紅茶菌在谷物原料發酵制醋中的應用

徐清萍，金 鑫，郭苗苗，縱 偉，趙光遠

（1.鄭州輕工業大學 食品與生物工程學院，河南 鄭州 450001；2.食品生產與安全河南省協同創新中心，河南 鄭州 450001）

食醋發酵包括固態發酵、液態發酵，通常經過糖化、酒精發酵、醋酸發酵、陳釀等幾個環節[1]。固態發酵醋以糧食為原料，除醋酸外，含有較高的氨基酸態氮、不揮發酸，產品風味較好，但發酵周期長、產生較多的固態廢渣。液態發酵醋的主要成分為醋酸，氨基酸態氮、不揮發酸含量等都遠低于固態發酵醋，尤其是以酒精為原料發酵的液態醋。提高液態發酵醋中不揮發酸、氨基酸態氮等含量將有利于液態發酵醋風味的改良[2-3]。目前，改良液態醋風味主要從使用多菌種發酵和添加蛋白類原料方面進行。高耐受性醋酸菌的選育及應用對提高酒精轉酸率有著積極意義[4-5]，但無助于食醋風味的改進。

無論采用何種工藝，食醋發酵用菌主要有酵母菌、醋酸菌等。對山西陳醋、鎮江香醋等傳統釀造工藝食醋來說，乳酸菌也是影響其風味的主要菌種之一[6-7]。根據對食醋發酵過程中優勢菌群的相關研究，山西老陳醋酒精發酵過程中，釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）（96%）為優勢酵母菌株，發酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、布氏乳桿菌（Lactobacillus buchneri）、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）等為優勢細菌，醋酸發酵階段巴氏醋桿菌（Acetobacter pasteurianus）為優勢醋酸菌[8]；鎮江香醋醋醅中主體微生物為醋酸菌、乳酸菌和酵母菌，三者占細菌和真菌總和的80%以上[9]；四川麩醋中的優勢種包括乳酸桿菌（Lactobacillus）、醋酸桿菌（Acetobacter）、木霉菌（Trichoderma）等[10]。通常采用的液態發酵醋工藝都是直接接種純種的酵母菌、醋酸菌進行發酵[11-12]。固態醋與液態醋相比，菌種具有多樣性。紅茶菌主要由醋酸菌、酵母菌組成，有些還含有少量乳酸菌[13-14]。從紅茶菌中分離鑒定的微生物包括釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）、醋化醋桿菌木質亞種（Acetobacter xylinum）、液化醋桿菌（A.liquefaciens）、乳桿菌（Lactobacillus sp.）等[15-16]。高通量測序結果表明，紅茶菌中原核生物的主要組成為醋酸菌，比例達到89.11%，真核生物的主要組成為酵母菌，比例為93.48%[17]。各種紅茶菌發酵所用的菌種組成各不相同，但總體來說菌群豐富，發酵產物成分多樣化。從菌群構成來說，紅茶菌和傳統食醋釀造菌群中都大量存在著能轉化產生酒精的酵母菌，和產生酸的醋酸菌，及一定量的乳酸菌。以紅茶菌為發酵菌種來發酵谷物類原料，可能對液態醋的風味具有改良作用。

采用紅茶菌發酵可以產生醋酸、乳酸、檸檬酸、蘋果酸等有機酸[18-19]，隨著發酵時間延長，紅茶菌可以逐步將原料中的糖轉化為酸。利用紅茶菌發酵谷物類原料，將獲得以酸為主，組成復雜、風味良好的發酵產品。關于紅茶菌的研究范圍涵蓋了菌種組成、益生功效、紅茶菌細菌纖維素的應用等多個方面[13-15，20-21]。傳統上，紅茶菌主要用于發酵茶糖水，以葡萄糖、蔗糖等為碳源。近年來紅茶菌利用其他底物進行發酵的研究增多，包括以綠茶、荷葉、蘆薈、葛根、牛奶等多種原料為底物，大多以其發酵飲料，同時測試各項理化指標，將其用于發酵非飲料食品的工藝研究較少[22]。本研究將紅茶菌應用于谷物發酵制醋，探討利用紅茶菌發酵制醋的可行性。紅茶菌應用于糧食類原料發酵，須將原料中淀粉轉化為葡萄糖等。通過利用液化酶、糖化酶將谷物（玉米粉、豆粕、米糠粕）原料中的淀粉轉化，利用中性蛋白酶、酸性蛋白酶對蛋白的水解性以期提高谷物醋中氨基酸態氮含量，利用紅茶菌發酵產酸。通過改變原料配比、α-淀粉酶、糖化酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶的使用量等研究其對紅茶菌發酵谷物醋成品中總酸、不揮發酸、氨基酸態氮等含量的影響，探討不同酶制劑對紅茶菌發酵谷物原料制醋的影響，以期獲得較好品質的紅茶菌醋。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米粉、豆粕、米糠粕：市售；紅茶菌：本實驗室保藏，主要組成為醋酸菌、酵母菌及極少量乳酸菌；糖化酶（50 000 U/g）、α-淀粉酶（50 000 U/g）、酸性蛋白酶（50 000 U/g）、中性蛋白酶（50 000 U/g）：河北格貝達生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

SHP-250智能生化培養箱：上海鴻都電子科技有限公司；LX-C35L滅菌鍋：合肥華泰醫療設備有限公司；SW-CJ-2FD潔凈工作臺：蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司；ME203E分析天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 谷物醋加工工藝流程及操作要點

操作要點：

紅茶菌種子液的制備：紅茶5 g/L，蔗糖60 g/L，煮沸制備茶糖水，冷卻后，接入5%紅茶菌，發酵4 d，制備紅茶菌種子液用于接種。

原料處理：將玉米粉（玉米糝粉碎后過100目篩）、豆粕、米糠粕混勻，與水按料液比1∶5（g∶mL）混合，拌勻。

液化：將制備好的料液中，加入0.1%～0.4%α-淀粉酶，加熱至65℃，并在65℃保溫液化30 min。

糖化發酵：采用邊糖化邊發酵的工藝。待液化后的料液降至室溫后，依次加入0.1%～0.4%糖化酶、0.1%～0.4%酸性蛋白酶、0～1%的中性蛋白酶，接種紅茶菌5%，30℃發酵2 d后補加0.2%酸性蛋白酶，繼續發酵至總酸不再明顯變化，共發酵14 d。

過濾、滅菌：將紅茶菌發酵制備的谷物醋過濾，在80～90℃條件滅菌20 min后獲得紅茶菌發酵谷物醋成品。

1.3.2 不同原料比例對谷物醋發酵的影響

將玉米粉（100目）、豆粕、米糠粕分別按質量比70∶25∶5、50∶45∶5、30∶65∶5混合。按照料水比1∶5（g∶mL）加入蒸餾水，混勻，加入0.3%的α-淀粉酶65℃保溫液化30 min；降至室溫后加入0.3%糖化酶、0.3%酸性蛋白酶，接種5%的紅茶菌發酵，30℃發酵14 d，考察不同原料比例對谷物醋發酵的影響。測定可溶性固形物（發酵7 d取樣）、氨基酸態氮含量（發酵12 d取樣）、總酸含量（發酵14 d取樣）。

1.3.3 不同酶制劑添加對谷物醋發酵的影響

將原料按玉米粉∶豆粕∶米糠粕=50∶45∶5的質量比混合，按照1.3.1制備谷物醋，考察α-淀粉酶、糖化酶對淀粉的水解情況及蛋白酶對原料的水解，測定12 h、24 h、48 h時的可溶性固形物含量；分別于7 d、14 d時測定總酸（以乙酸計）含量、氨基酸態氮含量及不揮發性酸含量等指標。采用正交試驗考察不同酶制劑比例對谷物醋發酵的影響，正交試驗因素與水平見表1。

表1 酶制劑比例優化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for enzyme preparation ratio optimization

1.3.4 分析檢測

可溶性固形物含量采用糖度計測定；總酸含量參照GB/T 5009.41—2003《食醋衛生標準中的分析方法》中方法測定[23]；氨基酸態氮含量參照GB 5009.235—2016《食品安全國家標準食品中氨基酸態氮的測定方法》中方法測定[24]。

2 結果與分析

2.1 不同原料比例對谷物醋發酵的影響

不同的原料比例對谷物醋發酵的影響結果見表2。

表2 不同原料比例對谷物醋發酵的影響Table 2 Effect of different raw materials ratio on grain vinegar fermentation

由表2可知，發酵7 d后不同原料比例發酵液中可溶性固形物含量均＞5%，其中玉米粉∶豆粕∶米糠粕質量比為50∶45∶5時，總酸最高，為43.86 g/L。紅茶菌發酵產酸主要與淀粉的利用有關，從原料比例對產酸的影響分析，蛋白含量過高，會降低總酸得率，而蛋白含量在一定范圍能促進產酸。對比不同原料比例發酵時發酵液中的氨基酸態氮含量，其中玉米粉∶豆粕∶米糠粕質量比為70∶25∶5時，氨基酸態氮含量最高，為0.32 g/L；其次為玉米粉∶豆粕∶米糠粕質量比為50∶45∶5時，氨基酸態氮含量為0.32 g/L，兩者的氨基酸態氮含量相差不大。隨著豆粕比例增加，原料中蛋白含量也相應增加，但發酵液中氨基酸態氮含量并沒有明顯增加，而氨基酸態氮含量與原料蛋白的水解及利用有關，說明酸性蛋白酶雖然對蛋白有一定水解能力，但對豆粕、米糠粕這類原料的蛋白水解能力有限；另一方面說明紅茶菌對蛋白的利用轉化有限。此外，隨發酵時間延長，酸度增加，酸性蛋白酶活性有減少的可能。對比不同原料比例發酵時發酵液中的可溶性固形物含量，在原料淀粉含量較高時可溶性固形物含量較高，表明淀粉的水解及進一步發酵對發酵液中可溶性固形物含量的影響更大。液態發酵醋與固態發酵醋的主要區別之一就是其中氨基酸態氮含量極低。為改善紅茶菌發酵谷物醋的效果，可以采用二次加入酸性蛋白酶，及在初始原料發酵（pH近中性）中添加中性蛋白酶的方式，進一步探討蛋白酶對紅茶菌發酵的影響。

2.2 不同酶制劑比例對谷物醋發酵的影響

2.2.1 不同酶制劑比例對可溶性固形物含量的影響

不同酶制劑比例對可溶性固形物含量的影響結果如表3所示。

由表3可知，16組水解液中可溶性固形物的含量均在液化糖化24 h時達到最高，其中最高的為第16組，達到5.38%，此后隨時間延長，到達48 h時可溶性固形物含量不再明顯改變，且與24 h時含量相比，略有下降。發酵液中的可溶性固形物含量主要與水解或發酵后產生的可溶性成分有關。發酵初期，原料中的淀粉逐漸水解為可溶性糊精、低聚糖、葡萄糖等；蛋白水解產生多肽、氨基酸等。以24 h的可溶性固形物含量為評價指標進行極差分析，其中α-淀粉酶0.4%、糖化酶0.4%、酸性蛋白酶0.3%、中性蛋白酶1.00%時，發酵液中可溶性固形物含量最高。從極差來看，對可溶性固形物含量影響從大到小依次為中性蛋白酶＞α-淀粉酶＞酸性蛋白酶＞糖化酶。表明在0～24 h，主要是α-淀粉酶液化及中性蛋白酶的水解起主要作用，初始pH近中性，有利于中性蛋白酶的水解，部分蛋白分解為可溶性小肽或氨基酸；α-淀粉酶對淀粉的液化作用也增加了可溶性固形物的含量。

表3 以可溶性固形物含量為評價指標優化酶制劑比例正交試驗結果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal experiments for enzyme ratio optimization using soluble solids content as evaluation index

以24 h的可溶性固形物含量為評價指標，進行正交試驗結果方差分析，結果如表4所示。由表4可知，中性蛋白酶對可溶性固形物含量有顯著性影響（P＜0.05），其他因素對結果無顯著影響（P＞0.05）。

表4 以發酵24 h可溶性固形物含量為評價指標的正交試驗結果方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal experiments results using soluble solids content after fermentation 24 h as evaluation index

2.2.2 酶制劑比例對總酸含量的影響

谷物醋發酵到7 d、14 d時進行總酸（以乙酸計）含量的測定，考察不同酶制劑比例對發酵14 d時總酸含量的影響，結果見表5。

表5 以總酸含量作為評價指標優化酶制劑比例正交試驗結果與分析Table 5 Results and analysis of orthogonal experiments for enzyme ratio optimization using total acid content as evaluation index

由表5可知，隨著發酵時間的延長，發酵液總酸在逐漸升高。將發酵14 d的總酸含量正交試驗結果進行極差分析，其中α-淀粉酶0.4%、糖化酶0.3%、酸性蛋白酶0.1%、中性蛋白酶1.00%時總酸含量最大。從極差來看，對總酸含量影響從大到小依次為糖化酶＞α-淀粉酶＞中性蛋白酶＞酸性蛋白酶。從酸的轉化來說，酸性產物主要與可發酵性糖的含量有關，α-淀粉酶主要將淀粉原料液化為糊精等低聚糖，而糖化酶則將糊精、低聚糖等進一步轉化為可發酵的葡萄糖。糖化酶水解產生的葡萄糖含量越高，則產酸越多。

以發酵14 d時總酸含量為評價指標，進行正交試驗結果方差分析，結果如表6所示。由表6可知，糖化酶對谷物醋成品總酸含量的具有影響顯著性（P＜0.05），其他因素對結果無顯著影響（P＞0.05）。

表6 以發酵14 d總酸含量為評價指標的正交試驗結果方差分析Table 6 Variance analysis of orthogonal experiments results using total acid content after fermentation 14 d as evaluation index

2.2.3 酶制劑比例對不揮發酸含量的影響

分別于發酵到7 d、14 d時進行不揮發酸含量的測定，考察不同酶制劑比例對發酵14 d時不揮發酸含量的影響，結果見表7。

表7 以不揮發酸作為評價指標優化酶制劑比例正交試驗結果與分析Table 7 Results and analysis of orthogonal experiments for enzyme ratio optimization using non-volatile acid content as evaluation index

由表7可知，隨著發酵時間的延長，發酵液中不揮發酸含量在逐漸升高。將發酵14 d的不揮發酸含量正交試驗結果進行極差分析，其中淀粉酶0.4%、糖化酶0.3%、酸性蛋白酶0.1%、中性蛋白酶1.00%時影響最大，從極差來看，對不揮發酸含量影響從大到小依次為酸性蛋白酶＞中性蛋白酶＞糖化酶＞α-淀粉酶。不揮發酸的產生受多方面的影響，主要由乳酸菌等發酵產生，從極差值的大小分析，各種酶制劑濃度變化時極差值變化不大，說明酶制劑濃度變化對不揮發酸含量影響較小。

以發酵14 d時不揮發酸含量為評價指標，進行正交試驗結果方差分析如表8所示。由表8可知，各種酶制劑的添加對發酵谷物醋成品中不揮發酸含量的影響均不顯著（P＞0.05）。不揮發酸主要為乳酸、檸檬酸等有機酸，采用紅茶菌發酵后，發酵成品中酸主要以揮發性酸為主。不揮發酸含量的高低一定程度上決定了食醋的風味。當不揮發酸含量高時，食醋會有濃郁的香氣，酸度口感柔和；如果其含量較低，食醋就會有刺鼻的氣味，口感刺激酸澀。GB 18187—2000《釀造食醋》[25]中規定了固態發酵食醋中不揮發酸含量（以乳酸計g/L）≥5 g/L，而對液態發酵食醋不做規定。采用紅茶菌發酵谷物醋，發酵工藝簡單，其中發酵14 d后各組谷物醋中不揮發酸含量能達到5.6 g/L以上。通過進一步調整發酵菌種，接入紅茶菌的同時，接入乳酸菌，提高乳酸菌在菌群中的比例，有望進一步提高不揮發酸含量。

表8 以發酵14 d不揮發酸含量作為評價指標正交試驗結果方差分析Table 8 Variance analysis of orthogonal experiments results using non-volatile acid content after fermentation 14 d as evaluation index

2.2.4 酶制劑比例對氨基酸態氮含量的影響

分別于發酵到7 d、14 d時進行發酵液中氨基酸態氮含量的測定，考察不同酶制劑比例對14 d時紅茶菌發酵谷物醋中氨基酸態氮含量的影響，進行正交試驗直觀分析，結果見表9。

由表9可知，隨著發酵時間的延長，發酵液氨基酸態氮含量在逐漸升高。將發酵14 d的氨基酸態氮含量正交試驗結果進行極差分析，其中淀粉酶0.1%、糖化酶0.1%、酸性蛋白酶0.3%、中性蛋白酶1.00%時影響最大。從極差來看，影響氨基酸態氮含量從大到小依次為中性蛋白酶＞酸性蛋白酶＞α-淀粉酶＞糖化酶。蛋白酶主要對蛋白起水解作用，從而會直接影響到氨基酸態氮含量，其中中性蛋白酶作用要大于酸性蛋白酶，主要分析有兩方面原因，初始發酵階段pH近中性，適合中性蛋白酶作用，其次中性蛋白酶的添加比例比較高，最高1%，從而增加了原料中蛋白的水解比例。從另一方面說明，選擇適合于原料水解的蛋白酶將有利于提高氨基酸態氮含量。與表2中只添加一次酸性蛋白酶的方式比（酸性蛋白酶0.3%，氨基酸態氮含量為0.32 g/L），表9中各組試驗方案采用了在發酵過程中兩次添加酸性蛋白酶的方式，氨基酸態氮含量有了明顯的提高，如表9中試驗1僅添加了兩次酸性蛋白酶（第一次0.1%，第二次0.2%），氨基酸態氮含量達到0.67 g/L，遠高于一次添加法，表明采用二次添加酸性蛋白酶法能有效提高紅茶菌谷物醋中氨基酸態氮含量。而表9試驗7發酵后氨基酸態氮含量最高，達到0.76 g/L，其工藝中添加了兩次酸性蛋白酶（第一次0.3%，第二次0.2%），且添加中性蛋白酶1.00%，表明提高酸性蛋白酶添加量和添加中性蛋白酶有利于提高氨基酸態氮含量。

表9 以氨基酸態氮含量為評價指標優化酶制劑比例正交試驗結果與分析Table 9 Results and analysis of orthogonal experiments for enzyme ratio optimization using amino acid nitrogen content as evaluation index

以發酵14 d時氨基酸態氮含量為評價指標，進行正交試驗結果方差分析，結果見表10。由表10可知，中性蛋白酶對氨基酸態氮含量影響為顯著性差異（P＜0.05），其他因素對結果無顯著影響（P＞0.05）。利用中性蛋白酶處理原料及在發酵過程中加入酸性蛋白酶可以提高原料中蛋白質的利用率。從蛋白質的轉化情況看，蛋白質的轉化還不是特別理想，后期可通過進一步選用高活性蛋白酶，專一性水解谷物、豆粕、米糠粕等原料中的蛋白質的蛋白酶，來進一步提高產品中的氨基酸態氮含量。

表10 以發酵14 d氨基酸態氮含量作為評價指標正交試驗結果方差分析Table 10 Variance analysis of orthogonal experiments results using amino acid nitrogen content after fermentation 14 d as evaluation index

綜合考慮不同酶制劑添加對可溶性固形物含量、總酸、不揮發酸、氨基酸態氮含量的影響，并以總酸、氨基酸態氮含量作為主要考察指標。確定糖化酶添加量為0.3%，α-淀粉酶添加量為0.4%，中性蛋白酶添加量為1.00%，酸性蛋白酶0.3%（第一次添加量）。在此最佳條件下接種5%紅茶菌發酵，制的谷物醋總酸含量為47.90 g/L，不揮發酸含量為6.62 g/L，氨基酸態氮含量為0.72 g/L。

3 結論

與采用自然接種的傳統工藝及采用先接種酵母進行酒精發酵、再接種醋酸菌進行醋酸發酵工藝相比，采用紅茶菌發酵制醋，工藝簡單，結合酶解技術，直接接種發酵14 d，可達到所需酸度。采用接種5%紅茶菌發酵法，各種酶在發酵初期的最佳添加量：α-淀粉酶0.4%、糖化酶0.3%、中性蛋白酶1.00%、酸性蛋白酶0.3%（第一次添加量）。在此最佳酶制劑添加條件下，紅茶菌發酵制得的谷物醋總酸含量為47.90 g/L，不揮發酸含量為6.62 g/L，氨基酸態氮含量為0.72 g/L。說明紅茶菌在谷物原料發酵制醋中的應用是可行的。

從原料比例來說，適當提高蛋白原料的比例有利于提高谷物醋中氨基酸態氮含量，但蛋白原料過高，會導致氨基酸態氮含量沒有明顯增加而發酵獲得谷物醋酸度也降低。從兼顧產酸及氨基酸態氮含量方面分析，適當增加原料比例中蛋白含量即可，選擇能專一有效分解原料蛋白的蛋白酶將是一個更適宜的途徑。總之，可以通過增加乳酸菌接種量，調整紅茶菌群乳酸菌數及進一步選用高活性、專一性蛋白水解酶來提高成品中不揮發酸、氨基酸態氮含量，進而起到進一步改善指標及風味的目的。