離子液體超聲輔助提取黑豆皮花青素及其抗氧化活性研究

蘇 適，趙東江，柴寶麗，遲彩霞

（綏化學(xué)院 食品與制藥工程學(xué)院，黑龍江 綏化 152061）

黑豆為豆科植物大豆的干燥種子，味甘性平，含有不飽和脂肪酸、蛋白質(zhì)、碳水化合物、纖維素、花青素、硒、磷、鐵多種微量元素和營養(yǎng)成分[1]。此外，黑豆還含有多種具有生理功效的物質(zhì)，如黑豆紅色素、多糖和皂苷等。其中花青素是黑豆色素的重要成分，具有較強的抗氧化能力，對機體代謝過程中產(chǎn)生多余的自由基，并且對增加血管彈性、延緩機體衰老等都有一定的作用[2-3]。黑豆比黃豆有更高的醫(yī)藥價值和開發(fā)前景，花青素屬于類黃酮類的化合物，黑豆皮色素含量高，是一種天然、安全、健康的食用色素。

目前，采用浸提法提取花青素的應(yīng)用較多，但此法溶劑用量大，耗時長，且花青素得率較低[4]。超聲提取法在中草藥提取中應(yīng)用較多，利用超聲波的空化效應(yīng)和機械效應(yīng)，破壞植物組織細胞[5-7]，加強成分的溶出和擴散，將植物中的化學(xué)成分快速提取，提高產(chǎn)物的得率，具有操作簡單方便，耗時短，不破壞有效成分、提取液雜質(zhì)少等特點。離子液體（ionic liquid）是在室溫條件下完全由離子組成的液體物質(zhì)[8-12]。離子液體能夠吸收超聲波，可用于超聲輔助提取的天然產(chǎn)物的溶劑，具有理化性質(zhì)穩(wěn)定、不易燃燒、提取過程萃取能力好、可重復(fù)利用，在黏度、極性、密度、蒸氣壓等方面具有和傳統(tǒng)溶劑不同的特殊性質(zhì)[13-16]，同時可以通過超聲或升高溫度等方法提高有效成分的得率，保持其高溶解性和萃取能力[17-18]。本文以黑豆皮為原材料提取花青素，通過響應(yīng)面法得出最佳的提取工藝，同時研究花青素的抗氧化活性，為深入研究其應(yīng)用價值提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青仁黑豆：黑龍江省市售。

原花青素標(biāo)準品：中國藥品生物制品檢定所；1-己基-3-甲基咪唑溴鹽（純度99%）：阿爾法試劑有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

VGT-2013QT超聲波清洗器：廣州固特超聲儀器有限公司；XV-9200紫外分光光度計：北京市精密儀器廠；DFYX500高速萬能粉碎機：北京科偉永興儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 黑豆皮花青素的提取

黑豆輕微粉碎→人工剝離豆皮→豆皮粉碎→60℃烘干至質(zhì)量恒定→過60目篩→稱質(zhì)量→超聲波提取→提取液離心（離心30 min，轉(zhuǎn)速3 500 r/min）→花青素

提取劑為體積分數(shù)70%乙醇稀釋的1-己基-3-甲基咪唑溴鹽，超聲功率300 W，溫度40℃，提取時間40 min，料液比1∶35（g∶mL）。

1.3.2 花青素得率計算

移取1.0 mL提取液，置于25 mL容量瓶中，定容，在波長530 nm處測定吸光度值，采用香草醛-鹽酸法測定黑豆皮花青素的質(zhì)量濃度，計算花青素得率，其計算公式如下：

式中：Y為花青素得率，mg/g；C為花青素質(zhì)量濃度，mg/mL；V為定容體積，mL；n為稀釋倍數(shù)；M為黑豆皮質(zhì)量，g。

1.3.3 黑豆皮花青素提取工藝優(yōu)化單因素試驗

準確稱取黑豆皮1.0 g，采用離子液體-超聲輔助法提取黑豆花青素，考察離子液體1-己基-3-甲基咪唑溴鹽濃度（0.4 mol/L、0.6 mol/L、0.8 mol/L、1.0 mol/L、1.2 mol/L、1.4 mol/L）、提取時間（15 min、25 min、35 min、45 min、55 min、65 min）、料液比（1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70）、提取溫度（20 ℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃）對黑豆皮花青素得率的影響，以黑豆皮花青素得率為指標(biāo)，以確定響應(yīng)面設(shè)計的水平。

1.3.4 黑豆皮花青素提取工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗設(shè)計

根據(jù)單因素試驗，選取離子液體濃度（A）、提取時間（B）、液料比（C）、提取溫度（D）為考察因素，黑豆皮花青素得率（Y）為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken Design中心組合設(shè)計原理，優(yōu)化黑豆皮花青素提取工藝，因素與水平見表1。

表1 黑豆皮花青素提取條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗設(shè)計因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology for extraction conditions optimization of anthocyanin from black soybean peel

1.3.5 黑豆皮花青素抗氧化能力的測定

采用水楊酸法測定黑豆皮花青素對羥自由基清除能力，在比色管中依次先加入9 mmol/L FeSO4、9 mmol/L乙醇-水楊酸以及適量去離子水，最后加入8.8 mmol/L H2O2后搖勻，37℃水浴加熱15 min后取出，測其吸光度值A(chǔ)0。測定時，參比溶液為不加雙氧水的體系。按照式（1）計算OH·的清除率。以維生素C（vitamin C，VC）為陽性對照。

式中：A0為空白對照的吸光度值；Aa為分別加入花青素、VC的吸光度值；Ab為不加H2O2的吸光度值。

分別量取0.05mg/mL、0.10 mg/mL、0.15mg/mL、0.20mg/mL、0.25 mg/mL、0.30 mg/mL的黑豆皮花青素提取液和0.1 mol/mL DPPH·溶液各2 mL，置于10 mL比色管中混合，加入體積分數(shù)60%乙醇定容，避光室溫條件放置30 min，波長517 nm處測其吸光度值。以無水乙醇溶液代替樣品溶液作對照，按照式（2）計算DPPH·清除率。VC對DPPH·清除率的測定同上述操作。

式中：A m為對照品的吸光度值；A n為樣品的吸光度值。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑豆皮花青素提取工藝優(yōu)化單因素試驗結(jié)果分析

2.1.1 離子液體濃度對花青素得率的影響

由圖1可知，隨離子液體1-己基-3-甲基咪唑溴鹽濃度的增加，花青素的得率逐漸變大，當(dāng)1-己基-3-甲基咪唑溴鹽濃度為0.8 mol/L時，花青素得率達到最大值，但隨著離子液體濃度繼續(xù)增大，得率逐漸下降。原因可能是與提取溶劑的黏度相關(guān)，離子液體的濃度過高，提取液黏度也會增大，提取劑的擴散能力變差，難以滲到黑豆細胞的內(nèi)部，使得離子液體對黑豆花青素的溶出能力降低。因此，最佳離子液體濃度為0.8 mol/L。

圖1 離子液體濃度對花青素得率的影響Fig.1 Effect of ionic liquids concentration on anthocyanin yield

2.1.2 提取時間對花青素得率的影響

由圖2可知，隨提取時間的不斷延長，花青素得率呈現(xiàn)增長趨勢，提取時間為45 min時，得率達到最大值，但時間＞45 min之后，得率開始降低。隨著超聲時間繼續(xù)延長，通過超聲波空化作用和機械震動的持續(xù)作用，黑豆皮花青素向溶劑中逐漸溶出，得率逐漸升高；但是提取時間過長導(dǎo)致細胞組織中大量細胞破裂，增加了其他雜質(zhì)的溶出；同時，提取時間過長會破壞花青素的結(jié)構(gòu)，從而使得率下降。因此，最佳提取時間選擇45 min。

圖2 提取時間對花青素得率的影響Fig.2 Effect of extraction time on anthocyanin yield

2.1.3 料液比對花青素得率的影響

由圖3可知，隨著料液比的減小，花青素得率逐漸增大，料液比為1∶50（g∶mL）時，花青素得率達到最大值，但料液比＜1∶50（g∶mL）之前，花青素的得率開始下降。原因可能是黑豆皮的質(zhì)量一定，提取劑的料液比過大，離子液體有一定的黏度，不利于花青素在溶劑中擴散；隨著料液比的減小，原料在溶液中與提取液的接觸面積增大，有利于花青素的溶出；但大量溶劑會吸收一定的超聲波，降低了超聲波對細胞的破碎能力，導(dǎo)致細胞內(nèi)花青素溶出減少；還可能是1-己基-3-甲基咪唑溴鹽與花青素分子上的羥基之間存在氫鍵作用，隨著料液比的不斷減小，氫鍵作用逐漸增強，導(dǎo)致花青素的得率降低。因此，最佳料液比選擇1∶50（g∶mL）。

圖3 料液比對花青素得率的影響Fig.3 Effect of material-liquid ratio on anthocyanin yield

2.1.4 提取溫度對花青素得率的影響

由圖4可知，隨著提取溫度的升高，花青素得率逐漸增大，當(dāng)提取溫度為50℃時，得率最大，但溫度繼續(xù)升高，花青素得率出現(xiàn)不斷降低的趨勢。原因可能是隨著體系的溫度升高，離子液體的運動速率和頻率也不斷變大，使其更容易滲透到黑豆皮組織細胞中，加速花青素的溶出，從而增加花青素的得率。但繼續(xù)升高體系的溫度，過高的溫度會使花青素結(jié)構(gòu)上的酚羥基發(fā)生氧化，導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)被破壞；也可能因為隨著溫度升高，細胞中其他內(nèi)容物溶出增多，導(dǎo)致溶液黏度增大，影響花青素向外溶出，從而使得率下降。所以，最佳提取溫度為50℃。

圖4 提取溫度對花青素得率的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on anthocyanin yield

2.2 黑豆皮花青素提取工藝優(yōu)化響應(yīng)面結(jié)果與分析

2.2.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果

表2 黑豆皮花青素提取條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of response surface methodology for extraction conditions optimization of anthocyanin from black soybean peel

2.2.2 響應(yīng)面試驗的建立與分析

表3 響應(yīng)面試驗結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of response surface methodology results

采用Design-Expert8.0.6軟件對表2數(shù)據(jù)分析，得到二次回歸擬合方程Y=4.21+0.084A+0.039B+0.080C-0.017D-0.025AB+2.750E-003AC-0.027AD-0.020BC+0.023BD-0.020CD-0.37A2-0.17B2-0.10C2-0.20D2。對回歸方程進行方差分析，結(jié)果見表3。

由表3可知，P＜0.000 1，說明數(shù)據(jù)模型方程達到極顯著水平；失擬值P=0.997 2＞0.05，無顯著差異，說明回歸方程與試驗擬合良好，誤差小。回歸方程各項方差分析表明，回歸模型一次項A、B、C對模型影響極顯著（P＜0.01），二次項A2、B2、C2和D2對模型影響極顯著（P＜0.01），其余各項對黑豆皮花青素得率影響均不顯著（P＞0.05）。因此，可用此模型對黑豆皮花青素提取工藝進行分析及預(yù)測。

2.2.3 響應(yīng)面分析

響應(yīng)曲面圖可以顯著反映各因素之間相互作用的強弱，采用Box-Behnken軟件對響應(yīng)曲面圖進行分析，可以得到各因素交互作用對響應(yīng)值的影響，結(jié)果如圖5所示。

如果響應(yīng)曲面較陡峭，說明該因素對花青素得率的影響較大，響應(yīng)值對于提取條件的改變就越敏感；如果響應(yīng)曲面相對平緩，說明該因素的波動對響應(yīng)值的影響較小。由圖5可知，離子液體濃度與提取溫度之間交互作用的響應(yīng)曲面最陡峭，對響應(yīng)值影響最顯著；離子液體濃度與提取時間之間交互作用的響應(yīng)曲面相對陡峭，說明對響應(yīng)值影響顯著程度次之；提取時間與提取溫度、料液比與提取溫度、提取時間與料液比、離子液體濃度與料液比的交互作用對得率的影響顯著程度逐漸減小，表現(xiàn)為曲線較為平滑，響應(yīng)值無顯著性變化。可知，影響黑豆皮花青素得率的各交互作用因素順序為AD＞AB＞BD＞CD＞BC＞AC。

圖5 各因素交互作用對花青素得率影響的響應(yīng)面和等高線Fig.5 Response surface plots and contour line of effects of interaction between each factor on anthocyanin yield

2.2.4 驗證試驗

結(jié)合單因素試驗，分析回歸模型，經(jīng)過驗證，最終得出黑豆皮花青素的最佳提取條件：離子液體濃度0.93 mol/L，提取時間45.39 min，料液比1∶53.97，提取溫度43.96 ℃，花青素得率的理論預(yù)計值為4.13 mg/g。結(jié)合試驗實際情況，最終選擇離子液體濃度0.9 mol/L，提取時間45 min，料液比1∶53（g∶mL），提取溫度43℃，進行5次平行試驗，得到花青素得率平均值為4.12 mg/g，與預(yù)測值接近，驗證了此模型的有效性，說明預(yù)測模型與實際情況擬合較好。

2.3 黑豆皮花青素的抗氧化活性分析

2.3.1 黑豆皮花青素對DPPH自由基的清除能力

VC和黑豆皮花青素對DPPH·的清除能力結(jié)果見圖6。由圖6可知，在一定范圍內(nèi)，隨著質(zhì)量濃度的增加黑豆皮花青素和VC對DPPH·清除率均逐漸增強，說明二者對DPPH·的清除能力均存在著一定的量效關(guān)系。結(jié)果表明，花青素在150～350μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)對DPPH·有較強的清除能力。

圖6 黑豆皮花青素對DPPH·的清除作用Fig.6 DPPH·scavenging ability of anthocyanin from black soybean peel

2.3.2 黑豆皮花青素對OH·的清除能力

VC和黑豆皮花青素對OH·的清除能力結(jié)果見圖7。由圖7可見，花青素對OH·有一定的清除能力，且隨著花青素質(zhì)量濃度的增大，其清除能力也不斷增強。花青素在試驗的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)對羥自由基的清除能力要高于VC。

圖7 黑豆皮花青素對OH·清除作用Fig.7 OH·scavenging ability of anthocyanin from black soybean peel

3 結(jié)論

本研究采用離子液體-超聲輔助提取法，對黑豆皮花青素的提取工藝進行了研究。根據(jù)響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝，得到最佳工藝條件為：離子液體濃度為0.9 mol/L、料液比1∶53（g∶mL）、提取溫度43 ℃、超聲時間 45 min，進行5次平行試驗；在此條件下黑豆皮花青素的得率可達4.12 mg/g。

黑豆皮花青素抗氧化性能結(jié)果表明，花青素具有較強的抗氧化活性，在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，隨樣品質(zhì)量濃度的增加，其抗氧化性能也不斷提高；其清除羥自由基的能力高于VC，當(dāng)質(zhì)量濃度＞150mg/mL之后，對DPPH·清除率高于VC。