結直腸癌HOXA11基因啟動子甲基化狀態的研究

潘烽平 陳一鵬 李彥 張明明

結直腸癌是全球范圍內高發病率和高死亡率的惡性腫瘤之一[1-2]。研究發現，DNA甲基化在結直腸癌發病機制中具有十分重要的作用，其中抑癌基因甲基化是近年來腫瘤表觀遺傳研究的熱點[3]。HOXA11是一個受表觀遺傳調控而表達丟失的基因，異常甲基化導致HOXA11基因表達下調，影響腫瘤的發生、發展及預后。研究證實，在卵巢癌中HOXA11基因啟動子CpG島異常甲基化是其不良預后的一個獨立危險因素[4]。在惡性膠質瘤中，HOXA11的異常低表達與放化療抵抗密切相關并且影響患者的生存預后[5]。然而，HOXA11在結直腸癌中是否存在異常甲基化，HOXA11的異常甲基化是否參與調控腫瘤細胞的生物學行為目前尚未見于研究報道。本研究以結直腸癌為研究對象，探討HOXA11在結直腸癌中的表達水平以及甲基化程度，以及HOXA11啟動子區異常甲基化與患者臨床病理特征間的相關性。

1 材料和方法

1.1 組織標本 89對結直腸癌組織及配對的正常腸黏膜組織標本取自于2016年8月至2018年10月在嘉興市第一醫院（55例）和浙江大學醫學院附屬第一醫院普外科（34例）接受結直腸癌根治術的患者。所有患者術前均未接受放化療，結直腸癌組織及配對的正常腸黏膜組織均經過病理學檢查證實。此外，組織標本的使用均獲得患者本人或其家屬的同意，并簽署書面同意書。

1.2 細胞培養 本研究選用的6種結直腸癌細胞系（HT29、SW480、HCT116、SW620、LoVo 和 SW1116）均購予上?？茖W院細胞庫。細胞采用含有10%FBS的RPMI1640培養液，置于37℃、5%CO2的細胞培養箱內培養。

1.3 主要試劑和儀器 CpGenome Universal DNA Modification kit、5-Aza-dC均購于美國Sigma-aldrich公司（批號：S7822、A3656）；Trizol試劑購于美國 Invitrogen公司（批號：15596018）；反轉錄試劑盒為日本TaKaRa公司產品（批號：RR047A）；SYBR Green PCR Master Mix試劑盒購于日本Toyobo公司（批號：QPK-201）。ABI 7900測序儀購于美國ABI公司。

1.4 甲基化特異性聚合酶鏈反應（methylation-specific PCR，MSP）檢測 HOXA11甲基化狀態采用酚-氯仿法抽提100mg結直腸癌和配對正常腸黏膜組織標本中的DNA，并以 CpGenome Universal DNA Modification kit試劑盒修飾DNA。甲基化引物（HOXA11-M）和非甲基化引物（HOXA11-U）分別用于擴增HOXA11基因5'CpG島甲基化和非甲基化的等位基因，引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。HOXA11-U引物序列為：5′-TGTGTGTGAAGTGATTTTTAGAGAGTAT-3′（正 義鏈），5′-AACAATCTCTATACACAAACTCCTCCA-3′（反義鏈）；HOXA11-M 引物序列為：5′-TGCGCGAAGTGATTTTTAGAGAGTAC-3′（正 義 鏈），5′-CAATCTCTATACACGAACTCCTCCG-3′（反義鏈）。MSP反應條件如下：95℃預變性 5min，95℃變性 30s，63℃退火 30s，72℃延伸 45s，共 35個循環，最后 72℃延伸 5min，4℃終止反應。最后將反應產物行2%瓊脂糖凝膠電泳，電泳凝膠呈像系統照相并分析結果。

1.5 實時熒光定量PCR（quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測 HOXA11 mRNA表達水平將6種結直腸癌細胞系細胞置于5-Aza-dC終濃度為20μmol/L的培養液中培養96h，行去甲基化處理。處理前后分別收集細胞，采用Trizol試劑抽提各組細胞和正常腸黏膜組織中的總RNA，按照反轉錄試劑盒說明書操作流程反轉錄合成cDNA。引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，HOXA11上游引物：5'-GCAGCAGAGGAGAAAGAGGG-3′，下游引物：5'-GTGGATTTGCTGAGTAGTACTG；GAPDH 上游引物：5''-CCCATCACCATCTTCCAGGAG-3′，下游引物：5'-CTTCTCCATGGTGGTGAAGACG-3′。采用 ABI 7900測序儀進行qRT-PCR，反應條件如下：95℃預變性1min，95℃反應 10s，59℃反應 30s，共 50 個循環。每組設置3個復孔，獨立重復3次，獲得CT值。ΔCT為同一標本目的基因（HOXA11）與內參基因（GAPDH）CT值之差，即 ΔCT=CT（HOXA11）－CT（GAPDH），ΔΔCT=ΔCT（各組結直腸癌細胞）-ΔCT（正常腸黏膜組織）的差值，HOXA11 的相對表達量以 2－ΔΔCT表示。

1.6 統計學處理 采用SPSS 25.0統計軟件。計量資料以表示，兩組間比較采用t檢驗；組間頻數比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HOXA11在結直腸癌中呈異常甲基化狀態 采用MSP技術檢測結直腸癌和配對正常腸黏膜組織中HOXA11基因啟動子CpG島的甲基化情況，擴增結果見圖1。89例結直腸癌患者中共67例癌組織標本存在甲基化（75.3%），而正常腸黏膜組織中僅14例存在甲基化（15.7%）。上述實驗結果表明，結直腸癌組織中HOXA11基因甲基化率顯著高于正常腸黏膜組織（P＜0.01）。

圖1 MSP檢測結直腸癌組織及配對正常腸黏膜組織中HOXA11啟動子甲基化狀態（T：結直腸癌組織；N：正常腸黏膜組織；M：甲基化；U：非甲基化）

2.2 HOXA11基因啟動子甲基化狀態與其mRNA表達量的關系 發生甲基化的結直腸癌組織中HOXA11 mRNA的相對表達量明顯低于較未發生甲基化的結直腸癌組織（P＜0.01），見圖 2。

2.3 HOXA11基因啟動子甲基化與結直腸癌患者臨床病理特征的關系 結直腸癌組織中HOXA11基因啟動子的甲基化狀態與淋巴結轉移（P＜0.01）及TMN分期（P＜0.01）密切相關，而與患者的年齡、性別、組織分化、浸潤深度無關（均P＞0.05），見表1。

圖2 結直腸癌組織中HOXA11甲基化狀態與其mRNA表達水平的關系（**P＜0.01）

表1 HOXA11基因啟動子甲基化與結直腸癌患者臨床病理特征的關系

2.4 結直腸癌細胞系HOXA11基因啟動子甲基化情況MSP結果顯示，所有結直腸癌細胞系中HOXA11啟動子均呈高甲基化狀態。使用20μmol/L甲基化轉移酶抑制劑5-Aza-dC處理細胞96h后，HOXA11 mRNA相對表達量均較無5-Aza-dC處理組顯著升高（P＜0.05），見圖3。

3 討論

圖3 5-Aza-dC處理結直腸癌細胞系后HOXA11 mRNA表達水平（*P＜0.05，**P＜0.01）

腫瘤的發生和發展是在多種致癌因素作用下，多基因參與、多步驟發生的過程，主要涉及癌基因的激活和抑癌基因的失活。DNA甲基化異常，特別是癌基因的低甲基化和抑癌基因的高甲基化，是腫瘤發生的重要機制之一[6]，其中抑癌基因通常由于過度甲基化，導致表觀遺傳學改變，從而抑制基因的轉錄和蛋白表達，參與惡性腫瘤的進展[7]。結直腸癌中廣泛存在抑癌基因異常甲基化，目前研究認為，部分腫瘤相關基因甲基化是結直腸癌早期診斷及靶向治療的生物標志[8]。因此，深入研究結直腸癌中的DNA甲基化對于腫瘤診斷和治療具有至關重要的意義。

同源框基因（homeobox genes，HOX）主要包括 A、B、C、D四個基因簇，是一類在進化上高度保守的基因，主要參與調控胚胎發育和細胞分化。近期研究表明，HOX基因表達異常與多種惡性腫瘤的發生發展密切相關[9-10]。HOXA11是HOX基因家族中的一員，位于染色體7p。最新研究結果表明，卵巢癌[4]、膠質瘤[11]、乳腺癌[12]、腎癌[13]、肺癌[14-15]和胃癌[16-17]普遍存在HOXA11異常甲基化，抑制HOXA11基因的表達，促進腫瘤的發展。

為闡明HOXA11在結直腸癌組織中的甲基化水平及其與患者臨床病理特征間的關系，本研究采用MSP法對結直腸癌組織及配對正常腸黏膜組織中HOXA11基因甲基化狀態進行檢測。結果表明，與正常腸黏膜比較，HOXA11基因在結直腸癌組織中普遍存在異常甲基化。除此之外，結直腸癌組織中異常甲基化與淋巴結轉移及TNM分期密切相關。進一步研究發現，發生甲基化的結直腸癌組織中HOXA11 mRNA表達水平顯著低于未甲基化的結直腸癌組織。基因的異常甲基化會導致基因的表達沉默，筆者推測，HOXA11基因異常甲基化可能是導致HOXA11基因低表達的重要原因之一。為進一步驗證推測，體外實驗中使用了甲基化轉移酶抑制劑5-Aza-dC，降低細胞的甲基化水平，結果提示5-AzadC作用后，6種HOXA11異常甲基化的結直腸癌細胞系中HOXA11 mRNA的表達水平顯著增高，與推測一致。由此可以得出，結直腸癌組織中HOXA11基因異常甲基化抑制了HOXA11基因的轉錄和表達，促進腫瘤的發展。

綜上所述，本研究發現結直腸癌組織中HOXA11基因普遍存在異常甲基化，抑制其轉錄表達。結直腸癌中HOXA11基因啟動子區異常甲基化是淋巴結轉移及TNM分期的危險性因素。通過本研究，筆者預測HOXA11基因甲基化檢測可能是結直腸癌早期篩查及精準治療的潛在生物標志物。