基于主成分分析與聚類分析綜合評(píng)價(jià)不同菌種發(fā)酵刺梨果渣的香氣品質(zhì)

陳思奇，孟 滿，杜勃峰，肖仕蕓，丁筑紅*

（貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025）

刺梨（Rosa roxburghii Tratt）為薔薇科多年生落葉灌木繅絲花的果實(shí)，刺梨富含維生素C、黃酮、多糖、多種人體必需氨基酸和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）等多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[1]。目前刺梨資源開發(fā)中占鮮果40%～50%的果渣綜合利用率低，浪費(fèi)嚴(yán)重[2]。果渣資源化利用的生物發(fā)酵技術(shù)已有研究報(bào)道，主要集中在提高與改善膳食纖維[3-4]，合成營(yíng)養(yǎng)素[5-6]，生產(chǎn)飼料等方面[7-8]。前期研究發(fā)現(xiàn)，嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）GIM.1.208、戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentosus）CICC.22210、生香酵母（aroma-producing yeast）和醋酸桿菌（Acetobacter pasteurianus AS1.41）GIM.1.67能夠明顯改善發(fā)酵刺梨果渣膳食纖維理化特性[9]，提高其功能活性，但對(duì)其食用品質(zhì)，特別是風(fēng)味變化及香氣特征缺乏研究。

目前揮發(fā)性物質(zhì)分析鑒定和分類研究可采用感官評(píng)價(jià)、主成分分析（principal component analysis，PCA）和聚類分析（cluster analysis，CA）等方法[10]，感官評(píng)價(jià)存在著極大的主觀因素，采用主成分和聚類分析在揮發(fā)性成分含量與香氣描述語(yǔ)等數(shù)據(jù)的處理中可得到較好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果[10-13]。本實(shí)驗(yàn)在頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜（headspace solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)基礎(chǔ)上，采用SPSS軟件對(duì)檢出的香氣成分進(jìn)行主成分分析和聚類分析，構(gòu)建刺梨果渣的香氣品質(zhì)評(píng)價(jià)模型，獲得不同菌種發(fā)酵刺梨果渣風(fēng)味品質(zhì)的綜合得分及其分布，以感官評(píng)價(jià)法驗(yàn)證，旨在找到一種更加客觀的綜合評(píng)價(jià)方法，為刺梨果渣產(chǎn)品開發(fā)加工和提高綜合利用度提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料和菌株

刺梨：品種為貴農(nóng)5號(hào)，采摘于貴州龍里縣，充分成熟，挑選新鮮無霉?fàn)€變質(zhì)，冷凍保藏（-10℃），將刺梨榨汁后取果渣（出汁率50%）備用。

菌種：嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）GIM.1.208、戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentosus）CICC.22210：購(gòu)于貴州輕化工中心；醋酸桿菌（Acetobacter pasteurianus AS1.41）GIM.1.67：廣東省微生物菌種保藏中心；生香活性干酵母：安琪酵母股份有限公司。

1.1.2 化學(xué)試劑

葡萄糖、乙酸鈉、檸檬酸鈉、吐溫-80、碳酸鈣、磷酸氫二鉀、硫酸鎂（七水）、硫酸錳（七水）均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g，牛肉膏10.0 g，酵母粉5.0 g，葡萄糖5.0 g，乙酸鈉5.0 g，檸檬酸鈉0.05 g，吐溫-80 1.0 mL，K2HPO42.0 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，MnSO4·7H2O 0.05 g，碳酸鈣20.0 g，瓊脂（1.5 g/100 mL），蒸餾水1000 mL，自然pH，121℃，0.1 MPa滅菌30 min，37℃靜置培養(yǎng)24～48 h，用于乳酸菌擴(kuò)大及斜面菌種培養(yǎng)。

1.2 儀器與設(shè)備

HP6890/5975C GC/MS聯(lián)用儀：美國(guó)安捷倫公司；SPX-150BⅢ型電熱恒溫培養(yǎng)箱：天津市泰斯特儀器有限公司；LS-50HG立式壓力蒸汽滅菌鍋：江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司；SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；JYZ-E6T型九陽(yáng)榨汁機(jī)：九陽(yáng)股份有限公司；XMTD-204數(shù)顯恒溫水浴鍋：上海梅香儀器有限公司；57304-手動(dòng)固相微萃取裝置：美國(guó)Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵菌種的培養(yǎng)

醋酸桿菌活化：葡萄糖10.0 g，酵母膏10.0 g，碳酸鈣15.0 g，無水酒精20.0 mL，瓊脂20.0g，蒸餾水1 000 mL，不調(diào)pH，無水酒精在培養(yǎng)基滅菌后冷卻至50～60℃加入，冷卻至室溫接種醋酸桿菌，置于30℃靜置培養(yǎng)24～48 h備用。

酵母菌活化參照文獻(xiàn)[14]進(jìn)行改進(jìn)如下：在酵母菌粉中按質(zhì)量比1∶20加入35～40℃的溫水，使其均勻分散，加入5%的蔗糖，活化20～30 min。待菌液降至室溫接種酵母菌。

乳酸菌活化[9]：MRS活化培養(yǎng)液121 ℃、0.1 MPa滅菌30 min，冷卻至室溫分別接種嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）GIM.1.208、戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentosus）CICC.22210的保藏培養(yǎng)物，37℃靜置培養(yǎng)24～48 h備用。

1.3.2 不同菌種發(fā)酵刺梨果渣

500 mL三角瓶中添加50 g刺梨果渣，按料液比1∶5（g∶mL）加入蒸餾水，用棉塞塞緊瓶口，煮沸滅菌10 min，待其冷卻后于無菌操作臺(tái)分別以接種量10%接入上述活化醋酸菌、酵母菌、乳酸菌擴(kuò)大培養(yǎng)的種子液（106～107CFU/mL），在自然pH條件下，將發(fā)酵液分別以發(fā)酵溫度28℃、30℃、37℃條件下發(fā)酵48 h后進(jìn)行GC-MS檢測(cè)。

1.3.3 刺梨果渣香氣SPME-GC-MS檢測(cè)

固相微萃取條件：取15 g發(fā)酵果渣，置于25 mL固相微萃取儀采樣瓶中，插入裝有2 cm-50/30μm DVB/CAR/PDMS StableFlex纖維頭的手動(dòng)進(jìn)樣器，在85℃左右頂空萃取30 min取出，快速移出萃取頭并立即插入氣相色譜儀進(jìn)樣口（溫度250℃）中，熱解吸3 min進(jìn)樣。

GC條件：色譜柱為ZB-5MSI彈性石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25μm），柱溫42℃（保留2 min），以4℃/min升溫至280℃，保持2 min；汽化室溫度250℃；載氣為高純氦氣（He）（純度99.999%）；柱前壓7.62 psi，載氣流量1.0 mL/min；不分流進(jìn)樣；溶劑延遲時(shí)間：1.5 min。

MS條件：離子源為電子電離（electronic ionization，EI）源；離子源溫度230℃；四極桿溫度150℃；電子能量70 eV；發(fā)射電流34.6μA；倍增器電壓1 425 V；接口溫度280℃；質(zhì)量范圍20～450 amu。

定性定量分析：對(duì)總離子流圖中各峰經(jīng)質(zhì)譜計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)系統(tǒng)檢索、人工解析圖譜及與美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究所（National Institute of Standards and Technology，NIST）2008和Wiley275質(zhì)譜庫(kù)匹配，確認(rèn)香氣成分的各化學(xué)組成，只有當(dāng)正反匹配度均＞800（最大值1 000）的鑒定結(jié)果才予以確認(rèn)，用峰面積歸一化法確定各化學(xué)成分的相對(duì)含量。

1.3.4 刺梨果渣香氣感官評(píng)定

感官評(píng)分采用9點(diǎn)標(biāo)度法[15]。由10位經(jīng)過一定訓(xùn)練的評(píng)價(jià)人員（相關(guān)專業(yè)的老師和學(xué)生共10名）組成的評(píng)分小組按感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)不同菌種發(fā)酵刺梨果渣香氣進(jìn)行加權(quán)評(píng)分，將其平均分作為最終得分，權(quán)重及感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 發(fā)酵刺梨果渣感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory evaluation standards of fermented Rosa roxburghii pomace

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

采用IBM SPSS Statistics 23.0對(duì)刺梨果渣揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行PCA和CA分析，Excel2016制作模型得分圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同菌種發(fā)酵的刺梨果渣香氣成分種類及相對(duì)含量

采用HS-SPME-GC-MS技術(shù)對(duì)刺梨果渣的香氣成分進(jìn)行檢測(cè)，得到不同菌種發(fā)酵的刺梨果渣香氣成分種類以及相對(duì)含量，結(jié)果分別見表2、表3。

表2 不同菌種發(fā)酵刺梨果渣的GC-MS分析結(jié)果Table 2 Analysis results of Rosa roxburghii pomace fermented by different strains by GC-MS

續(xù)表

續(xù)表

表3 不同菌種發(fā)酵刺梨果渣香氣成分種類及相對(duì)含量Table 3 Species and relative contents of aroma components of Rosa roxb urghii pomace fermented by different strains

由表2和表3可知，刺梨原果渣與不同菌種發(fā)酵的果渣共檢測(cè)鑒別出110種香氣成分，其中對(duì)照組原果渣檢出79種，GIM.1.67、酵母菌、CICC.22210、GIM.1.208組分別檢出56種、62種、55種、65種。共同檢出的風(fēng)味物質(zhì)為烴類、醇類、酯類、酸類、醛類、酮類和其他等7類化合物。其中5種果渣中烴類物質(zhì)數(shù)量及含量明顯高于其他種類物質(zhì)，相對(duì)含量為49.184%～58.036%。烴類一般香氣閾值較高，除了可延長(zhǎng)發(fā)酵果渣香氣留香時(shí)間外，香氣直接貢獻(xiàn)不大[16-18]。醇類物質(zhì)是微生物通過氨基酸代謝產(chǎn)生[19]，主要呈現(xiàn)清香和青鮮香氣[20]，是刺梨果渣香氣成分的重要組成部分，相對(duì)含量為3.494%～12.598%。GIM.1.67與CICC.22210發(fā)酵果渣后都產(chǎn)生了新成分橙花醇，呈玫瑰花香；異戊醇是酵母發(fā)酵的產(chǎn)物，賦予果渣愉快的果香和花香[21]；苯乙醇也為酵母發(fā)酵的特有產(chǎn)物[22]，其本身具有花香、甜、清香和玫瑰香氣，除本身愉快的風(fēng)味外，還可作為其他易揮發(fā)風(fēng)味物質(zhì)的溶劑[23]，對(duì)發(fā)酵果渣的風(fēng)味具有雙重影響功能。酯類物質(zhì)相對(duì)含量為0.226%～11.285%，酵母菌組酯類物質(zhì)的種類與含量相對(duì)更加豐富，可能因?yàn)樵撋憬湍妇l(fā)酵具有很強(qiáng)的產(chǎn)香能力，尤以產(chǎn)酯香為主的香味物質(zhì)最多[24]。酯類物質(zhì)大多具有不同水果香氣[25-27]，閾值一般較低，是刺梨果渣整體香氣形成的重要組成部分。酸類物質(zhì)的相對(duì)含量為2.511%～22.152%，對(duì)照組及處理組發(fā)酵后均檢出辛酸，可以作為酯類物質(zhì)的前體物質(zhì)[23]，對(duì)果渣風(fēng)味起到間接作用。GIM.1.208和CICC.22210組酸類相對(duì)含量較高，酸澀氣味強(qiáng)烈，可能與其較高含量的揮發(fā)性脂肪酸類物質(zhì)辛酸有關(guān)[28]。醛酮類物質(zhì)也是刺梨及發(fā)酵產(chǎn)物特征香氣的重要揮發(fā)性成分[29]，高濃度的醛類物質(zhì)會(huì)帶來異味[30]，且醛類物質(zhì)不穩(wěn)定，在微生物作用下被還原為醇或被氧化為酸[31]，可能是發(fā)酵后的刺梨果渣較原果渣相比，醛類相對(duì)含量減少，醇類、酸類相對(duì)含量增多的原因之一。

從整體上看，不同樣品的香氣成分構(gòu)成及含量差異較大，表明不同處理組之間風(fēng)味特征及風(fēng)味品質(zhì)具有差異性，進(jìn)而采用PCA和CA的方法對(duì)刺梨果渣進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)與品質(zhì)區(qū)分，便于對(duì)后期菌種的篩選與相關(guān)果渣產(chǎn)品的加工生產(chǎn)的指導(dǎo)。

2.2 不同菌種發(fā)酵刺梨果渣香氣成分主成分分析

2.2.1 主成分分析結(jié)果

將表3數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化，以各樣品組檢測(cè)出的香氣成分種類的相對(duì)含量矩陣為指標(biāo)，用SPSS進(jìn)行主成分分析，得到主成分特征根及特征向量，以風(fēng)味物質(zhì)貢獻(xiàn)率97%以上為標(biāo)準(zhǔn)，確定主成分個(gè)數(shù)及每個(gè)主成分所反映的因子，結(jié)果見表4和表5。

表4 提取3個(gè)主成分的特征值以及方差貢獻(xiàn)率Table 4 Eigenvalues and variance contribution rates of extracted three principal components

由表4可知，取特征值＞1的成分為主成分，得到3個(gè)主成分，且這3個(gè)主成分的方差累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到97.367%，表示能夠解釋刺梨果渣香氣大部分的成分信息，因此，選擇這3個(gè)主成分進(jìn)行風(fēng)味品質(zhì)分析。

表5 主成分的特征向量與載荷矩陣Table 5 Eigenvector and loading matrix of principal components

圖1 不同菌種發(fā)酵刺梨果渣香氣成分主成分分析載荷圖Fig.1 Principal component analysis load diagram of aroma components of Rosa roxburghii pomace fermented by different strains

由表4、表5結(jié)合圖1可以看出，第1主成分的方差貢獻(xiàn)率為44.073%，主要反映醇類、酯類這2種香氣成分的變異信息，且第1主成分與兩者呈正相關(guān)；第2主成分的方差貢獻(xiàn)率為33.679%，主要反映酸類、醛類這2種香氣成分的變異信息，與酸類呈負(fù)相關(guān)，與醛類呈正相關(guān)；第3主成分的方差貢獻(xiàn)率為17.615%，主要反映烴類、酮類的變異信息，與烴類呈負(fù)相關(guān)，與酮類呈正相關(guān)。由于PC1能夠概括大部分香氣成分信息，影響其化合物可作為主要風(fēng)味化合物。因此，醇類和酯類是不同菌種發(fā)酵刺梨果渣的香氣差異化的的主要影響因素。

2.2.2 基于主成分分析建立香氣品質(zhì)評(píng)價(jià)模型

根據(jù)表4和表5，以3個(gè)主成分代表原來7種風(fēng)味成分所表達(dá)的信息，建立不同樣品風(fēng)味品質(zhì)的評(píng)價(jià)模型，得出以下刺梨果渣風(fēng)味成分的線性關(guān)系式，式中X1～X7為不同物質(zhì)種類相對(duì)含量標(biāo)準(zhǔn)化后的值，Y1、Y2和Y3表示3個(gè)主成分的得分分值，分值越大，表示果渣風(fēng)味品質(zhì)越好。

將表5的特征向量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，與所對(duì)應(yīng)的3個(gè)主成分旋轉(zhuǎn)之前的方差貢獻(xiàn)率做內(nèi)積，得到綜合風(fēng)味品質(zhì)的評(píng)價(jià)函數(shù)Y的表達(dá)式為Y=0.440 73Y1+0.336 79Y2+0.176 15Y3，得到的風(fēng)味評(píng)價(jià)綜合得分值及排序見表6。

表6 標(biāo)準(zhǔn)化后主成分綜合得分Table 6 Comprehensive score of principal components after standardization

由表6可知，第1主成分得分最高的為酵母菌組，其次為GIM.1.67組，第2主成分得分最高的為GIM.1.67組，第3主成分得分最高的為對(duì)照原果渣組。綜合評(píng)價(jià)，菌株GIM.1.67發(fā)酵的刺梨果渣得分最高，為0.933分，其次為酵母菌組、原果渣組、CICC.22210組、GIM.1.208組。

2.3 不同菌種發(fā)酵刺梨果渣香氣成分聚類分析

采用聚類分析以評(píng)估各樣品香氣成分的變化，具有最大相似度的樣品被優(yōu)先聚類，通過SPSS23.0軟件，以類間平均距離法為測(cè)量方法，以Euclidean距離作為度量標(biāo)準(zhǔn)，將5種刺梨果渣樣品的香氣成分聚類成樹狀圖見圖2。

圖2 聚類分析樹狀圖Fig.2 Dendrogram for cluster analysis

由圖2可知，當(dāng)Euclidean距離等于5時(shí)，CICC.22210組與GIM.1208組被聚為一類，說明這2種菌種發(fā)酵刺梨果渣后整體風(fēng)味輪廓相似。當(dāng)Euclidean距離增加到25時(shí)，GIM.1.67組才與其他組樣品聚為一類，說明GIM.1.67組與其他樣品之間相似度較低，整體風(fēng)味輪廓不同。刺梨原果渣與發(fā)酵之后的果渣風(fēng)味輪廓具有差異性，表明了經(jīng)過不同菌種發(fā)酵后，刺梨果渣風(fēng)味改變顯著，CA結(jié)果與PCA結(jié)果相一致。

2.4 不同菌種發(fā)酵刺梨果渣感官評(píng)價(jià)分析

通過感官評(píng)價(jià)可以進(jìn)一步驗(yàn)證與所建立的香氣模型是否具有一致性[32]。本實(shí)驗(yàn)按感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)（見表1）對(duì)不同菌種發(fā)酵刺梨果渣香氣進(jìn)行加權(quán)評(píng)分，將其平均分作為最終得分，與模型評(píng)價(jià)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，感官評(píng)價(jià)結(jié)果見表7。

表7 不同菌種發(fā)酵刺梨果渣香氣感官評(píng)價(jià)結(jié)果Table 7 Sensory evaluation results of aroma in Rosa roxburghii pomace fermented by different strains

由表7可知，感官評(píng)分由大到小依次為GIM.1.67組、酵母菌組、原果渣組、CICC.22210組、GIM.1.208組，通過GIM.1.67發(fā)酵后刺梨果渣被賦予了濃厚的發(fā)酵香氣，且刺梨香濃郁，獲得了比原果渣更加協(xié)調(diào)的香氣。通過對(duì)比所建立的香氣品質(zhì)評(píng)價(jià)模型得分，兩者具有較好的一致性。由此可見，基于主成分分析法初步構(gòu)建的香氣品質(zhì)綜合評(píng)價(jià)模型具有可靠性及適用性。

3 結(jié)論

采用HS-SPME-GC-MS鑒別不同菌種發(fā)酵刺梨果渣的香氣成分。刺梨原果渣與4種不同菌種發(fā)酵的果渣總共檢測(cè)鑒別出110種香氣成分，包括烴類、醇類、酯類、酸類、醛類、酮類和其他類化合物。其中刺梨原果渣檢出79種，GIM.1.67、酵母菌、CICC.22210、GIM.1.208發(fā)酵后分別檢出56種、62種、55種、65種。通過主成分分析，醇類和酯類是影響不同菌種發(fā)酵刺梨果渣的香氣的主要因素。利用主成分分析建立風(fēng)味品質(zhì)綜合評(píng)價(jià)模型，可以計(jì)算出GIM.1.67發(fā)酵的刺梨果渣得分最高，為0.933分，其次為酵母菌發(fā)酵、原果渣、CICC.22210發(fā)酵、GIM.1.208發(fā)酵。通過感官法評(píng)價(jià)驗(yàn)證，對(duì)比所建立的香氣品質(zhì)評(píng)價(jià)模型得分，兩者具有較好的一致性。通過聚類分析，當(dāng)Euclidean距離等于5時(shí)，CICC.22210發(fā)酵與GIM.1208發(fā)酵被聚為一類，說明2種菌種發(fā)酵刺梨果渣后整體風(fēng)味輪廓相似。刺梨原果渣與發(fā)酵之后的果渣風(fēng)味輪廓具有一定差異性，表明了經(jīng)過不同菌種發(fā)酵后，刺梨果渣風(fēng)味改變顯著。由此可見主成分分析法與聚類分析法能較好地反映刺梨果渣樣品的差異性。