鎖擲酵母粉對糖尿病小鼠肝、腎的保護作用

劉澤鑫，劉 暢，錢 和

（1.呂梁學(xué)院 生命科學(xué)系，山西 呂梁 033000；2.江南大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122；3.江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

糖尿病是由高血糖引起的代謝疾病，當機體長期暴露于高血糖環(huán)境中，會導(dǎo)致各種組織（如眼、腎、肝、血管等）受到慢性氧化損傷而導(dǎo)致其功能障礙[1]。由于肝臟是調(diào)節(jié)糖代謝的重要器官，糖尿病更易加快肝臟損傷，并且絕大多數(shù)的Ⅱ型糖尿病患者通常伴有脂肪肝癥狀[2-3]。所以，保肝護肝對于糖尿病患者的治療也相當重要。糖尿病腎病是由糖尿病引發(fā)的最常見也是最嚴重的并發(fā)癥之一，并且已發(fā)展為糖尿病患者高死亡率的一個重要原因[4-5]。糖尿病會引起腎臟的惡化，其初期病理學(xué)表現(xiàn)為腎細胞基底膜增厚、系膜區(qū)擴張、足細胞損傷，后期發(fā)展為腎臟肥大、腎小球硬化[6]。

研究發(fā)現(xiàn)，氧化損傷是糖尿病并發(fā)癥中最重要的損傷途徑之一[7]。氧化應(yīng)激是指體內(nèi)氧化還原失衡，氧化作用顯著強于還原作用，從而刺激機體產(chǎn)生并且積累大量有害的氧化中間產(chǎn)物。當機體長期處于高血糖狀態(tài)會導(dǎo)致體內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）大量生成，ROS可對臟器造成直接或間接損傷[8]。因此，預(yù)防與改善高血糖導(dǎo)致的機體氧化應(yīng)激對于緩解糖尿病肝腎損傷具有重要意義。

鎖擲酵母（Sporidiobolus pararoseus）是一類自然界中廣泛存在的紅色擔(dān)子菌門真菌[9]。研究發(fā)現(xiàn)，S.pararoseus JD-2酵母具有培養(yǎng)方式簡單、易分離、宜高密度培養(yǎng)、高產(chǎn)類胡蘿卜素[10]等營養(yǎng)代謝物的特點[11]。研究表明，類胡蘿卜素有清除自由基[12]、保護細胞、增強細胞免疫功能，已被作為保健品功能因子廣泛應(yīng)用于食品、藥品等行業(yè)[13]。S.pararoseus JD-2代謝產(chǎn)物富含類胡蘿卜素，其中主要成分是γ-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素、圓酵母素和紅酵母紅素，其是維生素A前體，具有抗氧化和抗衰老活性[14-15]。由于酵母粉獨特的抗氧化作用，提示了其在Ⅱ型糖尿病及其并發(fā)癥中有可能發(fā)揮積極作用。

本研究采用了Ⅱ型糖尿病模型小鼠作為研究對象，觀察了鎖擲酵母粉對糖尿病小鼠肝、腎病的保護作用，進一步研究了其可能的作用機制，為酵母粉治療糖尿病肝、腎損傷提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鎖擲酵母（Sporidiobolus pararoseus）JD-2-8：由本實驗室自行篩選所得。

斜面培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，葡萄糖20 g/L，酵母膏10 g/L，瓊脂20 g/L，pH6.0；種子培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，玉米漿20 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，KH2PO41.0 g/L，pH 6.0；發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖40 g/L，玉米漿20 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，KH2PO41.0 g/L，pH 6.0。

丙酮、氯化鈉、檸檬酸、濃鹽酸、檸檬酸鈉（均為分析純）：國藥集團上海化學(xué)試劑有限公司；鹽酸二甲雙胍（藥品級）：山東司邦得制藥有限公司；蛋白定量試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）：南京建成生物工程研究所；鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）：美國Sigma公司；無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級C57BL/6小鼠[SCXK（滬）2013-0018]：上海斯萊克實驗動物有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ROCHE羅氏活力血糖儀及試紙：德國Roche羅氏生物技術(shù)有限公司；AB204-N電子天平：Mettler-Toledo Group；Scientz-10nd冷凍干燥機：寧波新芝生物科技有限公司；XSP-2C生物光學(xué)顯微鏡：蘇州歐卡精密光學(xué)儀器有限公司；ZNCL-GS智能磁力攪拌器：鄭州科華儀器設(shè)備有限公司；centrifugae5804R離心機：德國Eppendorf公司；WFJ7200可見分光光度計：龍尼柯上海儀器有限公司；HWS-24電熱恒溫水浴鍋：上海齊欣科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 鎖擲酵母粉的制備

將液氮保存的菌種接入斜面培養(yǎng)基，28℃恒溫培養(yǎng)48 h，分離得一環(huán)菌種接入裝有50 mL種子培養(yǎng)基的500 mL錐形瓶中，28℃、100 r/min搖床培養(yǎng)24 h得種子液。再將10 mL種子液接入裝有100mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL錐形瓶中，28℃、72 h連續(xù)培養(yǎng)后得到鎖擲酵母發(fā)酵液。發(fā)酵液4 000 r/min離心15 min，沉淀部分冷凍干燥后即為鎖擲酵母粉。

1.3.2 實驗動物與模型的建立

48只雄性C57BL/6小鼠，常規(guī)飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，禁食16 h，測定小鼠的空腹血糖值，隨機抽取8只為空白對照組（blank control，BC）?？瞻讓φ战M小鼠喂養(yǎng)常規(guī)飼料，其余均喂養(yǎng)高脂肪飼料，喂養(yǎng)4周后所有小鼠均禁食過夜，給除空白組外的小鼠連續(xù)3 d腹腔注射100 mg/kg STZ檸檬酸緩沖液[16]，空白組小鼠注射同等劑量的檸檬酸緩沖溶液。3 d后禁食不禁水過夜，小鼠尾靜脈取血測空腹血糖值。若小鼠空腹血糖值≥11.1 mmol/L，即成功誘導(dǎo)40只小鼠糖尿病模型。

將以上40只Ⅱ型糖尿病小鼠隨機分5組，每組8只，分別為糖尿病模型組（diabetes model，DM）、陽性組（positive contral，PC）（鹽酸二甲雙胍1.5 mg/kg）、酵母粉低劑量組（FL）（鎖擲酵母粉1.5 g/kg）、酵母粉中劑量組（FM）（鎖擲酵母粉3.0 g/kg）、酵母粉高劑量組（FH）（鎖擲酵母粉6.0 g/kg），該5組均喂熱量飼料，鎖擲酵母粉溶于生理鹽水后經(jīng)口灌胃，灌胃周期為8周。

1.3.3 小鼠體質(zhì)量、進食量、飲水量及臟器指數(shù)的測定

每周同一時間記錄小鼠體質(zhì)量；通過間隔2 d的飼料量與飲水量差值，計算小鼠每天的采食量、飲水量；實驗結(jié)束后，摘取心臟、肝臟、腎臟、脾臟并準確稱質(zhì)量。

1.3.4 小鼠空腹血糖及血清生化指標的測定

每周同一時間禁食16 h不禁水，尾靜脈取血，血糖儀測定小鼠的空腹血糖值。實驗最后1 d，水合氯醛麻醉小鼠，摘取眼球收集血液，室溫靜置30 min，4℃、4 000 r/min離心15 min，分離得血清，-20℃儲藏，1周內(nèi)用試劑盒測定血清MDA、SOD指標。

1.3.5 測定肝、腎組織中SOD和MDA的測定

實驗結(jié)束，快速取出肝、腎組織0.2 g，預(yù)冷生理鹽水漂洗，濾紙吸干水分，加入9倍4℃的生理鹽水，制備10%的組織勻漿液。組織勻漿液4℃、3 500 r/min離心10 min，測定上清液中的蛋白濃度、丙二醛、超氧化物歧化酶的含量。

1.3.6 肝、腎組織病理觀察

制備病理切片。實驗結(jié)束，快速取出小鼠部分肝、腎組織并用4%多聚甲醛固定1 d，不同濃度酒精梯度脫水、石蠟包埋，繼續(xù)切成4μm的薄片。最后，切片脫蠟，蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，脫水，樹膠封片，以備觀察。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

選用統(tǒng)計學(xué)分析軟件IBMSPSSStatistics21.0，one-way ANOVA方法及Duncan檢驗分析數(shù)據(jù)，數(shù)值以（平均值±標準誤差）表示。當P＜0.05時表示有顯著性差異，且具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 鎖擲酵母粉對小鼠臟器指數(shù)的影響

表1 鎖擲酵母粉對小鼠臟器指數(shù)的影響Table 1 Effect of Sporidiob olus pararoseus powder on visceral index of mice

由表1可知，相比于空白組，小鼠的脾臟系數(shù)無顯著性差異（P＞0.05），心臟系數(shù)減小，肝和腎的臟器系數(shù)卻顯著增大（P＜0.05）。相比于模型組，陽性組可以緩解臟器損傷，不同劑量酵母粉組則可以更顯著地減輕腎臟指數(shù)（P＜0.01）。

2.2 鎖擲酵母粉對小鼠體質(zhì)量、進食進水量及空腹血糖的影響

由圖1可知，空白組小鼠的體質(zhì)量正常增長，并且飲水量、采食量無顯著差異（P＞0.05）。模型組小鼠在注射STZ后體質(zhì)量明顯降低，但飲水、采食量明顯增多，這是糖尿病模型明顯癥狀，即“三多一少”。而陽性和不同酵母粉劑量組小鼠情況有所改善。

圖1 鎖擲酵母粉對小鼠體質(zhì)量（a）、飲水量（b）、采食量（c）、空腹血糖值（d）的影響Fig.1 Effect of Sporidiobolus pararoseus powder on body weight(a),water intake(b),food intake(c),fasting blood glucose(d)of mice

小鼠的血糖水平在開始前都在4.7 mmol/L左右，當注射STZ造模，除空白組小鼠外，各組小鼠血糖值明顯上升（≥11.1 mmol/L），此即糖尿病小鼠癥狀。陽性組和酵母粉組小鼠血糖水平較模型組相比有所下降，雖然可以保持穩(wěn)定，但沒有恢復(fù)到空白組水平。

眾多研究表明，Ⅱ型糖尿病是一種長期的代謝紊亂疾病，且以高血糖、胰島素抵抗和胰島素分泌相對不足為特征[17-18]。本研究主要通過高熱量飲食結(jié)合了STZ腹腔注射C57BL/6小鼠，誘導(dǎo)小鼠胰島素代謝紊亂，造成Ⅱ型糖尿病模型。由于高熱量飲食使小鼠產(chǎn)生胰島素抵抗，并且連續(xù)3 d的STZ腹腔注射直接破壞了體內(nèi)部分胰島β細胞[19]，導(dǎo)致胰島素更加分泌不足，血糖代謝紊亂，因此，小鼠空腹血糖值上升。

2.3 鎖擲酵母粉對小鼠血清SOD、MDA的影響

由表2可知，相對于空白組小鼠，模型組小鼠血清中超氧化物歧化酶（SOD）活性顯著降低，丙二醛（MDA）濃度卻顯著上升（P＜0.01）。陽性組和酵母粉組均可顯著提高SOD含量，減少MDA的生成（P＜0.05）。

表2 鎖擲酵母粉對小鼠血清超氧化物歧化酶和丙二醛的影響Table 2 Effect of Sporidiobolus pararoseus powder on superoxide dismutase and malondialdehyde in serum of mice

2.4 鎖擲酵母粉對小鼠肝、腎組織中SOD、MDA的影響

由表3可知，相比于空白組小鼠，模型組小鼠肝、腎組織中MDA含量顯著增高（P＜0.01），SOD活性明顯降低（P＜0.01）。與模型組相比，陽性組和酵母粉組不僅可以明顯提高SOD活性（P＜0.05），還可以降低MDA含量，其中酵母粉高劑量組效果最為顯著（P＜0.01）。

大量研究表明，糖尿病與氧化應(yīng)激相關(guān)[20]?；钚匝踝杂苫≧OS）可以在機體各個組織中引起氧化應(yīng)激，導(dǎo)致氧化還原平衡失衡，從而激活了一系列對氧化應(yīng)激敏感的細胞因子，細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)被激活，進一步紊亂糖、脂代謝等通路，最終導(dǎo)致一系列糖尿病慢性并發(fā)癥，如糖尿病肝病、糖尿病腎病等[21]。自由基不僅可以造成生物膜的脂質(zhì)過氧化損傷，直接或間接破壞細胞蛋白質(zhì)、核酸、脂肪，而且會損傷內(nèi)臟器官、免疫系統(tǒng)的形態(tài)功能，引起機體疾病[22]。

表3 鎖擲酵母粉對小鼠肝、腎超氧化物歧化酶和丙二醛的影響Table 3 Effect of Sporidiobolus pararoseus powder on superoxide dismutase and malondialdehyde in liver and kidney of mice

由于機體糖代謝紊亂，葡萄糖進行自身氧化，Ⅱ型糖尿病患者體內(nèi)產(chǎn)生大量活性氧，并常伴有脂肪肝等[23-24]。當活性氧增加，機體內(nèi)存在酶系抗氧化系統(tǒng)-超氧化物歧化酶（SOD）活性就會下降，導(dǎo)致機體不能及時清除自由基，產(chǎn)生了大量的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，最終使末端產(chǎn)物丙二醛含量升高[25]。由表2可知，Ⅱ型糖尿病小鼠經(jīng)不同劑量的酵母粉干預(yù)后，均能夠不同程度地恢復(fù)小鼠機體的抗氧化抵御能力，清除脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，小鼠血清中SOD活性水平有所上升，與模型組有顯著性差異（P＜0.05）；MDA濃度顯著下降，陽性對照組、中劑量組、高劑量組與模型對照組均有顯著差異（P＜0.05），高劑量組可恢復(fù)至空白組正常水平。表明酵母破壁粉可以提高小鼠體內(nèi)抗氧化酶SOD的活性，顯著降低MDA水平。通過對表3中肝臟和腎臟數(shù)據(jù)分析，與空白組小鼠比較，模型組小鼠的肝臟、腎臟SOD和MDA水平均有極顯著差異（P＜0.01），說明糖尿病對肝、腎造成了實質(zhì)性的損傷，組織內(nèi)抗氧化酶系活力降低了，清除自由基能力減弱，產(chǎn)生氧化應(yīng)激。但通過陽性藥物和不同劑量的酵母粉的治療，糖尿病小鼠的SOD活性水平均有所提高，除了低劑量酵母粉的肝臟MDA沒有顯著差異（P＞0.05），其余組的MDA含量均得到了有效的清除。由于劑量效應(yīng)，高劑量組的治療效果比陽性藥物二甲雙胍有極顯著差異（P＜0.01），這也證明了酵母粉具有獨特的抗氧化性。

2.5 小鼠肝、腎病理觀察

由圖2可知，HE切片染色結(jié)果顯示，空白組小鼠腎病理切片結(jié)構(gòu)清晰，系膜細胞與細胞外基質(zhì)分布正常，無增生及纖維化現(xiàn)象。糖尿病組小鼠腎小球細胞數(shù)量增多，細胞間無明顯的間隙，細胞水腫，腎小球的系膜細胞基底膜增厚，系膜區(qū)擴張；陽性組和酵母粉組小鼠組織損傷較糖尿病組小鼠減輕，腎小球結(jié)構(gòu)較為清晰，腎小管排列清楚，酵母粉高劑量組小鼠肝腎組織病理情況最佳。

圖2 小鼠腎臟、肝臟病理形態(tài)（HE染色，×200）Fig.2 Pathological morphology of kidney and liver of mice(HE staining,×200)

肝病理切片顯示，空白組小鼠肝細胞形態(tài)正常，無脂肪變性現(xiàn)象。模型組的小鼠肝臟明顯有各種脂肪空泡，出現(xiàn)大量雙核肝細胞。陽性組小鼠肝細胞脂肪性變基本消失，但仍可見少量肝細胞壞死碎片，酵母粉低組小鼠肝臟仍存在小泡性脂肪形變，并且伴有肝細胞碎片，酵母粉中、高劑量組小鼠肝細胞僅可見少量脂肪變性。

通過病理切片觀察，模型組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)紊亂，大部分肝細胞內(nèi)出現(xiàn)大脂肪空泡與小脂肪空泡。二甲雙胍治療組可以明顯減輕Ⅱ型糖尿病造成的脂肪肝癥狀，而經(jīng)鎖擲酵母粉治療后，中劑量與高劑量組的糖尿病小鼠的肝細胞排列基本規(guī)則，肝細胞內(nèi)大脂肪空泡減少，尤其是高劑量的酵母粉的作用效果更為顯著。此結(jié)果表明，鎖擲酵母粉對糖尿病小鼠的肝臟有保護作用，并且高劑量的酵母粉與陽性藥物二甲雙胍治療效果類似。在本項研究中，糖尿病小鼠經(jīng)酵母粉治療8周后，病理檢查發(fā)現(xiàn)，腎小球系膜區(qū)增生減輕，腎小管恢復(fù)至正常狀態(tài)。

3 結(jié)論

本研究證明了鎖擲酵母（Sporidioboluspararoseus）JD-2-8粉能提高Ⅱ型糖尿病小鼠血清、肝和腎的抗氧化能力，提高肝腎內(nèi)抗氧化酶SOD活性，加快清除氧化應(yīng)激產(chǎn)物MDA含量，減少高血糖對肝、腎組織的損害，從而延緩Ⅱ型糖尿病的發(fā)展，其機制可能是通過改善肝、腎氧化應(yīng)激、提高肝、腎抗氧化能力。