抑菌圈直徑＞1.30 cm的菌懸液對應的菌株作為復篩目標菌株。

1.3.5 菌種鑒定

提取優良菌株的脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA），以其為模板進行16S rDNA PCR擴增，PCR擴增產物進行測序鑒定。對檢測所得的基因序列進行比對，按照基因片段相識度辨別目標菌株的種屬關系。

1.3.6 菌種應用驗證

將篩選得到的有害菌株單菌和有益菌株單菌擴培后，成熟菌種10 000×g條件下離心10 min取沉淀。將1 g菌體沉淀混入1 000 g豆醬進行30℃恒溫發酵。對成熟豆醬進行總酸、氨基酸態氮含量的檢測和感官鑒評。

1.3.7 分析檢測

總酸含量的測定采用國標GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》；氨基酸態氮含量的測定采用國標GB 5009.235—2016《食品安全國家標準食品中氨基酸態氮的測定》；枯草芽孢桿菌的檢測采用國家出入境檢驗檢疫行標SN/T 2728—2010《枯草芽孢桿菌檢測鑒定方法》；乳酸菌的檢測采用國標GB 4789.35—2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗乳酸菌檢驗》。樣品的感官鑒評由30位有1年以上豆醬鑒評經驗的人員從色澤、口感及香氣方面采用5分制評分法進行鑒評。

2 結果與分析

2.1 目標豆醬收集

對豆醬樣品進行理化檢測及感官鑒評，結果如表1所示。

表1 不同豆醬樣品理化分析和感官鑒評結果Table 1 Physical and chemical analysis and sensory evaluation results of different soybean paste samples

由表1可知，1號樣品和2號樣品在風味感官上較低，綜合評分均值2.3～2.5分，其酸味較重，鮮味弱而微有異味。而3號樣和4號樣在風味感官上較優，綜合評分均值4.5～4.6分，其鮮咸協調，醬香濃郁。分析原因是由于1號和2號豆醬中枯草芽孢桿菌大量生長，爭奪了豆醬發酵過程中的營養資源，同時當枯草芽孢桿菌數量增殖到1.0×106CFU/g后，會抑制豆醬發酵關鍵微生物米曲霉的生長，導致米曲霉產生的以中性蛋白酶為代表的酶活力明顯下降，使豆醬中的蛋白質分解明顯偏離正常水平，使其氨基酸態氮含量明顯低于較優的3號和4號豆醬。微生物體系、酶系的失衡，導致產酸微生物的生長。造成豆醬總酸高，氨基酸態氮低的情況，形成了豆醬酸而不鮮的口感。而芽孢菌的生長會產生異味，使豆醬的氣味較差。而乳酸菌的生產，由于其菌體總量并不高，并沒有因為其是產酸菌而導致總酸升高。同時乳酸菌通過其生長活動抑制了芽孢桿菌等有害菌的生長，使豆醬發酵的微生物體系達到正常水平。

綜上所述，是某種產酸的乳酸菌對以芽孢桿菌為代表的有害菌形成抑制，使豆醬發酵微生物體系向形成良好風味的方向轉變。因此，設計一種以CaCO3為初篩模型，以芽孢桿菌為復篩方案的篩選模型，來篩選目標乳酸菌。

2.2 特征微生物培養及驗證

將有害及有益的微生物菌群進行富集后，采用LB固體培養基和MRS平板檢測其中的芽孢桿菌數和乳酸菌含量?？莶菅挎邨U菌的數量從初始的1.0×104CFU/g上升至6.8×107CFU/g。乳酸菌數從初始的1.0×104CFU/g上升至培養后的3.5×108CFU/g。將富集培養液回添至豆醬發酵體系中后，考察富集菌株對其風味的影響，結果見圖1。

圖1 添加富集菌種對發酵的影響Fig.1 Effect of adding enriched strains on fermentation

由圖1可知，目標豆醬（優質豆醬和劣質豆醬）擴大培養傳代3次后，離心收集菌體，排除原有豆醬中的風味成分對豆醬的添加菌株產生的影響。通過添加試驗發現：添加了有害微生物菌液離心菌體的豆醬表現出品質劣化的特性，添加了有益微生物菌液離心菌體的豆醬表現出豆醬品質更優良的特性。且該特性流加至其他空白豆醬具有傳染性，說明是某些微生物對豆醬的品質形成了顯著影響?？诟斜憩F為添加有益微生物菌群豆醬產品較未添加目標菌種的發酵豆醬香氣更加濃郁、協調?？诟懈訁f調，表現出酸、甜、咸、鮮糅合在一起的豐富感，而未添加富集菌種的發酵醬則口感較為平淡。分析原因可能是由于有益的乳酸菌得到快速的增殖，對有害的芽孢桿菌形成了競爭性抑制。同時乳酸菌可能通過產生的乳酸也有效抑制了其他雜菌的生長。如果從豆醬體系中獲得能明顯改善豆醬品質的純種乳酸菌菌株，擴大培養后添加至豆醬發酵中，則可以整體提升豆醬品質。

2.3 目標菌株初篩

從富集的有害微生物菌液中，共計篩選到32株可以造成不良影響的芽孢桿菌。其中菌株YB1和YB2添加后發酵體系產酸及氣味變臭最明顯。于是將對這兩株菌的抑菌效果作為目標乳酸菌篩選的驗證條件。通過對有益微生物菌液進行分離，共挑選獲得了59株菌，培養24 h時可在含CaCO3的MRS培養基形成2 mm以上水解圈。對59株初篩乳酸菌進行傳代穩定性驗證，觀察3次傳代過程中菌種的生長情況及水解圈形成情況，挑選其中生長比較快，水解圈較大（＞2 mm）的9株菌為初篩菌株。

2.4 目標菌種株復篩

9株初篩菌對兩株枯草芽孢桿菌YB1和YB2的抑菌試驗結果見圖2。

由圖2可知，9株初篩菌對兩株枯草芽孢桿菌YB1和YB2都具有一定抑菌活性，其抑菌圈直徑在1.30～1.60 cm之間。其中菌株ZF559和ZF757的抑菌圈直徑在1.50～1.60 cm之間，較其他菌株更強，且對芽孢桿菌YB1和YB2的抑菌能力相似，確定菌株ZF559和ZF757為目標菌株。

圖2 9株菌對枯草芽孢桿菌的抑菌效果Fig.2 Antibacterial effect of 9 strains on Bacillus subtilis

2.5 目標菌株鑒定

對菌株ZF559進行16S rDNA測序鑒定，序列如下：

CTTCCGTTAATTGATTATGACGTGCTTGCACTGA ATGAGATTTTAACACGAAGTGAGTGGCGGACGGGTG AGTAACACGTGGGTAACCTGCCCAGAAGCAGGGGA TAACACCTGGAAACAGATGCTAATACCGTATAACAG AGAAAACCGCCTGGTTTTCTTTTAAAAGATGGCTCT GCTATCACTTCTGGATGGACCCGCGGCGCATTAGCT AGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGATGATG CGTAGCCGACCTGAGAGGGTAATCGGCCACATTGGG ACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGC AGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGCAAGTCTGATG GAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCT CGTAAAGCTCTGTTGTTAAAGAAGAACGTGGGTGAG AGTAACTGTTCACCCAGTGACGGTATTTAACCAGAA AGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAAT ACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGATTTATTGGGCG TAAAGCGAGCGCAGGCGGTCTTTTAAGTCTAATGTG AAAGCCTTCGGCTCAACCGAAGAAGTGCATTGGAAA CTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAAC TCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAA GAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTAA CTGACGCTGAGGCTCGAAAGCATGGGTAGCGAACA GGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGAT GATTACTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTG CTGCAGCTAACGCATTAAGTAATCCGCCTGGGGAGT ACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAAGAATTGACGG GGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTC GAAGCTACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATC TTCTGCCAACCTAAGAGATTAGGCGTTCCCTTCGGG GACAGAATGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCT CGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAG CGCAACCCTTATTACTAGTTGCCAGCATTCAGTTGG GCACTCTAGTGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGG AAGGTGGGGACGACGTCAAATCATCATGCCCCTTAT GACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACA ACGAGTCGCGAAACCGCGAGGTTTAGCTAATCTCTT AAAACCATTCTCAGTTCGGACTGTAGGCTGCAACTC GCCTACACGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGAT CAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTA CACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTTGTAACACC

對菌株ZF757進行16S rDNA測序鑒定，序列如下：

ATGCAGTCGAACGCAATCTTTTAACAATGAGTG CTTGCACTCAGCGTTTTAAGTGCGAGTGGCGAACGG GTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCGAAAGTGGG GGATAACACTTGGAAACAGGTGCTAATACCGCATCA ACCGACTGACCGCCTGGTCGGTCGGGCAAAGACGG CGTCAGCTGTCGCTTTTGGATGAGCCCGCGGCGTAT TAACTAGTTGGTAAGGTAACGGCTTACCAAGGTGAT GATACGTAGCCGAACTGAGAGGTTGATCGGCCACAT TGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGG CAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGCAAGTCT GATGGAGCAACGCCGCGTGTATGAAGAAGGTCTTCG GATCGTAAAATACTGTTGTCAGAGAAGAACACGGGA TAAAGTAACTATTGTTCCGCTGACGGTATCTGACCA GCAAGTCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGG TAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTG GGCGTAAAGGGAACGCAGGCGGTCTTTTAAGTCTGA TGTGAAAGCCTTCGGCTTAACCGGAGAAGTGCATTG GAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTG GAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAT GGAAGAACACCAGTGGCGAAAGCGGCTCTCTGGTCT GTAACTGACGCTGAGGTTCGAAAGCGTGGGGAGCG AACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAA CGATGAATGCTAGGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTC GGTGCCGCAGTTAACGCACTAAGCATTCCGCCTGGG GAGTACGATCGCAAGATTGAAACTCAAAGGAATTG ACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTT AATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTG ACATCTTTTGACCATCTGAGAGATCAGAATTTCCCTT CGGGGACAAAATGACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTC AGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCACAA CGAGCGCAACCCTTATTGTCAGTTGCCAGCATTGAG TTGGGCACTCTGGCGAGACTGCCGGTGACAAACCGG AGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGCCCC TTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACGA TACAACGAGTCGCGAGACCGCGAGGTTTAGCTAATC TCTGAAAGTCGTTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCA ACTCGCCTACATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGC GGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCT TGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTTGTAA CACCCAAAGCCGGTGCGGTAACCATTTGGAGCCAGC CGTCTAAGGTGGGACAGATGA

對鑒定序列進行比對發現，菌株ZF559與乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）的同源性為99.9%，菌株ZF757與破布子乳酸桿菌（Lactobacillus tatum）的同源性為99.9%。衛生部刊發的《可用于食品的菌種名單（衛辦監督發〔2010〕65號）》中明確規定乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）為可用于食品的微生物，而破布子乳桿菌未列入其中。說明菌株ZF559作為一株安全且可穩定提升豆醬風味的乳酸菌，可以用于實際豆醬制作。而菌株ZF757則缺乏明確的允許使用依據，不能用于實際生產。因此，選擇菌株ZF559進行豆醬應用試驗。

2.6 菌種應用驗證

將菌株YB1、ZF559在含10%食鹽的培養基中擴培后添加至豆醬體系中，發酵后指標變化見表2。

表2 豆醬中添加菌株YB1及ZF559的應用效果Table 2 Application effect of adding strain YB1 and ZF559 in soybean paste

由表2可知，通過在豆醬體系中添加0.1%乳酸菌ZF559至豆醬體系中，其總酸從1.42 g/100 g降低至1.31 g/100 g，下降了7.7%；氨基酸態氮從1.45 g/100 g上升至1.80 g/100 g，提升了24%；枯草芽孢桿菌數量從2.2×104CFU/g下降至1.2×103CFU/g，降低了94.54倍。特別是當豆醬體系中有枯草芽孢桿菌時，引入同等數量級乳酸菌ZF559后，可以將總酸從2.55 g/100 g的降低至1.35 g/100 g，下降了47%，氨基酸態氮從0.51 g/100 g上升至1.76 g/100 g，提升245%。同時這種趨勢也表現在乳酸菌數和中性蛋白酶上，枯草芽孢桿菌會造成乳酸菌數量和中性蛋白酶活力下降。這說明枯草芽孢桿菌可以通過使豆醬中的酶活力下降，造成氨基酸態氮下降，同時會造成品質的劣化。通過在豆醬中引入乳酸菌ZF559后，可以抑制枯草芽孢菌的生長，提升豆醬中的氨基酸態氮，降低總酸，同時通過抑制有害微生物的生長，避免不良氣味、口感的產生，使豆醬的整體風味從3.8分上升至4.3分，提升13%。

3 結論

從豆醬發酵體系中篩選得到菌株ZF559，通過16S rDNA測序鑒定其是一株乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）。該菌在10%以上的鹽分以及35℃的環境中可以快速生長。該耐鹽的乳酸片球菌加入豆醬發酵體系后，可以抑制枯草芽孢桿菌等微生物的生長，使米曲霉的生長及產酶能力更強。使豆醬總酸降低7.7%，氨基酸態氮提升24%，使枯草芽孢桿菌（B.subtilis）的數量降低94.54%，顯著增強豆醬的風味。