枸杞果酒低溫發酵工藝優化及揮發性風味物質分析

董賽君，趙廷彬，李天瑜，牛思思，余君偉，喬長晟，，，*

（1.天津科技大學 生物工程學院，天津 300457；2.天津慧智百川生物工程有限公司，天津300457；3.杞源堂（天津）生物工程有限公司，天津 300457；4.杞源堂（寧夏）生物科技有限公司，寧夏 銀川 750021）

枸杞（Lycium chinense Mill.）屬茄科（Solanaceae）枸杞屬（Lycium）落葉灌木[1]。全世界的枸杞約有80多種，多數種分布在南、北美洲；在我國大部分地區均有種植，其中以寧夏中寧枸杞最為出名，是枸杞中的精品。現代科學測試分析和臨床試驗證明，枸杞富含枸杞多糖、多種氨基酸、類胡蘿卜素、維生素及礦物質，具有提高免疫力，抗癌，抗疲勞、輻射，耐缺氧，降血糖、血壓、血脂，延緩衰老，治療艾滋病和養顏美容等多種特效功能[2-3]。

果酒因酒精度低、健康聞名，被年輕人群所喜愛。近年來，已有研究者對適宜釀酒的水果（如蘋果、香蕉、芒果等）進行了果酒釀造研究[1]。以枸杞為原料釀造的果酒，酒精度低，酒質柔和爽口，果香味濃，營養價值高，基本保持了枸杞的天然營養成分，并且富含人體所需的各種氨基酸，多種維生素及礦物質，是酒品中具有很大發展潛力的酒種[4]。

低溫發酵可以延長發酵的時間，更能充分提取枸杞中的各類功能性因子和營養成分，還可以最大程度的保留枸杞清香典雅的果香，使其不被高溫破壞，并且使各種雜菌對枸杞果酒可能帶來的干擾和影響降至最低[5]。與枸杞本身相比，枸杞果酒不僅保留了原果實中特有的營養成分，且具有濃郁的枸杞香、酒香，味道酸甜可口，酒精度低，是滋補保健良品[6]。目前，關于枸杞果酒的研究多集中于營養成分變化[7-10]和生產工藝方面[11-13]。倪志婧等[14]探究了寧夏枸杞果酒最佳釀造工藝條件，生產的果酒果香濃郁，營養豐富。而有關枸杞果酒風味方面的研究報道較少。

本試驗以寧夏枸杞汁為原料，以感官評價為考察指標，利用單因素試驗與正交試驗優化枸杞果酒的發酵工藝，同時采用頂空固相微萃取-氣質聯用技術（headspace-solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometer，HS-SPME-GC-MS）對枸杞果酒中揮發性風味物質進行定性定量分析，以期為枸杞果酒的實際生產與應用提供科學的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枸杞汁：寧夏杞源堂生物有限公司；釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）：中國普通微生物菌種保藏管理中心（China general microbiological culture collection center，CGMCC），菌株編號CGMCC 16558；白砂糖（食品級）：北京糖泰宗科技有限公司；氫氧化鈉、鹽酸、氯化鈉、無水乙醇（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

YXQ-LS-75SⅡ型滅菌鍋：上海東亞壓力容器制造有限公司；UVmini-1240型紫外可見分光光度計：日本島津公司；TGL-16B高速離心機：上海安亭科學儀器廠；頂空固相微萃取裝置（SPME手柄、50/30μm DVB/CAR/PDMS萃取頭）：美國Supelco公司；Agilent 7890A/5975CGC-MS聯用儀、Agilent HP-5色譜柱（60 m×0.25 mm×0.5μm）：美國安捷倫公司；IT-09A恒溫磁力加熱攪拌器：上海一恒科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 枸杞果酒工藝流程及操作要點

操作要點：從斜面上挑取一環釀酒酵母接種到酵母培養基中，200 r/min、28℃恒溫培養至OD600nm值為0.8～1.0；添加白砂糖、檸檬酸調節枸杞汁糖度、pH至一定值，煮沸滅菌20 min；將活化的菌種以一定量接入已冷卻的枸杞汁中；靜置于18℃培養箱中恒溫發酵一段時間，收集發酵液，5 000 r/min離心10 min；分裝，巴氏殺菌，4℃保藏。

1.3.2 枸杞果酒發酵工藝優化單因素試驗

（1）初始pH值對枸杞果酒品質的影響

將枸杞汁初始糖度調至12%，分別調節初始pH值為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0，酵母添加量為0.5%，將其置于18 ℃恒溫培養箱中培養發酵7 d，發酵結束后，5 000 r/min離心10 min，取上清液，巴氏殺菌，進行感官評定。

（2）糖度對枸杞果酒品質的影響

將枸杞汁初始pH值調至5.0，分別調節初始糖度為8%、10%、12%、14%、16%，酵母添加量為0.5%，將其置于18℃恒溫培養箱中培養發酵7 d，發酵結束后，5 000 r/min離心10 min，取上清液，巴氏殺菌，進行感官評定。

（3）發酵時間對枸杞果酒品質的影響

將枸杞汁初始糖度調至12%，初始pH值調至5.0，酵母添加量0.5%，將其置于18℃恒溫培養箱中分別培養發酵5 d、6 d、7 d、8 d、9 d，發酵結束后，5 000 r/min離心10 min，取上清液，巴氏殺菌，進行感官評定。

（4）酵母接種量對枸杞果酒品質的影響

將枸杞汁初始糖度調至12%，初始pH值調至5，酵母接種量分別為0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%，將其置于18℃恒溫培養箱中培養發酵7 d，發酵結束后，5 000 r/min離心10 min，取上清液，巴氏殺菌，進行感官評定。

1.3.3 枸杞果酒發酵工藝優化正交試驗

在單因素試驗的基礎上，分別選擇初始pH值（A）、酵母添加量（B）、發酵時間（C）、初始糖度（D）為評價因素，每個因素選擇3個水平，以感官評價為考察指標，選用L9（34）正交試驗設計來優化枸杞果酒發酵工藝條件，正交試驗因素與水平見表1。

表1 枸杞果酒發酵工藝優化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for gojifruit wine fermentation conditions optimization

1.3.4 測定方法

（1）質量指標

酒精度、總糖、總酸、干浸出物：參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[15]；可溶性固形物：采用手持折光儀測定。

細菌菌落總數：參照GB 4789.2—2016《食品微生物學檢驗菌落總數測定》[16]；大腸菌群數：參照GB 4789.3—2016《食品微生物學檢驗大腸菌群測定》[17]；致病菌檢測：參照GB 29921—2013《食品中致病菌限量測定》[18]。

（2）感官評價[19]

挑選9名（4女5男）在枸杞果酒行業從業5年及以上的專業人員作為評定人員，年齡在30～40歲。試驗在寧夏杞源堂生物工程有限公司的標準品酒室完成。品評杯具為透明郁金香酒杯，樣品隨機放置。品評者分別從色澤、香氣、口感及狀態方面對樣品打分，滿分100分。具體感官評價標準見表2。

表2 枸杞果酒感官評分標準Table 2 Sensory evaluation standards of gojifruit wine

（3）枸杞果酒中揮發性化合物分析[20]

樣品制備及分析：取5 mL樣品置于20 mL螺口頂空樣品瓶，加1 g氯化鈉，放入磁性轉子，樣品在恒溫磁力攪拌器中40℃平衡30 min，將萃取頭插入瓶內頂空吸附30 min。萃取后將萃取頭插入GC-MS系統進樣口，250℃解吸8 min，同時進行數據采集。

氣相色譜條件：色譜柱為AgilentCP-Wax（60 m×0.25mm×0.5μm）；進樣口溫度為250℃，不分流；載氣為氦氣（He），流速1 mL/min；升溫程序為起始50℃維持1 min，按照3℃/min的速度升至220℃維持5 min。

質譜條件：電離方式為電子電離（electron ionization，EI）源，電子能量70 eV，掃描范圍 20～450 m/z；離子源溫度230℃；四級桿溫度150℃。

揮發性物質分析：化合物經計算機檢索，與美國國家標準與技術研究院（national institute of standards and technology，NIST）譜庫相匹配，并分析可能屬于枸杞果酒的風味物質，取匹配度≥80%的組分；同時采用峰面積歸一化法計算各揮發性風味物質的相對百分含量。

2 結果與分析

2.1 枸杞果酒發酵條件優化

2.1.1 初始pH值對枸杞果酒品質的影響

圖1 初始pH值對枸杞果酒的影響Fig.1 Effect of initial p H on gojifruit wine

由圖1可知，不同初始pH值的枸杞汁發酵出的枸杞果酒感官評價差異較大，枸杞果酒的感官評分隨初始pH值的增大呈先增大后減小的趨勢；初始pH值過高或過低都不利于釀酒酵母的生長繁殖以及發酵，發酵效果不佳，以至于感官評價分值低，初始pH值為5.0時枸杞果酒的感官評價值為93分，酒體呈紅色調，澄清透明，有濃郁的酒香和果香，酸甜可口。因此，選擇初始pH值為5.0進行后續試驗。

2.1.2 初始糖度對枸杞果酒品質的影響

圖2 初始糖度對枸杞果酒的影響Fig.2 Effect of initial sugar content on gojifruit wine

由圖2可知，枸杞果酒的感官評分隨初始糖度的增大呈先增大后減小的趨勢；可能是酵母菌生長繁殖消耗部分糖，進而糖度較低發酵得到的酒精度較低，感官評價分值較低，而糖度較高會影響釀酒酵母的生長繁殖，糖利用不完全導致口感較差；在初始糖度為14%時，枸杞果酒感官評分最高為93分，酒體呈金黃色，澄清透明，有濃郁的酯香，酸甜較可口。因此，選擇初始糖度為14%進行后續試驗。

2.1.3 發酵時間對枸杞果酒品質的影響

由圖3可知，枸杞果酒的感官評分隨著發酵時間的延長呈先增大后減小的趨勢；發酵7 d和8 d條件下枸杞果酒感官評價分值較高，發酵第5 d和第6 d分值相對較低，故判斷發酵成熟階段可能在7～8 d；第9 d感官評價分值降低可能是由于發酵體系中營養物質減少，酵母菌進入衰減階段，菌體沉降死亡，酒體中溶入菌體內容物而影響感官評價值。發酵7 d時枸杞果酒感官評價分值均為91分，酒體呈琥珀色，澄清透亮，酯香濃郁，帶有醇香。因此，選擇發酵時間為7 d進行后續試驗。

圖3 發酵時間對枸杞果酒的影響Fig.3 Effect of fermentation time on gojifruit wine

2.1.4 酵母接種量對枸杞果酒品質的影響

由圖4可知，枸杞果酒的感官評分隨酵母接種量的增大呈先增大后減小的趨勢；釀酒酵母接種量太高或太低均不利于枸杞果酒的發酵；接種量為0.1%時枸杞果酒感官評價分值最低，可能由于酵母菌接種量少，發酵能力差，產生酒精較少，感官評價分值較低，而接種量為0.9%時枸杞果酒感官評價分值也偏低，可能是酵母菌生長繁殖消耗大量糖，在酒精發酵階段糖的不足導致發酵效果不佳，從而影響感官評價分值；酵母菌接種量為0.5%時枸杞果酒感官評分最高為92分，酒體呈紅色調，澄清透明，有濃郁果香和酯香，口味微甜，酸度適合。因此，選擇酵母接種量為0.5%進行后續試驗。

圖4 酵母接種量對枸杞果酒的影響Fig.4 Effect of yeast inoculum on gojifruit wine

2.2 枸杞果酒發酵工藝條件優化正交試驗分析

枸杞果酒發酵工藝條件優化正交試驗結果與分析見表3。由表3可知，發酵的最大影響因素是初始糖度（D），其次依次是初始pH值（A）和發酵時間（C），酵母添加量（B）影響最小。最佳發酵工藝組合為A3B3C3D3，即初始pH值為6.0，初始糖度為16%，發酵時間為8 d，酵母接種量為0.7%。在此條件下，枸杞果酒的感官評分為96分。

表3 枸杞果酒發酵工藝條件優化正交試驗結果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal test for fermentation conditions optimization of gojifruit wine

2.3 枸杞果酒中揮發性化合物分析

枸杞果酒中的揮發性物質與枸杞汁本身及酵母發酵產生的代謝物有關。酵母菌不同接種量和糖度及接種時間的差異都會導致代謝物的差異。所檢測到的質譜數據經過NIST標準譜庫檢索后，獲得樣品揮發性化合物的種類及相對含量，結果見表4。

續表

由表4可知，對枸杞果酒的香氣成分進行了定性分析，共鑒定出40種香氣成分，其中酯類物質12種（40.59%），醇類物質5種（30.50%），酸類物質10種（17.80%），醛酮類物質7種（3.60%）；相對含量較高的為醇類和酯類，共占總揮發性成分的71.09%。相對含量較高的香氣成分為異戊醇（23.60%）、辛酸乙酯（16.53%）、辛酸（9.84%）、苯乙醇（6.05%）、癸酸乙酯（7.04%）、2-苯乙基酯（5.90%）、癸酸（4.31%）[21-22]。

2.4 枸杞果酒質量指標

2.4.1 理化指標

表5 枸杞果酒理化指標Table 5 Physical and chemical indicators of gojifruit wine

由表5可知，枸杞果酒理化指標符合國標GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》。

2.4.2 微生物指標

枸杞果酒細菌總數≤50 CFU/mL；大腸菌群＜3 MPN/100 mL；致病菌：未檢出。

3 結論

本研究通過單因素和正交試驗，確定了最佳枸杞果酒發酵條件為酵母添加量0.7%，初始糖度16%，初始pH值6.0，18℃條件下靜置發酵8 d，在此優化條件下，枸杞果酒的感官評分為96分，酒精度為6.28%vol，殘糖量為8.33 g/L；此時酒體呈金黃色，帶有紅色調，有淡淡的枸杞果香，酸甜可口，經檢測分析，產品符合GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》。同時通過HS-SPME-GC-MS技術分析枸杞果酒中揮發性風味物質，枸杞果酒中相對含量較高的為醇類和酯類，共占總揮發性成分的71.09%，在發酵過程中醇類和酯類對枸杞果酒的香味有一定的積極作用。