不同劑量多奈哌齊對APP/PS1-AD轉基因小鼠學習記憶功能的改善作用

張慧敏 朱文烽 龐曉平 周鵬 陳方亮

阿爾茨海默病（AD）是一種慢性神經退行性疾病，是造成老年人癡呆最主要的原因[1]。根據2014年的報道，全球大約有4千多萬AD患者，預計到2050年，患者將增加至3倍[2]。AD的發生為患者及其家庭造成沉重的精神和經濟負擔，因此AD的預防和治療成為當下急需解決的醫療和社會問題。各國癡呆診療指南均推薦膽堿酯酶抑制劑作為一線治療藥物，而膽堿酯酶抑制劑也在臨床中使用最為廣泛，代表性藥物為多奈哌齊[3-4]。APP/PS1-AD轉基因小鼠是目前最常用來評價AD治療藥物藥效以及考察藥物作用機制的動物模型。因此本研究選用APP/PS1-AD轉基因小鼠，評價不同劑量多奈哌齊對該模型小鼠學習記憶功能的改善作用，為進一步研發新藥提供參考。

1 對象和方法

1.1 實驗動物 雄性9月齡APP/PS1-AD轉基因小鼠80只、同齡野生型小鼠20只均購自南京大學模式動物研究所（合格證號：0022834，201400204），并于 SPF 級動物房飼養，光照時間為 8:00～20:00，室溫 20～26℃，濕度40%～70%。飼養期間小鼠自由進食和飲水，手術前后單獨飼養。飼料購于中國軍事醫學科學院實驗動物中心[生產許可證號：SCXK-（軍）2002-001]。

1.2 儀器及試劑 Morris水迷宮（安徽正華生物儀器設備有限公司）；跳臺（BW-YLS-3TB，上海軟隆科技發展有限公司）；水浴鍋（HH.S，上海博迅醫療生物儀器股份有限公司）；培養箱（XT5107，杭州雪中炭恒溫技術有限公司）；光度計（Ultrospec 6300pro，通用電氣醫療集團生命科學部）；顯微鏡（NIB900-FL，Nexcope）；多奈哌齊（日本衛才制藥公司，規格：5mg/片，批號：140355A），其溶液以蒸餾水為溶媒，現用現配，配制終濃度分別為0.1、0.3、0.6mg/ml，按小鼠每 10g體重 0.1ml劑量給藥。

1.3 方法

1.3.1 動物分組和給藥 小鼠進入實驗房適應1周后，將APP/PS1-AD轉基因小鼠隨機分為轉基因小鼠對照組、轉基因小鼠多奈哌齊1mg/kg組、轉基因小鼠多奈哌齊3mg/kg組和轉基因小鼠多奈哌齊6mg/kg組，每組20只，并以20只野生型基因小鼠作為野生型對照組。各組小鼠灌胃給藥1次/d（野生型小鼠對照組、轉基因小鼠對照組予等量蒸餾水），每周連續給藥5d，12周后進行Morris水迷宮和跳臺實驗。在水迷宮和跳臺實驗前1h繼續給予實驗藥物，直至實驗結束。實驗期間每天觀察并記錄小鼠的一般狀態和飲食情況，實驗開始前以及實驗開始后每隔2周稱體重并記錄。

1.3.2 Morris水迷宮實驗 Morris水迷宮由一金屬圓柱形水池和自動顯示、記錄裝置，以及安全島（平臺）組成。水池分為4個象限（東、南、西、北），平臺放置于第二象限的中心。水溫保持在（24±2）℃，水中加入牛奶，使水不透明，平臺位于水面以下1.0cm。每只小鼠每天接受2次訓練，每次分別從兩個不同的入水點開始，2次訓練間隔4h，記錄潛伏期（找到平臺的時間）。如果小鼠在60s內未找到平臺，則潛伏期以60s計算。無論在60s內找到平臺與否，均讓小鼠在平臺上停留30s。連續訓練6d，最后1d訓練24h后進行探索實驗，移去平臺，小鼠自由游泳60s尋找平臺，記錄小鼠第一次穿過平臺所在位置的時間和穿越平臺的次數。

1.3.3 跳臺實驗 小鼠跳臺裝置為1個長方形反射箱，大小為10cm×10cm×30cm，用黑色塑料板分隔成為5間。底面為不銹鋼網柵，網柵間距為0.5cm。每間左后角放置一高3.2cm、直徑4.5cm的橡膠站臺。小鼠位于站臺上可免受電擊，當小鼠跳下站臺時，則遭受到36伏電擊懲罰。本實驗連續進行3d，第1天為適應階段，將小鼠面向墻角輕輕放置于站臺上，首先讓動物適應環境5min，網柵不通電。第2天為學習階段，將小鼠面向墻角輕輕放置于站臺上，然后通以36伏交流電，持續3min。若動物跳下站臺則受電擊，其正常反應應該是跳回站臺以躲避傷害性刺激，多數動物可能會再次或多次跳至網柵上，受到電擊后又迅速跳回站臺。記錄每只小鼠受到電擊的次數（即錯誤次數）。第3天為實驗階段，即記憶保持實驗。將小鼠放置于站臺上，通電觀察，并記錄第一次跳下站臺的潛伏期和3min內的錯誤次數。

1.4 統計學處理 采用SPSS 13.0統計軟件。計量資料以表示。多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 多奈哌齊對APP/PS1-AD轉基因小鼠一般狀態的影響 給藥前后APP/PS1-AD轉基因小鼠活動良好，飲食正常。體重保持均勻，各組間無統計學差異（均P＞0.05），見表 1。

2.2 多奈哌齊對APP/PS1-AD轉基因小鼠學習記憶功能的影響

2.2.1 Morris水迷宮實驗 結果顯示，隨著訓練時間延長，各組小鼠尋找到隱蔽平臺的潛伏期均逐漸縮短，轉基因對照組小鼠與野生型小鼠比較，尋找到隱蔽平臺的潛伏期顯著延長（P＜0.05），提示轉基因小鼠有明顯的學習記憶功能缺失。而多奈哌齊不同劑量給藥組的潛伏期均逐漸縮短，但與轉基因對照組相比無統計學差異，見表2。

訓練階段結束后，進行平臺探索實驗。轉基因對照組小鼠第一次穿越原平臺所在位置的時間較野生型小鼠明顯延長（P＜0.05），而穿越平臺次數比野生型小鼠

表1 多奈哌齊對APP/PS1-AD轉基因小鼠體重的影響（g）

表2 多奈哌齊對APP/PS1-AD轉基因小鼠學習記憶功能（潛伏期）影響（s）

明顯減少（P＜0.01），提示APP/PS1-AD轉基因小鼠出現空間記憶功能的明顯損害。與轉基因小鼠對照組比較，無論是在穿越平臺時間還是在穿越次數上，多奈哌齊不同劑量給藥組均無明顯改善，見表3。

表3 多奈哌齊對APP/PS1-AD轉基因小鼠學習記憶功能（穿越平臺）影響

2.2.2 跳臺實驗 結果發現，野生型對照組與轉基因對照組小鼠的潛伏期無統計學差異。多奈哌齊不同劑量給藥組的潛伏期與野生型對照組與轉基因對照組相比較均無明顯改變（見表4）。野生型對照組的錯誤次數僅為0.6±0.2，而轉基因對照組小鼠的錯誤次數為2.6±1.6，與野生型小鼠對照組相比具有增加的趨勢，但未達到統計學差異（P＞0.05），提示轉基因小鼠有一定程度的記憶缺失。給予多奈哌齊后，小鼠的錯誤次數均有減低，但個體差異較大，不具有統計學意義。

表4 多奈哌齊對APP/PS1-AD轉基因小鼠學習記憶功能（跳臺實驗）影響

3 討論

AD是老年人中最常見的認知功能進行性下降的疾病，是發生在中樞神經的一種病因復雜的原發性神經退行性疾病[5]。由于AD的發病是多因素交叉引起，病理及生化的改變是多方面的，眾多的學者在研究過程中，形成了各自不同的假說，其中Aβ淀粉樣肽學說是目前大家對AD比較公認的發病機制[6]。而APP/PS1-AD轉基因小鼠模型是經典的AD轉基因動物模型之一，此模型可穩定表達人類突變基因APP和PS1，引起細胞外淀粉樣蛋白的沉積[7]，其優勢是將兩個易感基因結合在一起，從而縮短病理變化時間，并使病理特征多樣化，能夠較好的模擬AD患者早期病理和行為特征[8]以及AD患者膽堿能系統的改變。多奈哌齊是目前臨床使用較廣泛的抗AD藥物之一[9]，本研究考查多奈哌齊對APP/PS1-AD轉基因小鼠學習記憶改善作用。

在經典的學習記憶實驗-水迷宮實驗中，筆者發現APP/PS1-AD轉基因小鼠具有明顯的學習記憶缺失，但多奈哌齊對APP/PS1-AD轉基因小鼠學習記憶功能缺失無明顯改善作用，提示在此動物模型中多奈哌齊治療AD的作用沒有達到預期效果。

跳臺實驗是一種抑制性被動回避實驗，在記憶研究中，動物模型最重要的特點是抑制模仿活動或學習習慣。被動回避實驗通過動物學會去掉某種特定的行為而逃避某種厭惡的事情。跳臺實驗中，轉基因對照組小鼠第一次穿越原平臺的時間較野生型小鼠明顯延長（P＜0.05），而穿越平臺次數比野生型小鼠明顯減少（P＜0.01），長期給予多奈哌齊不同劑量給藥組均不能縮短轉基因小鼠第一次穿越平臺的時間；多奈哌齊不同劑量給藥組的跳臺潛伏期與兩對照組相比較均無明顯改變，但跳臺錯誤次數均有減低，且個體差異較大，不具有統計學意義。

綜上所述，經典行為學實驗表明，多奈哌齊并不能改善APP/PS1-AD轉基因小鼠的空間學習記憶能力。多奈哌齊主要通過增加AD患者腦內乙酰膽堿水平而發揮學習記憶改善作用，在東莨菪堿誘導的小鼠癡呆模型中，多奈哌齊顯示了良好的學習記憶改善作用[10]。但APP/PS1-AD轉基因小鼠的學習記憶缺失主要是由于APP和PS1基因突變引起的細胞外淀粉樣蛋白沉積引起，多奈哌齊可能并不能改善APP/PS1-AD轉基因小鼠腦內的Aβ淀粉樣斑塊沉積而發揮抗AD作用。但在跳臺實驗中，多奈哌齊不同劑量給藥組的跳臺潛伏期與兩對照組相比較雖沒有明顯改變，但跳臺錯誤次數均有減低，提示APP/PS1-AD轉基因小鼠可能也伴有膽堿能系統功能的紊亂，但并不是引起APP/PS1-AD轉基因小鼠AD的主要原因。

總之，本實驗結果提示多奈哌齊不能改善APP/PS1-AD轉基因小鼠學習記憶功能缺失。同時，本研究也提示了AD的發病是機制的復雜，至今并沒有哪一種假說能夠完全地解釋AD的發生、發展。