濃香型白酒對急性酒精中毒小鼠宿醉頭痛指標的影響

胡力文，楊 飛，趙婉妤，許 欣*，裴曉方，盧中明，杜禮泉，鄭 敏

（1.四川大學 華西公共衛生學院/四川大學華西第四醫院，四川 成都 610041；2.四川省綿陽市豐谷酒業有限責任公司，四川 綿陽 621006）

中國酒文化源遠流長，酒在當今社會的各種交際活動、社交場合更是不可或缺。但近年來研究顯示，國內外急性酒精中毒發病率均呈上升趨勢，考慮其龐大群體，并且容易成為多種急癥的誘發因素，故應予以重視[1]。急性酒精中毒是指在短時間內攝入大量酒精或含酒精飲料后出現的中樞神經系統功能紊亂狀態，嚴重程度與飲酒速度、飲酒量、血液酒精濃度及個體耐受性等有關，通常伴有頭痛、頭暈和胃部不適等延續效應[1-2]。

宿醉頭痛或是酒精誘導的遲發性頭痛通常在飲酒結束后的4～24 h內發生，出現與偏頭痛發病類似的癥狀（如畏光、單側頭痛等[3]）。關于頭痛的機制眾說紛紜，目前占據主導地位的是三叉神經血管說，學者們認為當三叉神經末梢受刺激時，會引起顱內腦外血管擴張，使環繞血管周圍的三叉神經感覺C纖維釋放具有強烈血管刺激作用的肽類物質，并刺激腦內肥大細胞脫顆粒釋放具有血管活性、促炎、感覺敏感介質，從而引起頭痛[4-6]。

隨著生活方式的改變，人們對生活質量的要求越來越高。白酒作為飲品，不僅要求飲時口感舒適，而且更注重飲后的體征感受；既能滿足對人精神激活的程度，又不至于影響生活、工作和健康。目前，已有研究表明不同品質白酒對機體的影響存在差異[7-8]，但鮮見針對飲酒上頭的相關研究報道，故本研究將采用急性酒精中毒小鼠模型，結合行為學表現，探討比較不同濃香型白酒對宿醉頭痛相關效應指標的影響，為釀酒工藝的進一步改良奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

同品牌不同勾調工藝的48°濃香型白酒（編號分別為①號、②號），主要理化成分見表1，由四川省綿陽市豐谷酒業有限公司提供。

表1 48°濃香型白酒主要理化成分Table 1 Main physical and chemical components in strong-flavor Baijiu with 48%alcohol content

Balb/c小鼠（雄性，日齡（42～48 d），SPF級）：北京維通利華實驗動物有限技術公司（生產許可證號：SCXK（京）2016-0011）。獨立通氣籠盒（individually ventilated cages，IVC）室飼養，環境溫度20～22℃，相對濕度60%～70%，由四川大學華西公共衛生學院實驗動物中心提供（使用許可證號：SYXK（川）2018-011）。

肝素試劑：南京建成生物工程研究所；乙醇（體積分數99.7%，分析純）：成都海興化工試劑廠；前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）酶聯免疫測定試劑盒、組胺（histamine，HIS）酶聯免疫測定試劑盒：武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；小鼠內皮素（endothelin，ET）酶聯免疫檢測試劑盒、小鼠P物質（substance P，SP）酶聯免疫檢測試劑盒、小鼠甲硫氨酸腦啡肽（methionine enkephalin，MEK）酶聯免疫檢測試劑盒：上海酶聯科技生物有限公司；1%乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）、抑肽酶、降鈣素基因相關肽（calcitonin gene related peptide，CGRP）放射免疫測定試劑盒：美國鳳凰生物公司。

1.2 儀器與設備

7890B氣相色譜儀、7697A頂空進樣器：美國Agilent公司；ECTM-WAX毛細管色譜柱（30 m×0.53 mm×1.2μm）：美國Alltech公司；HeraeusTMFrescoTM21微量離心機、Multiskan Go全波長酶標儀：美國Thermo Scientific公司；749540-0000手持式勻漿器：美國Kimble公司；γ放射免疫計數器：安徽中科中佳科學儀器有限公司；手動連續分液器：美國Gilson公司；TS-1脫色搖床、XW-80A渦旋混合器：海門市其林貝爾儀器制造有限公司；隔水式電熱恒溫培養箱：上海躍進醫療器械廠；V型槽：自制。

1.3 方法

1.3.1 動物分組與處理

160只Balb/c小鼠適應性飼養后，按體質量進行分層隨機分組，分為樣①組、樣②組、酒精對照組和空白對照組，劑量設置見表2。

表2 實驗動物分組與處理情況Table 2 Grouping and processing of experimental animals

1.3.2 翻正反射實驗

禁食不禁水12 h，不同組別小鼠稱體質量后，分別按相應劑量進行灌胃。參考CRABBE JC等方法[9]，將小鼠背部置于V型槽中呈仰位，30 s內未能翻轉身體，即翻正反射消失，記錄醉酒時間（min）；60 s內能連續2次翻轉身體，即翻正反射恢復，記為醒酒時間（min）；并計算醉酒率（%）。

1.3.3 標本采集與處理

當小鼠翻正反射恢復時，立即抓取固定使其眼球突出充血，用彎頭眼科鑷迅速鉗取眼球，使血液流入抗凝離心管中，顛倒混勻后4℃、3 000 r/min離心15 min，取上清，-20℃冰箱保存備測。不同的抗凝劑適用于不同的指標測定，加入100μL肝素鈉溶液的抗凝管用于乙醇、PGE2、HIS含量測定；加入100μL 1%EDTA、100μL抑肽酶的抗凝管用于ET、SP、MEK、CGRP含量測定。

1.3.4 指標檢測

血漿乙醇濃度測定：標本平衡至室溫后，取200μL待測標本加入頂空玻璃中，再加入2 mL超純水，蓋緊瓶蓋后放于頂空進樣裝置中進行汽化平衡，自動進樣1 mL，氣相色譜法檢測。色譜條件：ECTM-WAX毛細管色譜柱（30 m×0.53 mm×1.2μm）；分流進樣，分流比10∶1；載氣：N2（純度99.999%），流速25 cm/s；氫火焰離子化檢測器：250℃；進樣口溫度：200℃；程序升溫：40℃保留5 min，以20℃/min升至200℃，保留7 min；頂空氣化條件：平衡時間30 min，加熱溫度70℃，傳輸線溫度90℃，進樣針溫度70℃。

血漿PGE2、HIS、ET、SP、MEK濃度測定：標本及酶聯免疫吸附法檢測試劑盒平衡至室溫后，取10μL待測標本加入反應板內，再加入40μL樣品稀釋液，輕搖晃動后加入100μL辣根過氧化物酶標記的檢測抗體，37℃溫育60 min，洗滌后加入顯色劑，37℃避光顯色15 min，最后加入終止液，以空白對照孔調零，測定各孔450 nm波長下的吸光度值，標準曲線法定量。

血漿CGRP濃度測定：標本及放射免疫法檢測試劑盒平衡至室溫后，取100μL待測標本加入含有特異性兔抗血清的反應體系內，渦旋振蕩混勻，4℃孵育24 h后加入100μL125I-示蹤溶液，渦旋振蕩混勻后4℃孵育24 h，最后加入100μL羊抗兔IgG血清，室溫孵育90 min，再加入500μL反應緩沖液，混勻后4 ℃，3 000 r/min離心20 min，放射性γ-計數儀進行沉淀放射衰變率檢測，標準曲線法定量。

1.3.5 數據的統計及處理

采用SPSS 21.0軟件進行統計分析和處理，正態分布數據采用均值±標準差（X±S）表示。方差齊時進行單因素方差分析（analysis of variance，ANOVA），LSD檢驗進行組間兩兩比較；方差不齊時使用Kruskal-Wallis檢驗。

2 結果與分析

2.1 行為學指標

急性酒精中毒是指一次性過量飲酒所致的急性中毒，常伴有頭痛、頭暈和胃部不適等延續效應[2]。研究表明，當乙醇暴露劑量超過3.5 g/kg，絕大多數小鼠均會出現翻正反射消失的現象[10]，故根據前期預實驗，本研究采用11 mL/kg體質量（約4.2 g/kg）的單次灌胃劑量進行急性酒精中毒模型建立。不同組別翻正反射實驗行為學指標檢測結果見表3。

表3 翻正反射實驗行為學指標檢測結果（x±s，n=40）Table 3 Determination results of behavioral indicators by righting reflex test

由表3可知，樣①組醒酒時間極顯著低于酒精對照組（P＜0.01）；其余組間差異無統計學意義（P＞0.05）。各組間醉酒時間無統計學差異（P＞0.05）。本研究顯示樣①組、樣②組醉酒時間長于酒精對照組，而醒酒時間則短于酒精對照組，提示酒樣組具有“醉得慢，醒得快”的趨勢，與張夢妍等[11]對濃香型白酒醉酒度評價研究結果一致。

2.2 乙醇代謝指標

飲酒后，乙醇主要在胃腸道被吸收，約90%～98%的乙醇通過肝臟進行代謝，代謝速率與攝入量、酶活性等相關[12-13]。不同組別血漿乙醇含量檢測結果見表4。

由表4可知，樣①組、樣②組和酒精對照組乙醇含量無統計學差異（P＞0.05），由于灌胃劑量相同，故可推測酒樣①、酒樣②和酒精對照在機體內的代謝速度相近。除此之外，過量攝入乙醇后，當超過肝臟代謝負荷時，部分乙醇則會直接穿過血腦屏障進入腦部，進而直接或間接引起腦部損傷[14]，且暴露劑量與損傷程度呈正相關關系。由表4可以看出樣①組、樣②組和酒精對照組乙醇含量相當，提示酒精暴露組可能產生程度相近的腦損傷。

表4 血漿中乙醇含量檢測結果（x±s，n=10）Table 4 Determination results of ethanol content in plasma

2.3 炎性介質指標

前列腺素參與哺乳動物的炎癥反應，是一類重要的炎癥因子[16]，PGE2刺激神經末梢是造成炎癥組織疼痛的主要原因[16]。不同組別血漿炎性介質含量檢測結果見表5。

表5 血漿中炎性介質含量檢測結果（x±s，n=10）Table 5 Determination results of inflammatory medium content in plasma

由表5可知，樣①、樣②組PGE2含量高于酒精對照組、空白對照組，且樣②組PGE2含量顯著高于酒精對照組和空白對照組（P＜0.05），提示酒樣具有一定程度的致炎作用，具體可能與酒樣中雜醇油等微量成分有關。各組間血漿HIS含量無統計學差異（P＞0.05）。

2.4 神經遞質指標

CGRP是血管周圍神經釋放的最主要的血管活性肽類物質，是迄今已知最強的血管舒張肽，在偏頭痛的發病機制中起著關鍵性作用[17]。不同組別血漿CGRP、ET含量檢測結果見表6。

表6 血漿中降鈣素基因相關肽、內皮素含量檢測結果（x±s，n=10）Table 6 Determination results of calcitonin gene related peptide and endothelin content in plasma

本研究發現不同組別間CGRP含量無統計學差異（P＞0.05），提示宿醉頭痛與偏頭痛機制可能存在一定的差異。ET是強烈的血管收縮劑，可引起各種血管劇烈收縮，促進血管內皮收縮因子的釋放，導致組織缺血、缺氧[18]。當ET過量釋放，作用于腦血管，可使局部血管發生強烈收縮、痙攣[19]。本研究結果顯示，空白對照組、酒精對照組ET含量高于樣①組、樣②組，說明酒樣可通過降低ET含量使局部血管收縮減弱，進而減少疼痛感。

研究表明SP由中樞端末梢神經釋放，參與痛覺傳遞，可促進抑制性神經遞質（MEK等）釋放引起鎮痛作用[20]。不同組別血漿MEK、SP含量檢測結果見表7。

表7 血漿中甲硫氨酸腦啡肽、P物質含量檢測結果（x±s，n=10）Table 7 Determination results of MEK and P substance content in plasma

由表7可知，樣①組血漿MEK含量極顯著高于樣②組、酒精對照組、空白對照組（P＜0.01）；其余組間差異無統計學意義（P＞0.05）。樣②組血漿SP含量極顯著低于樣①組、酒精對照組、空白對照組（P＜0.01）；其余組間差異無統計學意義（P＞0.05）。

本研究發現樣①組SP、MEK含量均高于樣②組，提示樣①組疼痛感較樣②組更嚴重。田學梅等[20]提出過量醛類物質、酸酯比例失調等是飲酒后上頭的主要因素，結合兩種酒樣的理化分析結果推斷，可能與酒樣①中含有更高的總酸、乙醛、乙縮醛等微量成分有關。

3 結論

綜上所述，不同濃香型白酒對小鼠宿醉頭痛相關效應指標的影響存在差異，其中酒樣①較酒樣②能誘導產生更高的SP、MEK含量水平，結合白酒理化成分分析，提示可能與酒樣中較高的總酸、乙醛、乙縮醛等微量成分有關。