響應面試驗優化黃豆醬工藝條件及其色澤質構分析

高雅文，劉學軍*，修 琳，2，李鴻梅

（1.吉林農業大學 食品科學與工程學院，吉林 長春 130118；2.小麥和玉米深加工國家工程實驗室，吉林 長春 130118）

黃豆醬也稱為大豆醬，是利用面粉、黃豆、米曲霉和酵母等經過發酵而成的具有中國特色的傳統調味品[1-3]。黃豆醬具有獨特的色、香、味和體態，咸甜適口，營養豐富，經常用于烹制各種菜肴或蘸食，深受人們喜愛[4-5]。黃豆醬中還原糖的主要來源是淀粉原料的降解，還原糖的含量在某種程度上反映黃豆醬在發酵過程中淀粉質原料降解的情況和微生物的生長狀態。還原糖還參加發酵中后期的生物化學反應，如美拉德反應。其進程與黃豆醬的色澤和風味物質的形成有重要關系，是衡量黃豆醬品質的重要指標[6-8]。另外黃豆醬中還含有豐富的氨基酸，其含量多少是評價黃豆醬質量及營養價值高低的重要指標之一，能很好的反映黃豆醬發酵的成熟度，進而對其發酵時間的確定有借鑒意義[9-10]。

黃豆醬的色澤和質構是黃豆醬的重要感官指標，直接影響消費者對產品質量優劣的判斷。色澤的形成主要來自于褐變反應，黃豆醬發酵過程中淀粉和蛋白質經酶降解后的產物葡萄糖、肽、氨基酸是褐變反應的主要底物，經酶促或非酶促反應形成黑色素，最終形成黃豆醬誘人的金黃色。體態主要由蛋白質、多肽、糊精、多糖等物質共同作用形成，適度的硬度和黏著性能增強產品的適口性和咀嚼感[11-13]。

目前，對黃豆醬發酵過程中微生物的動態變化、酶系的形成及活性、風味物質及理化指標的研究較多，武俊瑞等[14-15]研究了自然發酵黃豆醬中的微生物的多樣性及動態變化；高秀芝等[16-17]測定了不同發酵階段豆醬樣品的營養及理化指標；喬鑫等[18-19]對黃豆醬中揮發性成分進行分析鑒定，而對黃豆醬色澤及質地評價的研究較少。本試驗以121℃條件下蒸煮黃豆時間、濕豆與面粉質量比和發酵溫度為影響因素，黃豆醬中還原糖含量和氨基酸態氮含量為響應值，通過Box-Behnken試驗設計建立數學模型，進行響應面分析，優化黃豆醬制備工藝條件，并對不同工藝條件下得到的黃豆醬進行色澤和質構測定與分析，了解黃豆醬發酵過程中的色澤及質地變化規律，為進一步探究黃豆醬發酵機理提供試驗數據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃豆（非轉基因）、小麥粉（中筋粉）、食鹽、綿白糖：市售。魯氏酵母（Zygosaccharomyces rouxii）（菌數108個/mL）、米曲霉（Aspergills oryzae）（活性孢子數200億/g，出芽率90%）、黑曲霉（Aspergillus niger）（活性孢子數200億/g，出芽率90%）：山東沂源康源生物科技有限公司。

3,5-二硝基水楊酸（dinitrosalicylic acid，DNS）、氫氧化鈉、酚酞（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；甲醛、乙醇（均為分析純）：天津市富宇精細化工有限公司。

1.2 儀器與設備

LX-B150立式自動電熱壓力蒸汽滅菌鍋：合肥華泰醫療設備有限公司；BSA224S電子天平：賽多利斯科儀器（北京）有限公司；SPX-250Ⅲ培養箱：上海司樂儀器有限公司；CX2064色差儀：德國Hunter Lab公司；TA.XT.plus物性測試儀：英國Stable Micro System公司。

1.3 方法

1.3.1 黃豆醬制作工藝流程

1.3.2 黃豆醬制作操作要點

黃豆清洗、揀選：選取籽粒完整，顆粒飽滿，無蟲蝕、無霉變，新鮮優質非轉基因黃豆，加水淘洗清理去雜。

浸泡、沖洗：加黃豆2.5倍水常溫浸泡10 h，豆粒飽滿，無硬芯，掰開豆瓣有極少量凹面即可，加水沖洗干凈。

蒸煮、冷卻：將浸泡沖洗好的黃豆121℃蒸煮一定時間，并冷卻至室溫。

混合面粉：添加熟面粉（將生面粉放入蒸鍋，常壓、水沸騰后15 min蒸至手感疏松，有麥香氣，握有彈性，不散花，不結塊）。黃豆和面粉降至室溫，將濕豆與面粉按試驗設計質量比混合。

接菌、制曲：將混合好的物料裝到燒杯內，接入米曲霉（占豆面混合物料0.06%）和黑曲霉（占豆面混合物料0.06%），置于培養箱中，24 h之內制曲溫度控制在34～36℃，24～48 h控制在28℃，期間每隔12 h翻曲一次，制曲48 h。

加鹽水：將鹽（占豆面混合物料12%）溶解于煮沸后冷卻到室溫的水（占豆面混合物料60%）中，過濾后加入到制好的醬曲中。

發酵：將加鹽水的醬曲放入培養箱中發酵，控制一定溫度，在第6天加入酵母（占豆面混合物料0.06%）和白砂糖（占豆面混合物料20%），發酵40 d，得黃豆醬成品。

1.3.3 分析檢測

（1）還原糖含量測定[20]

取研磨后的黃豆醬試樣0.5 g裝入離心管，加入10 mL蒸餾水，放入50℃水浴鍋水浴20 min，取出冷卻，在4 000 r/min條件下離心，取出上清液定容至50 mL后取1mL溶液，加入2 mL DNS，沸水浴2 min，冷卻后加入蒸餾水補足15 mL，放入分光光度計于波長540 nm條件下，測定其OD540nm值并記錄數據，還原糖含量計算公式如下：

（2）氨基酸態氮含量的測定[21]

依據GB 5009.235—2016《食品安全國家標準食品中氨基酸態氮的測定》酸度計法進行氨基酸態氮含量的測定。

（3）黃豆醬色澤的測定[22]

采用色差儀測定黃豆醬的色澤。儀器校準后，取適量待檢測的黃豆醬試樣于器皿內，底部鋪滿，置于色差儀測色指定位置，蓋上保護蓋進行色澤測定。在測定后旋轉樣品90°后繼續測定，再分別旋轉180°、270°測定，并將每次測定的L*值（表示明暗度）、a*值（表示紅綠色）、b*值（表示黃藍色）進行記錄，取3次數據的平均值。

（4）黃豆醬質構的測定[23]

采用TA.XT.Plus食品物性儀測定黃豆醬的質構。準備好待測試樣，選擇P/2.5探頭，測定參數：測前速度：1 mm/s，測中速度：5 mm/s，測后速度：5 mm/s，觸發力：5 g，目標值：10 mm。探頭運動軌跡：探頭從起始位置開始，先以1 mm/s的速度壓向待測樣品，接觸到樣品表面后以5 mm/s的速度壓縮樣品10 mm，而后返回到壓縮的觸發點，停留5 s后重復上述軌跡，而后探頭以5 mm/s的速度返回到測試前的位置。每一個樣品測定3次，并記錄硬度、黏著性、咀嚼性的數值，取3次數據的平均值。

1.3.4 黃豆醬制作工藝條件優化單因素試驗

黃豆蒸煮時間的確定：將浸泡沖洗好的黃豆121℃分別蒸煮5 min、8 min、11 min、14 min、17 min，蒸煮熟的濕黃豆與蒸熟的面粉質量比為10∶3，發酵溫度為35℃，考察黃豆蒸煮時間對黃豆醬品質的影響。

濕黃豆與蒸熟的面粉質量比的確定：將蒸煮熟的濕黃豆與蒸熟的面粉分別按質量比10∶1、10∶2、10∶3、10∶4、10∶5混合，固定浸泡沖洗好的黃豆121℃蒸煮14 min，發酵溫度為35℃，考察豆面比對黃豆醬品質的影響。

發酵溫度的確定：發酵溫度分別為25℃、30℃、35℃、40℃、45℃，固定浸泡沖洗好的黃豆121℃蒸煮14 min，蒸煮熟的濕黃豆與蒸熟的面粉質量比為10∶3，考察發酵溫度對黃豆醬品質的影響。

1.3.5 黃豆醬制作工藝條件優化響應面試驗

在單因素試驗基礎上，根據Box-Behnken試驗設計原理，以蒸煮時間（A）、豆面質量比（B）和發酵溫度（C）為自變量，還原糖含量（Y1）和氨基酸態氮含量（Y2）為響應值進行響應面試驗，同時測定最優組合樣品的顏色（L*值、a*值、b*值）和質構（硬度、黏著性、咀嚼性）。

表1 Box-Behnken試驗設計因素與水平Table1 Factors and levels of Box-Behnken experimental design

1.3.6 數據處理

試驗數據的處理及圖表繪制使用Microsoft Excel 2010和Design-Expert 8.0.6。

2 結果與分析

2.1 黃豆醬制作工藝條件優化單因素試驗

2.1.1 不同蒸煮時間對黃豆醬品質的影響

在濕豆與面粉質量比10∶3，發酵40 d，發酵溫度35℃條件下，對121℃黃豆蒸煮時間分別為5 min、8 min、11 min、14 min、17 min的黃豆醬進行L*值，a*值，b*值的測定，結果見表2；對黃豆醬進行硬度、黏著性、咀嚼性的測定，結果見圖1；測定黃豆醬還原糖含量和氨基酸態氮含量，結果見圖2。

表2 121℃條件下不同蒸煮時間對黃豆醬色澤的影響Table 2 Effect of different cooking time at 121℃on color of soybean paste

由表2可知，隨著蒸煮時間的延長，L*值是先下降，14 min時值最小（43.37），后又略上升（44.32），即亮度逐漸減弱，后趨于平穩；a*值逐漸增大（由7.44升至10.72），即紅色度增加，b*值逐漸減小（由33.79降至27.31），即黃色度逐漸減小。大豆蒸煮時主要是蛋白質受熱變性，對豆醬中肽分子質量分布也會有影響；蒸煮時間要適宜，時間過短，大豆蛋白變性程度低，時間過長蛋白質變性過度，會有不溶性蛋白質產生，均不利于酶促或非酶促反應的發生，產生的色素少，致使顏色不理想。總體比較，121℃黃豆蒸煮14 min時，黃豆醬色澤鮮亮，呈金黃色。

圖1 21℃條件下不同蒸煮時間對黃豆醬質構的影響Fig.1 Effect of different cooking time at 121℃on the texture of soybean paste

圖2 21℃條件下不同蒸煮時間對黃豆醬還原糖和氨基酸態氮含量的影響Fig.2 Effect of different cooking time at 121℃on the reducing sugar and amino acid nitrogen contents in soybean paste

由圖1可知，隨著蒸煮時間的延長，黃豆醬的硬度明顯下降，14 min時最小（51.84 g）后又上升；咀嚼性逐漸下降，黏著性先升后降，14 min時有最大值（39.33）。蒸煮時間適宜，蛋白質變性程度適中，有利于微生物對其產生發酵作用，得到適宜的硬度、黏著性和咀嚼性。蒸煮時間過短或過長，蛋白質變性程度低或過度變性，均不利于發酵作用的進行，影響了黃豆醬的硬度、黏著性和咀嚼性。從黃豆醬質構分析來看，蒸煮時間14 min較為理想。

由圖2可知，隨著黃豆蒸煮時間的延長，黃豆醬中的還原糖含量和氨基酸態氮含量均是先升高后降低，黃豆蒸煮時間14 min時，黃豆醬中還原糖含量（10.80%）和氨基酸態氮含量（0.72 g/100 g）均最高。當蒸煮時間為14 min時，黃豆熟化程度最佳，蛋白質適度變性，微生物和酶生長繁殖最旺盛，活力最強，因此，還原糖和氨基酸態氮含量均最高。蒸煮時間過短、過長，黃豆蒸煮程度不夠或過度，均不能滿足微生物和酶生長繁殖所需要的營養條件，導致還原糖含量和氨基酸態氮含量均低。從還原糖含量和氨基酸態氮含量分析來看，蒸煮時間14 min較為理想。

綜合考慮，選擇蒸煮時間為11 min、14 min、17 min進行響應面試驗。

2.1.2 不同濕豆與面粉質量比對黃豆醬品質的影響

在121℃蒸煮時間14 min，發酵溫度35℃，發酵時間40 d條件下，考察濕豆與面粉質量比（10∶1、10∶2、10∶3、10∶4、10∶5）對黃豆醬品質的影響，測定黃豆醬L*值，a*值，b*值，結果見表3；測定黃豆醬的硬度、黏著性、咀嚼性，結果見圖3；測定黃豆醬中氨基酸態氮含量和還原糖含量，結果見圖4。

表3 不同濕豆與面粉質量比對黃豆醬色澤的影響Table 3 Effect of different mass ratio of wet soybean to flour on the color of soybean paste

圖3 不同濕豆與面粉質量比對黃豆醬質構的影響Fig.3 Effect of different mass ratio of wet soybean to flour on the texture of soybean paste

圖4 不同濕豆與面粉質量比對黃豆醬還原糖和氨基酸態氮含量的影響Fig.4 Effect of different mass ratio of wet soybean to flour on the reducing sugar and amino acid nitrogen contents in soybean paste

由表3可知，隨著濕豆與面粉質量比越來越小，L*值（由46.81降至36.69）與b*值（由35.83降至22.86）逐漸減小，a*值逐漸增大（由9.00升至13.94）。隨著面粉比例的增大，淀粉水解產物增多，先水解為糊精、麥芽糖，最終生成了葡萄糖。葡萄糖經酵母菌、乳酸菌發酵后生成低分子的醇、乳酸等，促進非酶褐變——焦糖化反應和美拉德反應的進行，生成色素，導致顏色加深。從黃豆醬顏色分析來看，豆面質量比10∶3為宜。

由圖3可知，隨面粉比例的增大，硬度（由59.11 g降至43.41 g）與咀嚼性（由48.43降至26.43）逐漸減小，即越來越軟；黏著性先增加后降低，在濕豆與面粉質量比10∶3時最大（39.33）。黏著性反映豆醬對流動的阻力情況，咀嚼性是硬度、彈性與粘聚性的乘積[24]。面粉中含有大量的淀粉和少量的糊精、蔗糖和葡萄糖，還含有一定量的蛋白質，為微生物生長提供了碳源。面粉的增多，使淀粉酶分解產物糊精，低聚糖等物質增多，在鹽水體系中使黃豆醬的黏著性增加，硬度下降，咀嚼性下降。從黃豆醬質構分析來看，豆面質量比10∶3為宜。

由圖4可知，不同的濕豆和面粉比例下，黃豆醬發酵過程中的還原糖含量、氨基酸態氮含量均是先增加后減少，濕豆與面粉質量比為10∶3時，還原糖含量（10.80%）、氨基酸態氮含量（0.72 g/100 g）均明顯高于其他比例。面粉是提供淀粉質的主要原料，濕豆和面粉質量比為10∶3時，碳氮比均衡，有利于微生物生長，分泌較多的淀粉酶、糖化酶和蛋白酶、多肽酶等，有利于淀粉、蛋白的降解，產生較多的還原糖和氨基酸。面粉含量較多或較少，均不能滿足黃豆醬中微生物的生長需求，還原糖含量和氨基酸態氮含量較少。從還原糖含量和氨基酸態氮含量分析來看，濕豆與面粉質量比10∶3為宜。

綜合考慮，選擇濕豆與面粉質量比10∶2、10∶3、10∶4進行響應面試驗。

2.1.3 不同發酵溫度對黃豆醬品質的影響

在121℃黃豆蒸煮時間14 min，濕豆與面粉質量比為10∶3，發酵時間40 d條件下，發酵溫度分別為25℃、30℃、35℃、40℃、45℃制作黃豆醬，進行L*值、a*值、b*值的測定，結果見表4；測定硬度、黏著性、咀嚼性，結果見圖5；測定還原糖含量、氨基酸態氮含量，結果見圖6。

表4 不同發酵溫度對黃豆醬色澤的影響Table 4 Effect of different fermentation temperature on the color of soybean paste

圖5 不同發酵溫度對黃豆醬質構的影響Fig.5 Effect of different fermentation temperature on the texture of soybean paste

圖6 不同發酵溫度對黃豆醬還原糖和氨基酸態氮含量的影響Fig.6 Effect of different fermentation temperature on the reducing sugar and amino acid nitrogen contents in soybean paste

由表4可知，隨著發酵溫度的不斷升高，L*值在減小（由56.32降至31.56），a*值逐漸增大（由7.63升至13.62），b*值逐漸減小（由36.69降至21.08），黃豆醬由前期的乳黃色到中期的黃色，最終出現紅褐色。隨發酵溫度升高，焦糖化反應和酶促反應增多，致使黃豆醬顏色逐漸加深。從黃豆醬顏色分析來看，發酵溫度為35℃較為理想。

由圖5可知，隨著發酵溫度的升高，硬度（由63.96 g降至40.33 g）與咀嚼性（由44.75降至27.58）下降，黏著性先升高后降低，在40℃時出現最大值（47.04）。提高發酵溫度，微生物活性增強，發酵更充分，有助于蛋白酶分解原料中的蛋白質成為多肽、氨基酸等，淀粉酶降解淀粉為多糖、低聚糖、單糖等，因此，硬度與咀嚼性逐漸下降。但后期溫度超過35℃，醬中水分會流失較快，故而黏著性后期會降低。從黃豆醬質構分析來看，發酵溫度35℃為宜。

由圖6可知，黃豆醬中的還原糖含量隨發酵溫度升高先增加后減少，在35℃含量達最大（10.80%）；氨基酸態氮含量先增加后趨于平穩，在35℃含量達最大（0.72 g/100 g）。發酵溫度35℃時，發酵過程中淀粉酶、糖化酶、蛋白酶和多肽酶等酶的活性高，所以，還原糖含量和氨基酸態氮的含量高。氨基酸態氮是由黃豆醬體系中蛋白酶水解蛋白質而產生的，氨基酸態氮本身就是重要的呈味物質，它與黃豆醬的獨特風味有著密不可分的關系，在黃豆醬的發酵過程中氨基酸態氮含量越高，越有利于黃豆醬風味物質的形成[25-26]。從還原糖含量和氨基酸態氮含量分析來看，發酵溫度35℃為宜。

綜合以上考慮，選擇發酵溫度30℃、35℃、40℃進行響應面試驗。

2.2 黃豆醬制作工藝條件優化響應面試驗結果

2.2.1 響應面試驗結果及分析

固定發酵時間為40 d，選擇蒸煮時間（A）、濕豆與面粉質量比（B）及發酵溫度（C）為自變量，還原糖含量（Y1）和氨基酸態氮含量（Y2）為響應值進行響應面試驗，利用軟件Design-Expert8.0.6中的Box-Behnken設計試驗，設計與結果見表5，方差分析分別見表6和表7。

表5 Box-Behnken試驗設計及結果Table 5 Design and results of Box-Behnken experiments

表6 以還原糖含量為響應值的回歸模型方差分析Table 6 Variance analysis of regression model using reducing sugar content as response value

續表

表7 以氨基酸態氮含量為響應值的回歸模型方差分析Table7 Variance analysis of regression model using amino acid nitrogen content as response value

利用軟件對表5試驗數據進行回歸分析，擬合后得回歸方程：

由表6可知，還原糖含量評價模型中，模型極顯著（P＜0.01），失擬項（P失擬=0.580 3＞0.05）不顯著，因而無失擬因素存在，模型的決定系數R2=0.999 6，校正決定系數R2Adj=0.999 1，一次項A、B，交互項AB、AC、BC及二次項A2、B2、C2對結果影響極顯著（P＜0.01），一次項C影響顯著（P＜0.05）；由表7可知，氨基酸態氮含量評價模型中，模型極顯著（P＜0.01），失擬項（P失擬=0.965 6＞0.05）不顯著，因而無失擬因素存在。模型的決定系數R2=0.994 3，校正決定系數R2Adj=0.986 9，一次項A、C、二次項A2、B2影響極顯著（P＜0.01），一次項B、交互項AB、BC及二次項C2對結果影響顯著（P＜0.05），說明回歸方程可以很好地描述各因素與響應值之間的真實關系，試驗結果與數學模型擬合程度良好，試驗誤差小，預測值與實測值之間有較好的相關性[27]，可用該模型來分析和預測黃豆醬生產的最佳工藝條件。

2.2.2 各因素間交互作用的影響

借助Design-Expert軟件獲得的響應面及等高線見圖7。

圖7 各因素交互作用對黃豆醬還原糖及氨基酸態氮含量影響的響應面及等高線Fig.7 Response surface plots and contour line of effects of interaction between each factors on reducing sugar and amino acid nitrogen contents in soybean paste

由圖7可知，121℃黃豆蒸煮時間（A）、濕豆與面粉質量比（B）和發酵溫度（C）3個因素之間的交互作用對黃豆醬還原糖含量、氨基酸態氮含量的影響是顯著的，從曲面的變化趨勢看，對黃豆醬中還原糖含量影響依次為：蒸煮時間＞濕豆與面粉質量比＞發酵溫度，即A＞B＞C；對黃豆醬中氨基酸態氮含量影響依次為：蒸煮時間＞發酵溫度＞濕豆與面粉質量比，即A＞C＞B，與方差分析結果相同。由此可見，各具體試驗因素對響應值的影響不是簡單的線性關系。

由軟件Design-Expert 8.0.6分析方程，得到最佳工藝條件為：蒸煮時間15.58 min，濕豆與面粉質量比為10∶3，發酵溫度35.57℃，此條件下還原糖含量理論值為11.166 3%，氨基酸態氮含量理論值為0.772 3 g/100 g。

2.2.3 驗證試驗

為了便于實際操作，將最佳工藝條件修正為：蒸煮時間16 min，濕豆與面粉質量比為10∶3，發酵溫度36℃。在此最佳工藝條件下，進行3組驗證試驗，還原糖含量實際值為10.96%，與預測理論值相對誤差為1.91%，氨基酸態氮含量實際值為0.76 g/100 g與預測理論值相對誤差為2.18%，表明采用響應面法優化黃豆醬發酵工藝條件是可行的。

2.3 質量指標

感官指標：色澤均勻，有光澤，呈黃褐色，組織狀態良好，質地細膩，黏稠適度，軟硬適當，具有很好的咀嚼感。

理化指標：氨基酸態氮含量為0.76 g/100 g，符合GB/T 24399—2009《黃豆醬》中要求。

微生物指標：大腸菌群≤30 MPN/100 g，符合GB 2718—2014《食品安全國家標準釀造醬》中要求；致病菌未檢出，符合GB 29921—2013《食品安全國家標準食品中致病菌限量》中要求。

3 結論

通過單因素及響應面試驗優化黃豆醬發酵工藝條件為：121℃黃豆蒸煮時間16 min，濕豆與面粉質量比為10∶3，發酵溫度36 ℃，L*值39.07±1.16，a*值11.67±0.95，b*值26.01±1.19，硬度（48.58±0.94）g，黏著性43.17±0.77，咀嚼性35.80±0.87。此條件下，黃豆醬色澤均勻，有光澤，呈黃褐色，組織狀態良好，質地細膩，黏稠適度，軟硬適當，具有很好的咀嚼感。氨基酸態氮含量為0.76 g/100 g，大腸菌群≤30 MPN/100 g，致病菌未檢出，符合相關食品國家標準的要求。