醬香型窖醅中產酯細菌的分離及鑒定

劉苑皓，趙興秀*，舒 梨，何義國，徐元文，張 磊

（四川輕化工大學 生物工程學院，四川 宜賓 644000）

白酒中98%是乙醇和水，2%是一些微量物質，而白酒的獨特風味主要來源于這些微量物質[1]。在白酒微量物質中，含量最多且對白酒影響最大的就是酯類，酯類是組成白酒香味的主要物質，主要的酯類有四種，分別是己酸乙酯、乳酸乙酯、乙酸乙酯、丁酸乙酯[2]。醬香型白酒中酯類化合物成分種類很多，乙酸乙酯和乳酸乙酯在醬香型白酒中含量均很高，它們是形成白酒香味的重要物質，其中醬香型酒代表茅臺酒中乙酸乙酯和乳酸乙酯的比率為1∶1左右[3-5]。國標GB/T 26760—2011《醬香型白酒國家標準》[6]中規定優級酒總酯含量（以乙酸乙酯計）≥2.2 g/L，一級酒總酯含量（以乙酸乙酯計）≥2.0 g/L。

目前，對中國白酒釀造大曲產酯菌種的研究主要集中在酵母菌和霉菌[7-10]，而對細菌的研究報道目前還比較少，因此，加強對產酯細菌的研究顯得很有必要。本研究旨在從醬香型窯醅中篩選出產酯能力較強的菌株，并從形態觀察、生理生化試驗和16S rRNA分子生物學等方面鑒定該菌種，并運用頂空固相微萃取技術（headspace solid phase microextraction technology，HS-SPME）和氣質聯用（gas chromatography massspectrometry，GC-MS）對分離菌株的產酯能力及代謝產物進行測定，為后期進一步的研究和白酒中的應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

醬香型白酒窖醅樣品：四川郎酒股份有限公司；麩皮：四川省自貢市某飼料加工廠。

1.1.2 化學試劑

葡萄糖（分析純）、蛋白胨、牛肉膏、瓊脂（均為生化試劑）：北京奧博星生物技術有限責任公司；其他試劑均為分析純。

1.1.3 培養基

篩選培養基[11]：蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，NaCl 5 g，瓊脂20 g，三丁酸甘油酯4 mL，蒸餾水1 L，pH 7.4～7.6。

基本培養基：蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，NaCl5 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 L，pH 7.4～7.6。

發酵培養基：蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，NaCl 5 g，蒸餾水1 L，pH 7.4～7.6。

麩皮固體培養基：麩皮700 g，花生米粉300 g，蒸餾水1 L。以上培養基滅菌條件為121℃、15 min。

1.2 儀器與設備

6890N-5975B氣質聯用儀：安捷倫科技（中國）有限公司；TG-16離心機：四川蜀科儀器有限公司；SHP-80生化培養箱：常州普天儀器制造有限公司金壇市晶玻實驗儀器廠；SW-CJ-IF凈化工作臺：蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司；V-1000可見分光光度計：翱藝儀器（上海）有限公司。SKY-2102C恒溫培養振蕩器：上海蘇坤實業有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 產酯菌株的篩選

（1）產酯菌株的初篩：將醬香型窖醅研磨成粉，稱取25 g于裝有225 mL無菌生理鹽水的三角瓶中，振蕩30 min得到菌懸液。取菌懸液，按10倍梯度稀釋到10-7，取各稀釋度菌懸液0.2 mL均勻涂布于篩選培養基上，置于37℃恒溫培養箱中培養24 h。產酯細菌產生的一種酯酶能夠分解或者合成甘油三酯的酯類，并且在適當的條件下還可以合成其他酯類[12-14]。若篩選培養基上出現透明圈則表明該菌種能產酯酶，并利用了三丁酸甘油酯，將具有明顯透明圈的菌落挑出，并純化至由單菌落，再于4℃冰箱斜面保存。

（2）產酯菌株的復篩：將初篩獲得的菌種活化，重復透明圈實驗，使用游標卡尺測定透明圈直徑（D）和菌落直徑（d），并計算出透明圈直徑和菌落直徑的比值（D/d），D/d值越大分解或者合成酯類的能力越強[11]，篩選出D/d值較大的菌株進行后續試驗。

（3）產酯優良菌株的選擇：將復篩獲得的菌種活化后，制作成菌濃度為106CFU/mL種子液，并以5%的接種量接種于液體發酵培養基中，在37℃、150 r/min搖床培養24 h。用指示劑法[15-16]測定復篩菌種的產酯量，最后選擇1株產酯量最高的菌株作進一步研究。

1.3.2 產酯優良菌株的鑒定

（1）形態觀察及生理生化試驗：將篩選出的一株產酯優良菌株在基本培養基上進行劃線分離純化，37℃培養24 h，對單菌落進行革蘭氏染色[17]，觀察其顯微鏡下個體形態，并通過各項生理生化試驗[18-19]，包括芽孢染色試驗、淀粉水解試驗、蛋白水解試驗和接觸酶試驗。

（2）分子生物學鑒定：提取篩選菌株的脫氧核糖核酸（deoxyribonucleoside，DNA）基因組，通過聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增技術獲取目的基因DNA片段，并測序，PCR擴增條件：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸1 min，35次循環；最后72℃延伸10 min。從Genebank中選擇同源性親近的幾株菌株的16S rDNA基因序列，采用Clustalx 1.83軟件進行序列多重比較，用Mega 5.0軟件進行統計和聚類分析，構建系統發育樹，并對所構建的系統發育樹進行評估[20-21]。

1.3.3 產酯香氣物質的測定

將產酯優良菌株接種于麩皮固體培養基，37℃發酵4 d，采用頂空固相微萃取-氣質聯用（HS-SPME-GC-MS）技術對其產生的香氣物質進行分析。

（1）頂空固相微萃取條件：50/30μmDVB/CAR/PDMS固相微萃取，為了使固定相更好的附在柱子的內壁上，第一次使用時需于氣相色譜進樣口230℃老化2 h，高溫可以去除一些雜質和溶劑，看到氣相上的基線平穩后就可以進行下一步操作。稱取5 g發酵產物，水10 mL于15 mL頂空瓶中，為了減少被分析物（有機物）在水溶液中的可溶性，使更多的揮發性物質揮發至溶液的頂空，吸附到纖維頭上，在頂空瓶中加入1.5 g NaCl，混勻后置于60℃水浴頂空吸附30 min，解吸3 min，用于GC-MS分析。

（2）氣相色譜條件：DB-WAX毛細管色譜柱（60 m×250μm，0.25μm），手動無分流進樣，進樣口溫度250℃，程序升溫：初始溫度40℃，保留1 min，以3℃/min的速率升至180℃，再以2.5℃/min的速率升至230℃，保留10 min，汽化室溫度250 ℃，載氣氦氣（He），流速2.5 mL/min[22-23]。

質譜條件：電子電離（electronic ionization，EI）源，電子能量70 eV，掃描范圍10～500 m/z，離子源溫度250℃，接口溫度230℃。

（3）定性定量方法

定性：化合物經計算機檢索，同時與美國國家標準技術研究所（national institute of standards and technology，NIST）和Wiley 6.0相匹配。本研究只報道匹配度和純度＞850的鑒定結果。

定量：按照峰面積歸一化計算相對百分含量。

1.3.4 數據處理

實驗操作重復3次，每個樣品設3個平行，采用Origin 8.5和SPSS 20.0軟件進行數據分析，測定結果以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 產酯菌株的初篩

通過篩選培養基，從醬香型窖醅中分離出7株（編號為1#、2#、3#、4#、5#、6#、7#）具有明顯透明圈的菌株，其結果見圖1。由圖1可知，7株菌的菌落形態及透明圈大小各有差異。

圖1 篩選菌株的菌落形態及透明圈Fig.1 Colony morphology and transparent zone of screened strains

2.2 產酯菌株的復篩

將初篩過程篩選出的7株菌株再次進行透明圈試驗，結果見表1。由表1可知，1#、2#、5#、7#菌株D/d值較大，在2.0～6.0之間。因此，選擇1#、2#、5#、7#菌株作進一步試驗。

表1 篩選菌株的透明圈直徑與菌落直徑比值Table 1 Diameter ratio of transparent zone to colony of screened strains

2.3 產酯優良菌株的選擇

對復篩挑選出來的4株菌株進行產酯發酵實驗，結果見表2。由表2可知，2#菌株的產酯能力最強，達到了1.837 g/L。因此，選擇2#菌株作為優良菌株進行下一步鑒定試驗，并將其編號為LH2。

表2 菌株發酵液的總酯含量Table 2 Total ester content in fermentation broth of strain

2.4 菌株LH2的鑒定

2.4.1 形態觀察

菌株LH2在基本培養基上37℃培養12 h，平板具有明顯單菌落后進行形態觀察，結果見圖2。由圖2可知，菌株LH2菌落為圓形，邊緣整齊，菌落白色，濕潤狀。對細菌進行革蘭染色，顯微鏡下觀察結果為菌體呈紫色，桿狀，兩端鈍圓，單個或少量鏈狀存在，有芽孢，芽孢端生或中生，為革蘭陽性菌。

圖2 菌株LH2的菌落形態（A）和細胞形態（B）Fig.2 Colony morphology(A)and cell morphology(B)of strain LH2

2.4.2 生理生化試驗

對菌株LH2進行芽孢染色、淀粉水解試驗、蛋白水解實驗和接觸酶試驗，結果見表3。由表3可知，菌株LH2產蛋白酶、淀粉酶，產芽孢，可初步判斷為革蘭氏陽性芽孢桿菌。

表3 菌株LH2的生理生化試驗結果Table 3 Results of physiological and biochemical tests of strain LH2

2.4.3 分子生物學鑒定

將菌株LH2的16SrDNA序列輸入美國國立生物技術信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）進行對比，利用MEGA6軟件構建系統發育樹，結果見圖3。由圖3可知，菌株LH2與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）的親緣關系相近，相似度達到了99%，結合形態觀察和生理生化試驗特征將菌株LH2鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。

圖3 基于16S rRNA菌株LH2的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain LH2 based on 16S rRNA sequences

2.5 菌株LH2生長曲線和產酯曲線

為了確定菌株LH2最佳培養時間和產酯時間。將菌株LH2接種于發酵培養基，37℃持續培養，每隔2 h，測定發酵液OD600nm值和總酯含量。菌株LH2生長曲線和產酯曲線結果見圖4。由圖4可知，菌株LH2培養4 h后進入對數期，在34 h左右達到穩定期，在36 h左右總酯含量最高，達到2.2 g/L，繼續發酵，OD600nm值和產酯量都趨于平穩，變化不大。因此，菌株LH2的最佳培養時間為36 h，此時其產酯量達到最大。

圖4 菌株LH2的生長曲線及產酯曲線Fig.4 Growth curve and ester-producing curve of strain LH2

2.6 菌株LH2發酵產物香氣成分分析

將菌株LH2接種于麩皮固體培養基，37℃發酵4 d后，采用HS-SPME-GC-MS檢測其發酵產物中的香氣成分，其GC-MS分析總離子流色譜圖見圖5，各香氣成分相對含量檢測結果見表4。

圖5 菌株LH2發酵產物香氣成分GC-MS分析總離子流色譜圖Fig.5 Total ion chromatogram of aroma components in fermentation products of strain LH2 analyzed by GC-MS

由圖5和表4可知，菌株LH2發酵產物中共鑒定出21種香氣成分，主要是酯類、酸類、吡嗪類和醇類，其中酯類的含量占18.692%。在酯類中主要的酯為乳酸乙酯，其含量為18.808%；酸類物質占2.755%，主要為苯甲酸，含量為0.066%；醇類主要為甲基乙酰甲醇，含量為12.948%。結果表明，菌株LH2具有較強的產酯能力，與此同時，吡嗪類物質的含量也比較多，占總揮發性物質含量的9.709%，特別是對人體非常有益的四甲基吡嗪占比達到7.371%。

表4 菌株LH2發酵產物香氣成分GC-MS檢測結果Table 4 Determination results of aroma components in fermentation products of strain LH2 analyzed by GC-MS

3 結論

利用透明圈法從醬香型窖醅中分離得到產酯最高的菌株LH2，其透明圈直徑與菌落直徑之比（D/d）為6.0。通過形態觀察、生理生化試驗和16S rDNA等方法鑒定菌株LH2為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。參考國標GB/T26760—2011《醬香型白酒國家標準》優級酒總酯含量（以乙酸乙酯計）為2.2 g/L；一級酒總酯含量（以乙酸乙酯計）為2.0 g/L，篩選出的菌株LH2產酯總量為2.2 g/L，雖然發酵條件和發酵環境與醬香型白酒差別很大，但從酯含量來說，該菌株具有較高的產酯能力。

運用頂空固相微萃取氣質聯用（HS-SPME-GC-MS）技術對菌株LH2發酵產物的香氣物質進行分析，共鑒定出21種香氣成分，主要是酯類（18.692%）、酸類（2.755%）、吡嗪類（9.709%）和醇類（12.948%），并在產酯能力較強的同時也產生四甲基吡嗪等有益身體健康的物質增加了菌株LH2在健康白酒方向進一步研究的價值。