響應面法優化荔枝醋酸發酵的工藝條件

張 斌，陳兆貴，鄒俊杰

（惠州學院 生命科學學院，廣東 惠州 516007）

果醋類產品是經過生物發酵的健康飲品，其中醋酸發酵是生物發酵中的關鍵環節，其對果醋產品最終的營養風味及保健功效起到非常重要的作用。國內外學者一直都對醋酸發酵工藝及關鍵點的研究非常重視。劉國明等[1]利用正交分析法對荔枝醋酸發酵菌種篩選及工藝進行優化，探明風味最佳荔枝醋的發酵工藝；屈利民等[2]研究了荔枝果醋的3種不同發酵方式，并采用頂空固相微萃取-氣質聯用技術對揮發性風味成分進行了分析比較；張霽紅等[3]研究了蘋果醋液態深層發酵方法，優選出了菌株Y010及其在發酵過程中乙醇脫氫酶活性與產酸量和產酸速率的關系；HIDALGO C等[4]應用分子生物學方法對柿子醋酸發酵進行研究，對柿子在醋酸化過程中產生的醋酸菌進行了鑒定。

醋酸發酵是在醋酸菌氧化酶的作用下將酒精氧化生成醋酸，理論上100 g酒精能生成130.4 g醋酸，由于發酵過程中醋酸會被作為醋酸菌生長繁殖的碳源營養而被消耗一部分，外加醋酸的揮發、氧化分解、酯化反應等原因，在實際中一般只能達到理論值的85%左右[3-5]。醋酸發酵受到醋酸菌接種量、發酵溫度、發酵時間、初始酒精度等因素的影響。本試驗應用響應面優化方法對荔枝醋酸發酵工藝條件進行優化研究，以考察荔枝醋酸發酵的最佳工藝參數，提高醋酸產量，旨在為荔枝醋的工業化生產提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

荔枝清汁：廣東禎州荔枝產業股份有限公司；滬釀1.01號醋酸菌：海博生物技術有限公司；澳大利亞R2酵母：上海杰兔工貿有限公司。其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

UV1810紫外可見分光光度計、愛拓RX-5000α自動阿貝折光儀：北京普析通用儀器公司；DDSJ-318型電導率儀：上海儀電科學儀器股份有限公司；雷磁PHSJ-5型pH測定儀：上海儀電分析儀器有限公司；生物發酵罐：張家口奧斯特不銹鋼有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 荔枝醋酸發酵工藝

荔枝清汁→成分調整（總糖250 g/L）→酒精發酵（酵母菌250 mg/L 28℃、6～8 d）→醋酸發酵（11 d）→指標檢測→過濾→滅菌（130℃、2 min）→荔枝原醋

1.3.2 單因素試驗設計

通過單因素試驗分別考察醋酸菌接種量（0.30 g/L、0.50 g/L、0.70 g/L、0.90 g/L）、初始酒精度（5%vol、6%vol、7%vol、8%vol）、醋酸發酵溫度（25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃）對醋酸發酵中總酸含量的影響。

1.3.3 響應面試驗設計

利用在單因素試驗獲得的最佳接種量、溫度和初始酒精度范圍，在Box-Behnken響應曲面法設計3因素3水平試驗，以醋酸菌接種量、發酵溫度和初始酒精度3個因子為自變量，以總酸含量為響應值，試驗設計因素與水平見表1。

表1 醋酸發酵條件優化響應面試驗設計因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology for conditions optimization of acetic acid fermentation

1.3.4 指標測定

總酸的測定[6]：酸堿中和滴定法（以醋酸含量計）；酒精度的測定[7]：密度瓶法。

2 結果與分析

2.1 接種量對醋酸發酵的影響

醋酸菌接種量對荔枝醋酸發酵的影響見圖1。由圖1可以看出，各發酵樣在前6 d的產酸量都呈現遞增趨勢，彼此差別不明顯。在第7天后，接種量0.70～0.90 g/L的發酵樣產酸速度變緩，發酵周期較長，接種量0.30～0.50 g/L的發酵樣產酸速度較高，當接種量為0.30 g/L時醋酸產量達到5.14 g/100 mL。可見最優接種量范圍為0.30～0.50 g/L。

圖1 醋酸菌接種量對荔枝醋酸發酵的影響Fig.1 Effect of acetic acid bacteria inoculum on acetic acid fermentation of litchi

在醋酸發酵中，醋酸桿菌的主要作用是將酒精氧化為醋酸，足量的醋酸菌不僅可以縮短發酵周期，還能降低污染雜菌的幾率，但如果醋酸菌接種量過大，不僅將酒精作為碳源，還會以甘油、甘露醇等多元醇作為碳源，發酵液中的營養物質會供應不足，會繼續把醋酸氧化成二氧化碳和水，也會氧化乙醇之外的其他醇類和糖類生成相應的酸、酮等物質，同時會導致代謝雜質增多，容易產生過早老化和自溶現象[8-11]。

2.2 初始酒精度對醋酸發酵的影響

初始酒精度對醋酸發酵的影響見圖2。由圖2可知，在前3 d中，4個發酵樣的產酸速度都呈現遞增的趨勢。第4天后表現出不同的趨勢，初始酒精度5%vol～6%vol的發酵樣產酸一直呈現遞增趨勢。初始酒精度5%vol和6%vol的發酵樣在第11天時總酸含量分別達到5.39 g/100 mL和5.38 g/100 mL，而初始酒精度為4%vol和7%vol的發酵樣僅為1.83 g/100 mL和3.14 g/100 mL，其中初始酒精度7%vol的發酵樣，產酸速率緩慢，產酸量不斷下降。可見初始酒精度范圍在5%vol～6%vol時最有利于醋酸發酵。

圖2 初始酒精度對醋酸發酵的影響Fig.2 Effect of initial alcohol content on acetic acid fermentation of litchi

在醋酸發酵過程中，隨著發酵時間的延長，酒精度逐漸下降，酸度不斷升高，一般醋酸發酵的適宜酒精度范圍為5%vol～12%vol。初始酒精度為醋酸菌的繁殖代謝提供了必需的營養物質，在一定的酒度范圍內，總酸產量會隨著酒精度的增大逐漸增加，但是初始酒精度過高時，反而會抑制醋酸菌的生長代謝活動，導致醋酸菌不適應高酒精度環境，從而影響發酵進程，使醋酸產量下降，同時延長了發酵周期[12-16]。

2.3 發酵溫度對醋酸發酵的影響

發酵溫度對荔枝醋酸發酵的影響見圖3。由圖3可知，當醋酸發酵溫度為30～35℃時產酸速度最快，產酸量也較高。在35℃時，醋酸產量在第11天達到5.22 g/100 mL。發酵溫度在40℃時，醋酸產率先升高后降低，這是由于發酵溫度過高，醋酸菌在第8天時失活，提前老化而導致醋酸量下降。發酵溫度在25℃時，雖然醋酸產量整體呈現上升趨勢，但是醋酸菌生長代謝緩慢，發酵周期長，醋酸產量偏低。可見最適醋酸發酵溫度為30～35℃。

一般情況下，醋酸菌生長繁殖的適宜溫度為28～33℃，醋酸菌生長的最適pH值為3.5～6.5，在發酵液中醋酸含量達1.5%～2.5%時，其生長繁殖就會停止，醋酸發酵過程依賴于細胞膜上具有高活性的乙醇脫氫酶以及乙醛脫氫酶，發酵過程中乙醇在乙醇脫氫酶作用下被氧化成乙醛，乙醛在乙醛脫氫酶作用下被氧化為乙酸。酶的催化反應有最適條件，一般在最適溫度下，酶的催化反應才能達到最大值[17-19]。理論上，一般發酵溫度每上升10℃，催化反應速率提升1～2倍。但是，當溫度過高時，酶的催化能力會大大降低，甚至會導致其喪失催化活性[20-22]。

圖3 發酵溫度對荔枝醋酸發酵的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on acetic acid fermentation of litchi

2.4 響應面法優化醋酸發酵條件

在單因素試驗的基礎上，利用響應面法優化荔枝醋酸發酵工藝，根據Box-Behnken中心組合設計原理，以發酵11 d的總酸產量為響應值，利用Design-Expert.V8.0.6軟件對A（醋酸菌接種量）、B（初始酒精度）、C（發酵溫度）3個因素設計3因素3水平的響應面試驗，試驗設計及結果見表2。

表2 醋酸發酵條件優化響應面試驗結果與分析Table 2 Results and analysis of response surface methodology for conditions optimization of acetic acid fermentation

應用Design-Expert.V8.0.6軟件對荔枝醋酸發酵條件進行3因素3水平的響應面分析試驗設計，對響應面試驗結果進行回歸分析，獲得自變量為A（接種量）、B（初始酒精度）、C（溫度），響應值為Y值（總酸產量）的二次多元回歸方程：Y=50.74+1.16A+0.86B-0.89C-1.56AB-1.88AC+2.60BC-3.97A2-1.79B2-3.33C2。為檢驗方程的可靠性，對方程進行方差分析，結果見表3。

表3 響應面試驗結果方差分析Table 3 Variance analysis of response surface methodology results

如表3所示，P失擬項=0.885 8＞0.05，說明模型失擬度不顯著；回歸模型的調整確定系數（R2adj）為0.959 9，表明有95.99%響應值變化是可解釋的，且相關系數（R2）為0.982 5，與R2adj比較接近，說明此模型擬合程度好，誤差也較小，在荔枝醋酸發酵工藝參數的優化實驗上可以使用該模型進行分析。一次項A（接種量）、交互項AB、AC、BC、二次項A2、B2、C2的P值均＜0.01，說明對結果影響極顯著（P＜0.01）；B（初始酒精度）、C（溫度）的P值小于0.05，說明對結果影響顯著。

2.5 發酵條件的響應面分析與優化

在回歸模型方差分析結果的基礎上，進一步考察醋酸菌接種量（A）、初始酒精度（B）和發酵溫度（C）其交互作用對響應值Y（總酸產量）影響的響應面及等高線，結果見圖4。等高線形狀可以反映交互作用大小，當為橢圓形時，表示交互作用顯著；而當等高線形狀為圓形，則表示交互作用不顯著。

由圖4可知，接種量和初始酒精度的交互作用對總酸含量的影響極顯著，發酵溫度和初始酒精度的相互作用對總酸含量影響極顯著，發酵溫度與接種量的交互作用對總酸含量的影響極顯著。

圖4 各因素交互作用對總酸含量影響的響應面和等高線Fig.4 Response surface plots and contour line of effects of interactions between various factors on total acid content

根據所建立的數學模型進行參數的最優化分析，可得荔枝醋酸發酵的最佳發酵條件為發酵溫度32.08℃，初始酒精度5.52%vol，接種量0.42 g/L，該工藝條件下荔枝果醋含量的總酸理論值為5.10 g/100 mL。

2.6 驗證試驗

為了驗證響應面優化方法得到的多元回歸模型的準確性，保證試驗的可操作性，將最佳發酵工藝條件修正為發酵溫度32℃，初始酒精度5.5%vol，接種量0.42 g/L。在該條件下進行3次平行試驗，得到醋酸發酵后總酸的平均值為4.91 g/100 mL，實際值與理論值較為接近，說明該模型準確可靠，能較好地預測荔枝果醋飲料的酸度，利用該模型在實踐中進行預測是可行的。

3 結論

在單因素試驗的基礎上，利用響應面法對荔枝醋酸發酵條件進行了優化，建立了總酸產量與初始酒精度、發酵溫度、接種量3個因素的二次多項式回歸模型，由該模型得到的優化發酵工藝參數為發酵溫度32℃，初始酒精度5.5%vol，醋酸菌接種量0.42 g/L。在此優化條件下，總酸產量為4.91 g/100 mL，與理論值5.10 g/100 mL接近。經驗證實驗證明該模型合理可靠。